一种曲酸衍生物曲酮C制备方法及其应用

一种曲酸衍生物曲酮c制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及曲酸衍生物制备及应用技术领域，具体为一种曲酸衍生物曲酮c制备方法及其应用。


背景技术：

2.氧化褐变(browning)是鲜切水果、果汁、蔬菜及海产品等食品加工过程中常发生的腐败变质现象，由于氧化褐变，每年鲜切水果造成的损失约占其价值的一半，果汁和蔬菜等也损失巨大。氧化褐变有酶促褐变与非酶促褐变两种机制，酶促褐变是食品中的多酚在多酚氧化酶、过氧化物酶等酶作用下被氧化所致。人们常向易发生褐变的食物中添加适量酪氨酸酶抑制剂或者抗氧化剂，从而增加食物的货架寿命。但是化学抗褐变剂长期食用对人体有一定的危害。因此，研究开发天然、高效、安全的抗氧化剂或抗褐变剂，一直是食品及化工领域的研究的热点之一。
3.曲酸的化学名称为5-羟基-2-羟甲基-4-吡喃酮，它具有显著的酪氨酸酶抑制活性，是一种理想的新型食品抗氧化剂和工业原料。此外，它还可以抑制皮肤黑色素的产生，广泛应用于医药和化妆品领域。因此，寻找天然高效的抗褐变作用突出的曲酸衍生物，明确其抗褐变作用强弱和机制，提高此类化合物的食品添加剂应用价值，是本领域技术人员亟需解决的问题。
4.本发明从杂色曲霉中分离得到一种曲酸衍生物，研究表明该化合物具有较好的抗氧化和抗食品褐变活性，该化合物及其用途尚未见到相关报道。


技术实现要素：

5.(一)解决的技术问题
6.本发明正是基于上述技术问题至少之一，本发明提供了具有抗褐变作用的一种曲酸衍生物曲酮c制备方法及其应用，该化合物为抗褐变作用的食品添加剂开发提供了有效的前体化合物，也为下一步的应用奠定了物质基础。
7.(二)技术方案
8.为实现上述为抗褐变作用的食品添加剂开发提供了有效的前体化合物，为下一步的应用奠定了物质基础的目的，本发明提供如下技术方案：一种曲酸衍生物曲酮c的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)pda固体培养基的配制：100～300g新鲜土豆、500～1500ml自来水、12～24g琼脂，煮沸溶解后100～120℃高压灭菌10～50min，即可得到pda固体培养基。
10.(2)pdb液体培养基的配制：20g马铃薯、2g蔗糖、100ml自来水以及2g琼脂，再经配料、溶化、矫正ph、澄清过滤、分装以及100～120℃高压灭菌15～30min，即可得到pdb液体培养基。
11.(3)杂色曲霉菌活化：将杂色曲霉菌划线复活，并接种到步骤(1)中的pda固体培养基，在28℃的培养箱中活化5天；
12.(4)种子液的培养：用手术刀从步骤(3)中的pda培养基中切下菌落小块，接种到步骤(2)中的pdb液体培养基中，于28℃和160rpm的摇床上震荡培养5天，得到种子液；
13.(5)培养发酵：然后将步骤(4)中的种子液接种到大米固体培养基中，在28℃恒温恒湿箱中静置培养30天，得到大米发酵物；
14.(6)得到乙酸乙酯浸膏：取步骤(5)中得到的大米发酵物，每200g发酵物加乙酸乙酯400ml，冷浸提取2～3次，每次冷浸提取15～21小时，并经合并提取液，减压浓缩至无乙酸乙酯味，得到乙酸乙酯浸膏；
15.(7)粗分：将步骤(6)中得到乙酸乙酯浸膏进行正相柱色谱洗脱，后利用大孔树脂柱色谱法，经吸附过夜以及洗脱后，得到粗制曲酸衍生物，
16.(8)精细纯化：将步骤(7)中得到的粗制曲酸中目标亚组分利用高效液相色谱进行分离纯化，并经加热溶解后过滤，最后冷却得到曲酸衍生物纯品。
17.优选的，步骤(6)中所述乙酸乙酯提取试剂也可换成二氯甲烷或无水乙醇提取试剂。
18.优选的，步骤(7)中所述正相柱色谱洗脱中以200～300目硅胶做柱层析硅胶。
19.优选的，步骤(7)中所述大孔树脂柱色谱洗脱梯度为10％～100％甲醇-水。
20.优选的，步骤(8)中所述粗制曲酸加热溶解方法为：利用40％乙醇-水加热至80℃溶解后过滤，所述目标亚组分为50％～90％甲醇-水段。
21.优选的，步骤(8)中所述高效液相色谱洗脱液为甲醇与水体积比为55％～85％的甲醇-水，检测波长为210nm。
22.优选的，曲酸衍生物曲酮c在制备抗褐变作用的食品添加剂前体中应用。
23.优选的，曲酸衍生物曲酮c在制备抗酶促褐变作用的食品添加剂前体中应用。
24.优选的，曲酸衍生物曲酮c在制备防止由酪氨酸酶诱导而发生酶促褐变作用的食品添加剂前体中应用。
25.优选的，所述曲酸衍生物曲酮c对abts和dpph自由基清除的ec
50
分别为39.5
±
2.8μm和84.8
±
4.6μm，对酪氨酸酶抑制活性强于曲酸，ic
50
分别为10.8
±
1.9μm和8.9
±
1.5μm，在制备防止由酪氨酸酶诱导而发生酶促褐变作用的食品添加剂前体中应用。
26.(三)有益效果
27.与现有技术相比，本发明提供了一种曲酸衍生物曲酮c制备方法及其应用，具备以下有益效果：
28.1、该曲酸衍生物曲酮c制备方法及其应用，提出了一种新的三环结构曲酸衍生物曲酮c，后续的研究中发现曲酮c有明显的抗氧化活性，对abts和dpph自由基清除的ec
50
分别为39.5
±
2.8μm和84.8
±
4.6μm，曲酮c对酪氨酸酶抑制活性强于曲酸，ic
50
分别为10.8
±
1.9μm和8.9
±
1.5μm，10μm的曲酮c即具有明显的鲜切水果和果汁抗褐变作用。
29.2、该一种曲酸衍生物曲酮c制备方法及其应用，提出了一种新的三环结构曲酸衍生物曲酮c，曲酮c可为抗褐变作用的食品添加剂开发提供了有效的前体化合物，对于满足社会需求、降低生产成本、提高市场价值以及此类化合物的食品添加剂应用价值都有一定的促进作用，也对曲酸的进一步药效研究和药物开发以及下一步的应用奠定物质基础。
附图说明
30.图1为本发明曲酮c化合物的结构式；
31.图2为本发明曲酮c的关键hmbc信号；
32.图3为本发明曲酮c的高分辨质谱图；
33.图4为本发明曲酮c的1h-nmr图；
34.图5为本发明曲酮c的
13
c-nmr图；
35.图6为本发明曲酮c的hsqc图；
36.图7为本发明曲酮c的hmbc图；
37.图8为本发明曲酮c的roesy图；
38.图9为本发明实施例2中化合物的结构式；
39.图10为本发明实施例2中1h和
13
c核磁数据表格；
40.图11为本发明实施例3中实验数据表格；
41.图12为本发明实施例4中实验数据表格；
42.图13为本发明实施例5中实验数据表格；
43.图14为本发明实施例6中实验数据表格。
具体实施方式
44.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
45.实施例1菌种的发酵和提取
46.本发明提供技术方案：一种曲酸衍生物曲酮c制备方法，杂色曲霉(aspergillus versicolor)，购买于美国标准菌株保藏中心(atcc)，保藏号为atcc 28286。将该菌种划线复活，接种到pda固体培养基，28℃培养箱中活化5天。用手术刀从pda培养基中切下菌落小块，接种到pdb液体培养基中，于28℃和160rpm的摇床上震荡培养5天得到种子液。然后将种子液接种到大米固体培养基中，在28℃恒温恒湿箱中静置培养30天。取大米发酵物，每200g发酵物加乙酸乙酯400ml，冷浸提取2次，合并提取液减压浓缩至无乙酸乙酯味得到乙酸乙酯浸膏，乙酸乙酯提取试剂也可换成二氯甲烷或无水乙醇提取试剂。
47.实施例2曲酮c的分离和鉴定
48.本发明提供技术方案：一种曲酸衍生物曲酮c制备方法，将浸膏进行正相柱色谱洗脱，正相柱色谱洗脱中以200～300目硅胶做柱层析硅胶，后利用大孔树脂柱色谱法，吸附过夜，以10％、30％、50％、70％、90％、100％甲醇-水梯度洗脱，每个梯度合并旋干至无液体，得到6个亚组分。大孔树脂柱色谱洗脱梯度为10％～100％甲醇-水，将第4亚组分(70％部分)用半制备高效液相色谱进行分离纯化，高效液相色谱洗脱液为甲醇与水体积比为55％～85％的甲醇-水，检测波长为210nm，流动相：65％meoh，流速4.0ml/min，检测波长210nm，出峰时间30.5-31.9min。将该峰接出，并经加热溶解后过滤，最后冷却得到白色固体6.5mg。粗制曲酸加热溶解方法为：利用40％乙醇-水加热至80℃溶解后过滤，所述目标亚组分为50％～90％甲醇-水段，将该白色固体进行高分辨质谱和一维二维核磁分析结果如图2-8，
pbs)、空白对照组b(90μl pbs和30μl蘑菇酪氨酸酶)、样品背景对照组c(20μl样品和100μl pbs)和样品组d(20μl样品、70μl pbs和30μl蘑菇酪氨酸酶)，30℃恒温箱中孵育10min，后将各孔加入0.5mmol/l左旋多巴(l-dopa)100μl，继续孵育20min后，于475nm下测定吸光值。平行3次，按照公式(抑制率＝[(b-a)-(d-c)]/(b-a)
×
100％)计算酪氨酸酶的抑制率，并用spss软件计算ic
50
值。曲酮c对酪氨酸酶抑制活性强于曲酸，ic
50
为8.9
±
1.5μm，具体如说明书附图中图14表5所示。
[0057]
实施例7鲜切苹果抗褐变作用
[0058]
本发明提供技术方案：一种曲酸衍生物曲酮c的应用，选取新鲜、成熟度一致、大小均匀、色泽相近、无机械损伤、无病虫害侵染的红富士苹果。预冷后的苹果用次氯酸钠溶液杀菌清洗后，迅速用无菌水冲洗干净，进行切分操作。利用消毒刀具在无菌操作台内进行苹果切分，切成8mm
×
5mm
×
3mm小块，分成两份，每份100g。对照组用无菌超纯水浸泡60s，实验组用不同浓度的曲酮c溶液浸泡60s。等量分装于3个聚乙烯自封袋中，在4℃冰箱保存10天。前面12h每2h测定一次，后面每2天测定一次。结果表明，对照组4h即出现明显褐变，添加10μm的曲酮c后，12h才出现明显褐变，10μm的曲酮c即具有明显的抗水果褐变作用。
[0059]
实施例8苹果汁抗褐变作用
[0060]
本发明提供技术方案：一种曲酸衍生物曲酮c的应用，苹果洗涤、削皮、去核，切块，称100g，加入100ml蒸馏水，分别添加不同浓度的曲酮c溶液。快速打浆，所得果汁用滤纸过滤，立即测定其在420nm下的光密度值(od值)，其余的倒入培养皿。放置于室温(25℃)下以便充分氧化褐变，分别测定6h、12h、24h、48h后的吸光度值。结果表明，对照组苹果汁6h即出现明显褐变，添加10μm的曲酮c后，12h才出现明显褐变，10μm的曲酮c即具有明显的抗果汁褐变作用。
[0061]
综上所述，本发明提出了一种新颖三环结构的曲酸衍生物曲酮c，后续的研究中发现曲酮c有明显的抗氧化活性，对abts和dpph自由基清除的ec50分别为39.5
±
2.8μm和84.8
±
4.6μm，曲酮c对酪氨酸酶抑制活性强于曲酸，ic
50
分别为10.8
±
1.9μm和8.9
±
1.5μm，10μm的曲酮c即具有明显的鲜切水果和果汁抗褐变作用。曲酮c可为抗褐变作用的食品添加剂开发提供了有效的前体化合物，对于满足社会需求、降低生产成本、提高市场价值以及此类化合物的食品添加剂应用价值都有一定的促进作用，也对曲酸的进一步药效研究和药物开发以及下一步的应用奠定物质基础。
[0062]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。