一种基于肿瘤解聚机制的层状双金属氢氧化物材料制备方法和应用

1.本发明涉及一种解聚肿瘤和激活免疫的生物材料、制备方法及其医学应用，具体涉及一种尺寸可控的乙二胺四乙酸负载层状双氢氧化物材料及其制备方法以及该材料具有广谱性的肿瘤治疗作用(在不同尺寸下对应的不同种医学应用)，属于医用生物纳米材料技术领域。


背景技术：

2.免疫疗法逐渐成为攻克肿瘤的研究热点，并由此看到了治愈癌症的曙光。近年来，许多研究工作热衷于增强适应性免疫的治疗作用，例如输入体外改造的嵌合抗原受体t细胞(car-t)，或使用针对t细胞的pd-1、pd-l1和ctla-4免疫检查点抑制剂，以及开发高活性的肿瘤免疫疫苗等。在初步的临床考察中，这些免疫治疗手段虽然在血液瘤的应用中得到较高的响应率，然而过继转移至实体瘤却面临着较大的挑战。一方面实体瘤不似血液瘤环境较为单一，实体瘤涉及的肿瘤微环境中(tumormicroenvironment,tme)含有由成纤维细胞、基质细胞、t、b等淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞等。他们之间相互影响，降低肿瘤的免疫原性和促进肿瘤的免疫逃逸。另一方面，在实体瘤部位促血管生成因子与抗血管生成因子的调控失衡导致血管系统异常，大多招募过来的免疫细胞如巨噬细胞和杀伤性t细胞等，仅围绕在肿瘤的边缘而难以深入到瘤体内部，大幅度降低了免疫作用。因此，针对实体瘤复杂的微环境，设计一种即能提高免疫细胞的抗肿瘤活性，解聚肿瘤组织，增加免疫细胞侵入瘤体内部的治疗策略具有重大的研究意义。


技术实现要素：

3.针对现有技术存在的不足和需求，本发明的目的在于提供多尺寸可负载并释放edta、锌铝层状双氢氧化物ldh，并安全有效地开发应用于多种癌症的广谱性治疗药物的制备中，不同尺寸的edta/ldh采用不同给药方式，在激活免疫细胞的同时，增加肿瘤血管通透性以及解聚肿瘤组织，促使免疫细胞侵入，增强肿瘤的免疫治疗效果。
4.第一方面，本发明提供了一种基于肿瘤解聚机制的edta/ldh层状双氢氧化物材料，所述edta/ldh层状双氢氧化物材料为负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物；以锌铝层状双氢氧化物的质量为100wt％，所述乙二胺四乙酸的含量为≥10wt％，优选为10wt％～50wt％。其中，乙二胺四乙酸钠盐通过阴离子交换插层入锌铝层状双氢氧化物的层间。具体含义为，乙二胺四乙酸负载质量为锌铝层状双氢氧化物质量的10wt％～50wt％之间。
5.钙离子与免疫细胞的功能有着至关重要的联系，作为细胞的第二信使，钙离子调控细胞的多种信号转录因子，蛋白表达和酶的功能，是免疫细胞离子通道中的研究热点。钙离子内流与细胞内钙浓度的振荡相关，并调节固有免疫细胞的激活和极化。钙库操纵性钙内流(store-operated ca
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entry,soce)是介导细胞外钙离子进入免疫细胞的重要途径之一。之前研究表明，当储存在巨噬细胞的内质网中钙离子被消耗后，soce通道打开，细胞外
的钙离子向内流入来补充细胞质中缺失的钙离子。这整个钙内流的过程导致巨噬细胞向m1型极化。因此，本发明主要通过调控细胞的钙内流来促进固有免疫系统的抗肿瘤活性。
6.此外，钙离子也参与着细胞的连接作用，细胞连接主要有紧密连接、粘着连接和间隙连接，桥粒半桥粒结构等。在这些连接中，一些关键蛋白的表达是钙离子依赖型的，例如典型的粘着带中表达的e-cadherin蛋白，桥粒结构中表达的桥粒芯蛋白和桥粒胶蛋白(dsg1,dsc1)，这些蛋白构象只有在钙离子存在时才能维持稳定。乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid,edta)作为一种经典的钙离子螯合剂，可以破坏钙依赖蛋白的表达，使细胞连接断裂。据此，在本发明中，通过edta调控钙离子来减弱细胞间的连接作用，从而促使致密的实体瘤间隙增大，并解聚肿瘤，较多的免疫细胞更易于侵入到瘤体内部，另外针对一些腔道性肿瘤，被解聚脱落的细胞，仍被纳米材料紧紧包裹，顺着腔道可排出体外。
7.然而，游离的edta在生物体内具有一定毒性，而且容易被机体快速代谢，难以实现调控细胞钙离子的作用。为了克服这些缺点，本发明采用对机体而言组份相对安全的锌铝层状双氢氧化物ldh作为edta的输运载体。。ldh的结构与水镁石mg(oh)2类似，即晶体结构中6个o-h包围1个mg
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形成八面体。当八面体以邻边堆积的形式组成二维纳米片时，其中部分mg
2
易被其他三价阳离子m
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同晶置换，导致片层正电荷过量，需要层间插入阴离子补偿电荷。作为一种多功能给药体系主要具有以下优点：1)由于ldh具有很强的阴离子交换能力，且层间具备较高的客容量，因此被广泛应用于负载药物和离子；2)ldh是一种临床应用中和胃酸以及治疗胃炎等疾病的特效药，表明了ldh具有良好的生物相容性；3)ldh表面带正电性，且尺寸可控，大尺寸ldh易于贴附在细胞膜表面，小尺寸ldh易于经溶酶体释放至内质网；4)ldh具有ph响应的药物释放性能，在肿瘤微酸环境下，可加快药物的释放，而在正常组织中，药物释放较慢较少，有效减少对正常细胞的影响。
8.较佳的，所述锌铝层状双氢氧化物中zn和al的摩尔比为2:1～3:1，优选为2:1。
9.较佳的，所述edta/ldh层状双氢氧化物材料的颗粒尺寸范围为100～2000nm。
10.第二方面，本发明提供了一种edta/ldh层状双氢氧化物材料的制备方法，包括：(1)将锌源、铝源、碱液试剂和阴离子源溶于水中，得到混合溶液；(2)将所得混合溶液在25～140℃下搅拌并在保护气氛中进行冷水回流0.5～2小时，再加入乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸钠盐溶液反应，在60～200℃下继续反应5～48h，再经过离心、过滤、清洗和冷干，得到edta/ldh层状双氢氧化物材料。
11.较佳的，所述锌源为硝酸锌及水合物、氯化锌及水合物、磷酸锌及水合物中的至少一种；所述的铝源为硝酸铝及水合物、氯化铝及水合物、磷酸铝及水合物中的至少一种；所述锌源和铝源的摩尔比为(2～3)：1。
12.较佳的，所述碱液试剂为六次亚甲基四胺、尿素和氢氧化钠中的至少一种；所述阴离子源为硝酸钠、氯化钠和磷酸钠中的至少一种；所述锌源和碱液试剂的摩尔比为2：(3～10)；所述锌源和阴离子源的摩尔比为(1～3)：(1～2)。
13.较佳的，所述乙二胺四乙酸和锌源的质量比为(0.1～1.2)g：(0.594～0.891)g；所述edta/ldh层状双氢氧化物材料的整个制备过程在氩气保护气氛下进行，避免空气中二氧化碳进入edta/ldh层状双氢氧化物材料体系。
14.第三方面，本发明提供了一种edta/ldh层状双氢氧化物材料溶液，包括：生理盐
水、磷酸盐缓冲液或细胞培养液中一种作为分散溶液，以及分散在分散溶液中edta/ldh层状双氢氧化物材料；优选地，所述edta/ldh层状双氢氧化物材料的浓度为0.1～100mg/ml。更优选，当edta/ldh层状双氢氧化物材料的粒径为100～600nm，所述edta/ldh层状双氢氧化物材料溶液的浓度为0.1～10mg/ml，优选浓度为4mg/ml，适用于静脉注射给药方式；当edta/ldh层状双氢氧化物材料的粒径为600～2000nm，所述edta/ldh层状双氢氧化物材料溶液的浓度为0.1～100mg/ml，优选浓度为5mg/ml，适用于腔道灌注给药方式。
15.第四方面，本发明提供了一种edta/ldh层状双氢氧化物材料和edta/ldh层状双氢氧化物材料溶液在制备抗肿瘤药物中的应用。具体涉及一种小尺寸(100-600nm)edta/ldh以及针对肿瘤治疗，通过静脉注射该材料体系，该材料可被单核细胞吞噬，加促细胞钙内流，从而调控全身固有免疫，进一步激活适应性免疫，并增加免疫细胞侵润的应用。或者，涉及一种大尺寸(600-2000nm)edta/ldh以及针对肿瘤治疗，通过局部接触给药，尤其采用口服，外敷或腔道灌注该材料体系，该材料可通过静电力贴附在肿瘤细胞膜表面并破坏细胞连接，从而解聚肿瘤组织，并促使免疫细胞以及其他辅助治疗物质侵入到肿瘤内部的应用。
16.第五方面，本发明提供了一种edta/ldh层状双氢氧化物材料和edta/ldh层状双氢氧化物材料溶液在制备息肉的剥离用药物中的应用，其机制与解聚肿瘤类似，在炎性等环境下，该材料可破坏细胞间连接，促使息肉等组织脱落。
17.在其中的一些实施例中，所述edta/ldh纳米材料可分散至生理盐水或磷酸盐缓冲液中，可制备为液体制剂。
18.在其中的一些实施例中，所述小尺寸edta/ldh液体制剂可通过静脉注射至机体中。
19.在其中的一些实施例中，所述小尺寸edta/ldh液体制剂可在全身循环中激活机体的固有免疫，促使固有免疫细胞的抗肿瘤型极化，并进一步调动机体的适应性免疫。
20.在其中的一些实施例中，所述小尺寸edta/ldh液体制剂可在机体循环中肿瘤微酸响应性释放edta，破坏肿瘤周围血管通透性，促使edta/ldh聚集在肿瘤区。
21.在其中的一些实施例中，所述小尺寸edta/ldh液体制剂可在肿瘤区富集，破坏肿瘤间细胞连接，致密的瘤体变为疏松，促使激活的免疫细胞侵入到肿瘤组织内部。
22.在其中的一些实施例中，所述小尺寸edta/ldh液体制剂用于治疗原发性肿瘤，以及转移和扩散的全身性肿瘤。
23.在其中的一些实施例中，所述大尺寸edta/ldh液体制剂可通过口服，局部注射和灌注等方式至腔管性肿瘤区域，进行接触性治疗。
24.在其中的一些实施例中，所述大尺寸edta/ldh液体制剂可通过皮肤外敷等方式，对外露肿瘤进行接触性治疗。
25.在其中的一些实施例中，所述大尺寸edta/ldh液体制剂可通过局部肿瘤的直接接触，破坏肿瘤细胞连接，解聚肿瘤组织，并使一些脱落的肿瘤细胞和组织随着腔道或者管道排出，可适用于食道癌，膀胱癌，胃癌，口腔癌，宫颈癌，腹腔肿瘤等腔道性癌种。
26.在其中的一些实施例中，所述大尺寸edta/ldh液体制剂可通过外敷，破坏细胞连接，促使免疫细胞的侵润，可适用于黑色素瘤，皮肤癌，乳腺癌，前列腺癌等。
27.在其中的一些实施例中，所述大尺寸edta/ldh液体制剂同样适用于息肉的剥离治疗。
28.在其中的一些实施例中，所述edta/ldh液体制剂，通过全身或局部给药，可将肿瘤组织由致密变疏松，从而协助其他治疗更加深入至肿瘤组织内部，例如放疗和化疗等。
29.有益效果：本发明中，在edta/ldh纳米材料方面上：该材料的制备方法(可调控的均相减液法)简单，尺寸可控；该材料呈正电性，易于贴附在肿瘤细胞膜表面；该材料表面空间位阻小，酸响应性释放edta更加敏感。在应用方面上，本发明提供了一种具有广谱性的edta/ldh纳米材料制剂，可选择不同尺寸对应不同的用处。本发明中，edta/ldh纳米材料可分散至生理盐水或磷酸盐缓冲液中，可制备为液体制剂。本发明中，edta/ldh层状双氢氧化物材料表面带正电性，更易于贴附在肿瘤细胞膜表面，且材料表面的空间位阻小，更易于肿瘤微酸响应性释放edta，可单独用于制备抗肿瘤药物中的应用。本发明中，edta/ldh层状双氢氧化物材料的制备工艺简单；本发明中，edta/ldh材料体系在体内循环时，易被固有免疫细胞吞噬，经细胞的内涵体和溶酶体运输至内质网，材料释放edta并引起内质网钙耗竭，最终导致soce钙内流的现象。钙内流促使异质性固有免疫细胞(巨噬细胞和中性粒细胞等)向抗肿瘤的类型极化，之后进一步激活机体的适应性免疫细胞；本发明中，edta/ldh材料体系，带正电，易于粘附在负电性的细胞膜上，具有更强的酸敏感性，在肿瘤弱酸的刺激下，该材料逐渐释放edta，螯合细胞连接蛋白中的钙离子，破坏肿瘤间的细胞连接，使“致密”的实体瘤变得较为“疏松”，从而有益于激活的免疫细胞浸润至肿瘤内部。此外，这种ph响应性释放edta的纳米材料体系，降低了对正常组织的毒性作用，并对肿瘤的治疗具有广谱性。
附图说明
30.图1为实施例1所制得的材料体系edta/ldh分散于水中的透射电镜(tem)照片；图2为实施例2所制得的材料体系edta/ldh分散于水中的透射电镜(tem)照片；图3为实施例3所制得的材料体系edta/ldh分散于水中的透射电镜(tem)照片图4为实施例1所制得的材料体系edta/ldh的xrd图谱；图5为实施例1所制得的材料体系edta/ldh的fi-ir图谱；图6为实施例1所制得的材料体系edta/ldh通过icp-oes测得元素比例；图7为实施例1所制得的材料体系edta/ldh的zeta电位分析；图8为实施例1所制得的edta/ldh材料体系针对巨噬细胞的极化作用；图9为实施例1所制得的edta/ldh材料体系静脉注射后，将肿瘤组织进行h&e染色分析，评价其针对肿瘤组织的解聚作用；图10为实施例1所制得的edta/ldh材料体系静脉注射后，侵润至肿瘤中的免疫细胞流式分析；图11为用实施例1所制得的edta/ldh材料体系静脉注射至原位肺癌的c57/bl6小黑鼠，(a)一周后小鼠的肺肿瘤体积，(b)治疗16天后小鼠的肺肿瘤体积，(c)肺重量以及(d)肺部组织h&e染色切片；图12用为实施例1所制得的edta/ldh材料体系经尾静脉注射至健康的小白鼠内，7天以及30天后的血液指标检测，评估材料的安全性。
具体实施方式
31.以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
32.本发明公开提供了一种尺寸可控的负载并释放乙二胺四乙酸edta的锌铝层状双氢氧化物ldh材料体系(或称edta/ldh)，并将不同尺寸的edta/ldh材料体系，采用不同的给药方式，开发应用于肿瘤的广谱性治疗。该材料体系致力于解聚肿瘤组织和激活免疫系统，并促使免疫细胞及其他辅助治疗物质侵润至肿瘤内部。用于增强免疫和解聚肿瘤的治疗广谱性药物，所述的广谱性药物为edta/ldh纳米材料。
33.针对小尺寸(100-600nm)的edta/ldh材料体系，本发明提出了一种激活固有免疫系统同时增加免疫细胞侵入的实体瘤治疗策略。当该材料体系通过静脉注射到机体内，发挥免疫治疗的主要途径可分为：1)当该纳米材料体系进入机体循环时，作为大颗粒的外源物质首先容易被内皮网状系统中的固有免疫细胞吞噬。在经过内涵体和溶酶体(ph:4.5～5.5)运输后，ldh在酸性下层间力减弱，促使材料从溶酶体转运至内质网时释放大量的edta。edta快速螯合内质网中的钙离子导致钙离子耗竭，引起钙库操纵性钙离子内流现象，从而激活固有免疫细胞并促使其向抗肿瘤型细胞极化。激活的固有免疫细胞进一步活化适应性免疫细胞，联合作用加强对肿瘤的杀伤性；2)当未被吞噬的edta/ldh纳米材料体系循环至肿瘤组织周围时，由于edta/ldh的纳米材料的正电性，易于吸附在肿瘤血管表面。同时在肿瘤的微酸环境(ph:6.5～6.8)响应下释放edta，破坏细胞连接使肿瘤细胞间隙增大，从而改善实体瘤的通透性。最后这些被激活的免疫细胞，侵入到解聚状态的实体瘤内部，更多接触肿瘤细胞，发挥高效的免疫治疗效果。
34.针对大尺寸(600-2000nm)的edta/ldh材料体系，本发明提出了一种简单、无创的解聚肿瘤治疗策略。采用口服，外敷或者腔道灌注等便捷操作，将该材料体系输送至肿瘤区域。由于表面的正电性，促使该材料体系快速的附着在肿瘤表面。并因尺寸较大，无法被细胞摄取，而是持续粘附在细胞膜表面，对酸度更加敏感的edta/ldh材料体系在肿瘤偏酸的微环境中较快地释放edta来螯合钙离子，抑制钙离子依赖性细胞连接蛋白的表达，破坏细胞连接，使肿瘤细胞脱落。并且重要的是，这些脱落的分散状态的细胞依旧被edta/ldh材料体系紧紧包裹，抑制其重新着壁能力，降低转移和复发的风险。
35.在本发明中，层状双氢氧化物组成选用对机体相对安全的锌铝离子。通过调控反应时间，反应温度，以及edta的浓度等来控制edta/ldh材料体系的尺寸大小，以下示例性地说明该材料体系的制备方法。
36.在可选的实施方式中，作为一类示例，采用改善的均相碱液法制备该材料体系。具体来说，将溶有锌源(锌金属盐)和铝源(铝金属盐)、碱液(氢氧化钠，六次亚甲基四胺或尿素)以及阴离子源(硝酸钠，氯化钠或磷酸钠等)的混合溶液置于油浴锅中加热，于氩气保护气氛下回流油浴0.5～2h后，再加入乙二胺四乙酸或其钠盐置换层间阴离子，edta通过阴离子交换大量地插入ldh层间，制备出的样本标记为edta/ldh。
37.在可选的实施方式中，针对小尺寸100～600nm edta/ldh材料体系的制备，乙二胺四乙酸可优选用二钠盐，和锌源的质量比可为0.6：0.297～0.594g。锌源优选硝酸锌和氯化
锌等。铝源优选硝酸铝和氯化铝等，阴离子源可优选用硝酸钠和氯化钠等，碱液可优选用六次亚甲基四胺和氢氧化钠等。其中，锌源和铝源的摩尔比优选为2：1。硝酸钠和锌源的摩尔比优选为1:1，六次亚甲基四胺和锌源的摩尔比优选为5:2，氢氧化钠和锌源的摩尔比优选为3:2，温度可优选为80～100℃，时间可选为1～12h。
38.在可选的实施方式中，作为一类示例，针对大尺寸600～2000nm edta/ldh材料体系的制备，乙二胺四乙酸可优选用二钠盐，和锌源的质量比可为0.6：0.594～0.891g。锌源优选硝酸锌和氯化锌等。铝源优选硝酸铝和氯化铝等，阴离子源可优选用硝酸钠和氯化钠等，碱液可优选用六次亚甲基四胺和尿素等。其中，锌源和铝源的摩尔比可为2～3：1。硝酸钠和锌源的摩尔比可为1:1～2，六次亚甲基四胺和锌源的摩尔比可为5～10:2，尿素和锌源的摩尔比可优选为5～10:2，温度可优选为100～140℃，时间可选为12～48h。
39.以上所述多尺寸的edta/ldh合成反应中，均需要在氩气保护气氛下进行，避免空气中二氧化碳进入体系中，形成碳酸根离子插入ldh层间并难以置换出。以上材料体系均制备完后用离心一次，去离子水过滤清洗一到三次，并真空冷干后，研磨为粉末状，保存在4℃冰箱内，后续现用现配置按浓度分散到生理盐水(组分为0.9％nacl水溶液)、磷酸盐缓冲液(10x)(可源自市售，型号或厂家为ph 7.4|gibco)或者细胞培养液(可源自市售，型号或厂家为dmem低糖培养基|gibco)中。
40.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
41.实施例1400～600nm负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物(edta/ldh)的制备过程如下：称取一定量的zn(no3)2·
6h2o(0.594g)、al(no3)3·
9h2o(0.375g)、nano3(0.085g)和六次亚甲基四胺(hmt)(0.702g)溶于150ml的去离子水中，在高纯氩气氛保护下磁力搅拌20min排出空气，然后将该溶液移至80℃油浴锅中搅拌，在高纯氩作为保护气的条件下回流，0.5h后，缓慢加入na2h2edta溶液(0.6g溶于50ml去离子水中)，80℃继续反应10h，最后将离心收集的沉淀物过滤并用去离子水充分清洗，真空冷干4h后，得到edta/ldh样本。
42.实施例2800～1200nm负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物(edta/ldh)的制备过程如下：称取一定量的zn(no3)2·
6h2o(0.594g)、al(no3)3·
9h2o(0.375g)、nano3(0.085g)和六次亚甲基四胺(hmt)(0.702g)溶于200ml的去离子水中，在高纯氩气氛保护下磁力搅拌20min排出空气，然后将该溶液移至100℃油浴锅中搅拌，在高纯氩作为保护气的条件下回流，1h后，缓慢加入na2h2edta溶液(0.3g溶于10ml去离子水中)，再过1h后，第二次缓慢加入na2h2edta溶液(0.3g溶于10ml去离子水中)，100℃继续反应22h，最后将离心收集的沉淀物过滤并用去离子水充分清洗，真空冷干4h后，得到edta/ldh样本。
43.实施例3100～300nm负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物(edta/ldh)的制备过程如下：称取一定量的zn(no3)2·
6h2o(0.891g)、al(no3)3·
9h2o(0.375g)、nano3(0.170g)和氢
氧化钠(0.2g)溶于50ml的去离子水中，在高纯氩气氛保护下磁力搅拌20min排出空气，然后将该溶液移至140℃油浴锅中搅拌，在高纯氩作为保护气的条件下回流，0.5h后，缓慢加入na2h2edta溶液(0.6g溶于50ml去离子水中)，140℃继续反应12h，最后将离心收集的沉淀物过滤并用去离子水充分清洗，真空冷干4h后，得到edta/ldh样本。
44.1、材料的表征图1为实施例1所制得的材料体系edta/ldh分散于水中的透射电镜(tem)照片，所制得的材料形貌为二维片层状，分散均一，尺寸直径约500nm左右。
45.图2为实施例2所制得的材料体系edta/ldh分散于水中的透射电镜(tem)照片，所制得的材料是直径约为900nm的二维纳米片。
46.图3为实施例3所制得的材料体系edta/ldh分散于水中的透射电镜(tem)照片，所制得的材料呈直径约为200nm的二维纳米颗粒。
47.图4为实施例1所制得的材料体系edta/ldh的xrd图谱，由图4可见：该材料体系具有(003)、(006)和(009)的基础衍射峰，10
°
左右为层状结构的特征峰，但在有无edta插层的情况下其峰位置存在一定差异。与ldh相比，edta/ldh的特征峰向低度偏移，因为edta具有较长的范德华对端长度导致层间距d
003
增大，说明了edta成功通过阴离子交换反应插入到ldh的层间。
48.图5为实施例1所制得的材料体系ldh、edta和edta/ldh的红外图谱，由图5可见：在ldh谱图中，3450cm-1
和1597cm-1
处的吸收带是ldh中结合水的弯曲振动和氢键拉伸振动。在1382cm-1
处的锐吸收带是由ldh层间硝酸根离子的拉伸振动模式引起的。相比之下，在edta/ldh谱中，1625cm-1
和1394cm-1
处的强吸收带是由于edta中coo基团的对称和反对称振动引起的，证明了edta成插入ldh中，此外，νs和νas的波数相差甚大(δν≥200cm-1
)，说明coo基团在ldh层中仍然保持离子形态，具有金属离子的配位性能。
49.图6为实施例1所制得的材料体系edta/ldh的icp-oes元素定量分析，由此可得最终制得的edta/ldh材料锌铝离子摩尔比接近投料比为2:1.
50.图7为实施例1所制得的材料体系edta/ldh的zeta电位分析，由图可见：ldh的表面带有正电性，负载edta后，不改变材料表面的正电性，可以较好的附着在负电性的细胞膜表面。
51.2、材料细胞应用效果实验实验方法：将巨噬细胞分别与lps(1μg/ml)、实施例1所制得的材料体系edta/ldh(200μg/ml)、il-4(40ng/ml)、edta/ldh(200μg/ml) il-4(40ng/ml)共孵育48h，观察细胞极化情况。用荧光pe标记的小鼠抗体cd206，apc荧光标记的小鼠抗体cd86,在bd染色缓冲液中稀释后，对干预后的巨噬细胞进行染色30分钟，染色样品洗涤后重悬，用bd lsrfortessa流式细胞分析仪检测巨噬细胞m1极化的情况。
52.实验结果：图8为以上实验的流式细胞分析结果，用常见的炎症抗原lps和抗炎细胞因子il-4分别刺激巨噬细胞向m1和m2极化，作为阳性对照和阴性对照。巨噬细胞与实施例1所制得的材料体系edta/ldh共孵卵后，分析结果显示，与lps相似，edta/ldh干预后的巨噬细胞cd86的表达比例较多，证明了该材料体系促使巨噬细胞向m1抗肿瘤型极化。另外，即使在il-4存在的情况下(简称e/l il-4,)，cd86的表达仍然呈上调趋势，表明该材料体系可逆转巨噬细胞极化，导致巨噬细胞从m2抑瘤型极化为m1抗瘤型。
53.3、材料针对肿瘤组织的解聚作用实验方法：本实例中所有使用的动物均购自上海
实验动物中心。雌性balb/c小鼠(20-22g)采用皮下注射100μl 4t1小鼠乳腺癌细胞(1
×
106个细胞)，建立皮下荷瘤小鼠，待瘤体大小达～50mm3时进行体内研究。将实施例1所制得的材料体系edta/ldh分散于生理盐水(4mg/ml)中，通过尾静脉注射至荷瘤小鼠体内，剂量为40mg/kg，第三天后，处死小鼠，取出肿瘤组织，进行h&e染色分析。
54.实验结果：在静脉注射edta/ldh纳米材料的第三天后，观察到小鼠皮下瘤体积变小，触摸时感受到瘤体变软。将肿瘤解剖进行h&e染色后，如图9所示，与对照组致密的肿瘤组织不同，实施例1所制得的材料体系edta/ldh干预后，肿瘤组织中细胞间隙增大，发生了解聚现象，并促使侵入的免疫细胞增加，表明了该材料打开肿瘤细胞连接并导致免疫细胞侵入瘤体内部。
55.4、材料促使免疫细胞的激活和侵润作用实验方法：将实施例1所制得的材料体系edta/ldh、ldh和edta分散于生理盐水(剂量分别为40、40和2mg/kg)中，通过尾静脉注射至4t1荷瘤小鼠体内，分别在1，3和7天后，处死小鼠，取出肿瘤组织，用肿瘤消化酶混合物在37℃下消化90min，得到单细胞悬液。收集的单细胞悬液用相应抗体染色，测定肿瘤中免疫细胞分型和比例。
56.实验结果：由于经静脉注射的材料体系edta/ldh可选择性破坏肿瘤组织的细胞连接，使得肿瘤组织的通透性大幅度增强，如图10分析可得，对比对照组，edta/ldh干预后浸润肿瘤组织的白细胞数量大幅度增加。此外，固有免疫系统在第1天被迅速激活，巨噬细胞和中性粒细胞都显示出抗肿瘤活性。在第7天，t细胞也表现出较高的抗肿瘤活性,cd8/cd4的比例显著上升，表明实施例1所制得的材料体系edta/ldh首先激活机体的固有免疫，同时调动机体的适应性免疫，以固有免疫和适应性免疫的协同方式快速、持续地清除肿瘤。
57.5、材料对原位肺癌小鼠的治疗评估实验方法：构建小鼠原位肿瘤模型：采用氧气和异氟烷混合呼吸麻醉小鼠，左肺经胸壁注射50μl混合基质的1
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104llc(小鼠肺癌细胞)。7天后，取出小鼠，解剖观察原位肿瘤的形成。将llc肺原位荷瘤小鼠随机分为4组(n＝5)，分别于第1、4、7天给予pbs、ldh、edta或实施例1所制得的材料体系edta/ldh(40mg/kg)，每隔2天监测小鼠体重和健康状态，并按公式(width2×
length)/2计算肿瘤体积。在第15天处死小鼠，解剖取出小鼠的肺部组织，测量llc肺原位肿瘤的大小并进行h&e染色。
58.实验结果：如图11所示，在整个治疗期间，edta/ldh组小鼠存活率为100％，与其他三组小鼠可检测到的体重下降相比，其体重呈正常的逐渐增长趋势。实验结束时将小鼠全肺切除，从h&e切片中可以清楚地看到，对照组瘤体几乎占据了整个肺部组织，体积高达1300mm3。令人兴奋的是，edta/ldh处理的肿瘤平均体积仅低至20mm3。此外，由于肿瘤的生长，尤其是对照组的肺重量也显著增加，但edta/ldh组的肺重量几乎与健康小鼠的正常肺重量相当，这表明或实施例1所制得的材料体系edta/ldh体系，通过静脉注射至机体后，可以较好的发挥抗肿瘤作用。
59.6、材料对机体的安全性评估。实验方法：健康的balb/c小鼠(体重约20g)随机分为三组。然后，将两组小鼠同上述方法尾静脉注射实施例1所制得的材料体系edta/ldh分散于生理盐水(10mg/ml)，剂量高达100mg/kg，剩余一组未加任何处理的大鼠为对照组。分别于第7天和第30天后处死大鼠并取出血液，进行血液指标分析。
60.实验结果：图12为健康的balb/c小鼠静脉注射实施例1所制得的材料体系edta/
ldh(10mg/kg)后的血液指标。由图12可见：与对照组的健康小对比，在材料干预后，各项血液指标仍在标准范围内，有关主要器官和功能的血液指标也均无异常，表明该材料即无应激的急性毒性又无长期的组织毒性，证明了该材料在活体水平的具有较好的生物安全性。
61.此外，实施例2所制得的较大尺寸材料体系edta/ldh已经送至具备国家级安全检测资质的公司，对材料开展全面的毒性评估，该材料体系获得了合格的细胞毒性、热源性、急毒性、皮肤致敏、阴道刺激以及直肠刺激等检测结果，后期将致力于从基础研究向临床应用的转换。
62.最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非实质性的改进和调整均属于本发明的保护范围。