取代3-噻唑烷-2,4-二酮类Mcl-1蛋白抑制剂及制备方法和应用

取代3-噻唑烷-2,4-二酮类mcl-1蛋白抑制剂及制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种取代3-噻唑烷-2,4-二酮类mcl-1蛋白抑制剂及其制备、药物组合物与医药用途，属于医药技术领域。


背景技术：

2.细胞凋亡，又称为程序性细胞死亡(pcd)，细胞凋亡是一类保守进化以及高度调控的死亡过程，是一种多细胞生物重要的保护机制。它可以清除动物体内无功能、有害、突变以及受损的细胞，从而保护它们免受由dna突变导致的细胞生长和增殖失控的影响，在维持机体稳态和胚胎生长发育等方面发挥着重要作用。逃避细胞凋亡是恶性肿瘤的一个标志，是肿瘤发生、发展，以及对多种常规抗肿瘤药物治疗产生耐药性的原因之一。研究发现，细胞凋亡主要存在两种凋亡途径，即死亡受体介导的外源性凋亡途径和线粒体介导的内源性凋亡途径。迄今为止，通过作用于凋亡途径中的关键调节子恢复肿瘤细胞的正常凋亡，已成为一种非常有前景的抗肿瘤策略。
3.研究表明，b细胞淋巴瘤/白血病-2(b-cell leukemia/lymphoma-2,bcl-2)蛋白家族是细胞凋亡的一个关键调节因子，在线粒体介导的内源性途径中发挥着重要的作用。bcl-2蛋白家族根据其功能与结构的不同，可以分为三大类：(1)抗凋亡蛋白，比如bcl-2、bcl-xl、mcl-1等；(2)多结构域促凋亡蛋白，比如bax、bak；(3)促凋亡bh3-only蛋白，比如bad、bim、noxa等。当细胞发生内源性凋亡途径时，bh3-only蛋白通过激活bax、bak，使之吸附在线粒体外膜上，通过改变外膜的通透性向胞内释放细胞色素c、smac蛋白等促凋亡因子，从而激活半胱氨酸天冬氨酸酶，引起细胞凋亡。而抗凋亡蛋白bcl-2、bcl-xl和mcl-1能够与促凋亡蛋白bad、bim、bax及bak等形成异源寡聚体来抑制其活性，从而达到逃避细胞凋亡的作用。研究发现，抗凋亡蛋白bcl-2、bcl-xl、mcl-1在多种恶性肿瘤细胞中高度表达(乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌以及白血病等)，与相关肿瘤的发生、复发以及对化疗药物的耐药性密切相关。因此，发展小分子抑制剂来拮抗抗凋亡bcl-2蛋白的活性已成为目前抗肿瘤药物研发的一个热点。
4.在过去的几十年里，许多结构新颖的小分子抗凋亡bcl-2蛋白抑制剂相继被报道，并显示出良好的抗肿瘤活性。特别是，首个选择性bcl-2抑制剂venetoclax/abt-199被美国食品药品监督管理局(fda)批准上市，用于治疗17p染色体缺失的慢性淋巴细胞白血病患者，极大的鼓舞了药物工作者。然而，abt-199与mcl-1结合能力较差，在诱导某些依赖mcl-1生存的血液病和实体瘤细胞凋亡的能力并不理想。针对这一临床现实性问题，寻找新型靶向mcl-1的小分子抑制剂已成为当前肿瘤(特别是恶性肿瘤)治疗领域中极具挑战性和巨大应用价值的研究课题。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种取代3-噻唑烷-2,4-二酮类mcl-1蛋白抑
制剂，本发明还提供该化合物的制备方法。
6.本发明进一步还提供该化合物的药物组合物及医药用途。
7.本发明的技术方案如下：一、取代3-噻唑烷-2,4-二酮类mcl-1蛋白抑制剂一种取代3-噻唑烷-2,4-二酮类mcl-1蛋白抑制剂，是具有通式(i)结构的化合物或其药学上可接受的盐。
8.通式(i)中，r1是烷基，芳基，杂芳基；r1优选为任选取代的c1-c10烷基、c3-c10环烷基、c5-c15芳基，以及含有5或6个环原子的单杂环芳基，或具有8至15个环原子的双杂环芳基，杂环芳基含有1-4个杂原子，所述杂原子独立地选自o、s、n或氧化的s或n；碳原子或氮原子是杂芳环结构的连接点，保持稳定的芳环；通式(i)中，r2是异丙基或-a-r4；其中，a是ch2、nh、o、s原子，优选为ch2；r4为任选取代的芳基，杂芳基；r4优选为任选取代的c5-c15芳基，以及含有5或6个环原子的单杂环芳基，或具有8至15个环原子的双杂环芳基，杂环芳基含有1-4个杂原子，所述杂原子独立地选自o、s、n或氧化的s或n；碳原子或氮原子是杂芳环结构的连接点，保持稳定的芳环；通式(i)中，r3为任选取代的芳基，杂芳基；r3优选为任选取代的c5-c15芳基，以及含有5或6个环原子的单杂环芳基，或具有8至15个环原子的双杂环芳基，杂环芳基含有1-4个杂原子，所述杂原子独立地选自o、s、n或氧化的s或n；碳原子或氮原子是杂芳环结构的连接点，保持稳定的芳环；基团或者取代基选自羟基，卤素，硝基，氰基，胍基，羧基，卤c1-c6烷基，c1-c6烷氧基，c1-c6烷基，c3-c8环烷基，c6-c10芳基，芳烷氧基，含有1-2个杂原子的环原子数为5-10的杂芳基，1-3个上述基团或取代基在任何可及的位置连接以产生稳定的化合物。
9.根据本发明优选的，通式(i)中，r1是卤c1-c6烷基、c1-c6烷基、c3-c8环烷基、被1-2个羟基、卤素、硝基、氰基取代基取代或没有取代的吗啉基团、哌嗪基团连接的芳香基团ar，-nh-r5；ar是含有1个取代基或没有取代基的苯基、萘基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、中氮茚基、喹唑啉基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、苯并噻唑基、噻吩基、苯并[b]噻吩基、异恶唑基、恶噻二唑基、异噻唑基、四氮唑基、咪唑基、三嗪基、呋喃基、苯并呋喃基和吲哚基；r5是1-2
个羟基、卤素、硝基、氰基取代基取代或没有取代的c1-c6烷基，以及c1-c3亚烷基连接的上述芳香基团ar；取代基是羟基、卤素、硝基、氰基、胍基、羧基，卤c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷基、c3-c8环烷基、c5-c10芳基，含有1-2个杂原子的环原子数为5-10的杂芳基；r2是异丙基或-ch
2-r4；r4是3-吲哚基和含有1-2个取代基或没有取代的苯基、萘基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、中氮茚基、喹唑啉基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、苯并噻唑基、噻吩基、苯并[b]噻吩基、异恶唑基、恶噻二唑基、异噻唑基、四氮唑基、咪唑基、三嗪基、呋喃基、苯并呋喃基和吲哚基；取代基是羟基、卤素、硝基、氰基、胍基、羧基，卤c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷基、c3-c8环烷基、c5-c10芳基，取代的芳烷氧基，含有1-2个杂原子的环原子数为5-10的杂芳基；r3是被1-2个羟基、卤素、硝基、氰基取代基取代或没有取代的吗啉基团、哌嗪基团连接的芳香基团ar，-nh-r5；ar是含有1个取代基或没有取代基的苯基、萘基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、中氮茚基、喹唑啉基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、苯并噻唑基、噻吩基、苯并[b]噻吩基、异恶唑基、恶噻二唑基、异噻唑基、四氮唑基、咪唑基、三嗪基、呋喃基、苯并呋喃基和吲哚基；r4是1-2个羟基、卤素、硝基、氰基取代基取代或没有取代的c1-c6烷基，以及c1-c3亚烷基连接的上述芳香基团ar；取代基是羟基、卤素、硝基、氰基、胍基、羧基，卤c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷基、c3-c8环烷基、c5-c10芳基，含有1-2个杂原子的环原子数为5-10的杂芳基；根据本发明，进一步优选的，上述通式(i)化合物是下列之一：(s)-n-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a1)(s)-n-(4-甲基苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a2)(s)-n-(4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a3)(s)-n-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-甲基-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a4)(s)-n-(4-甲基苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-甲基-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a5)(s)-n-(4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a6)(s)-n-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a7)(s)-n-(4-硝基苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-溴苯基)丙酰胺(a8)(s)-n-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-溴苯基)丙酰胺(a9)(s)-n-(4-硝基苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-甲基-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-溴苯基)丙酰胺(a10)(s)-n-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑
环己基乙基或2-甲基-环丙基戊基。在许多实施方案中，烷基是含有1至15个碳原子、1至8个碳原子、1至6个碳原子、1至4个碳原子或1至2个碳原子的直链烷基或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基和类似烷基。
[0017]“亚烷基”是二价的烷烃衍生的碳原子基团，是直链或支链的，在其中，从相同的碳原子或不同的碳原子移去两个氢原子。亚烷基的例子包括但不限于-ch
2-、-ch2ch
2-和-ch2ch(ch3)-。
[0018]“烯基(alkenyl)”，单独或联合地，文中所指为直链烃或支链烃，其含有2-6个，优选,为2-4个碳原子，并且含有1-2个，优选为一个碳碳双键。烯基的例子包括但不仅限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基。
[0019]“环烷基”是取代或未取代的，饱和或不饱和的环状基团，其含有碳原子和/或一个或多个杂原子。该环可以是单环或稠环，桥环或螺环的环系。每个环中的环原子数是3-8个、更优选3-6个，如环丙基、环戊基、环己基、金刚烷基和类似基团。
[0020]“烷氧基”表示基团-o-烷基。
[0021]“卤素”单独地或联合地，是指所有卤素，即氯(cl)、氟(f)、溴(br)或碘(i)。
[0022]“药学上可接受的盐”是指通式(i)化合物具有疗效且无毒的盐形式。其可由任一酸性基团(如羧基)形成阴离子盐，或由任一碱性基团(如氨基)形成阳离子盐。本领域已知许多这样的盐。在任何酸性基团(如羧基)上形成的阳离子盐，或是在任何碱性基团(如氨基)上形成的阴离子盐。这些盐有许多是本领域已知的，如阳离子盐包括碱金属(如钠和钾)和碱土金属(如镁和钙)的盐以及有机盐(如铵盐)。还可通过使用相应的酸处理碱性形式的i方便地获得阴离子盐，这样的酸包括无机酸如硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸如乙酸、丙酸、羟基乙酸、2-羟基丙酸、2-氧代丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、2-羟基-1,2,3-丙三酸、甲磺酸、乙磺酸、苯甲磺酸、4-甲基苯磺酸、环己基亚磺酸、2-羟基苯甲酸、4-氨基-2-羟基苯甲酸等。这些盐是熟练技术人员熟知的，熟练的技术人员可制备本领域知识所提供的任何盐。此外，熟练技术人员可根据溶解度、稳定性、容易制剂等因素取某种盐而舍另一种盐。这些盐的测定和最优化在熟练技术人员的经验范围内。
[0023]
本文所用的“立体异构体”定义了本发明化合物或其生理上的衍生物所有可能的立体异构体的形式。除非另有指示，本发明化合物的化学命名包括所有可能的立体化学形式的混合物，所属混合物包含基本结构分子的所有非对映体和对映体，以及基本纯净的本发明化合物的单个异构体形式，即其中含有低于10％，优选低于5％，特别是低于2％，最优选低于1％的其它异构体。本发明类肽化合物各种立体异构体形式均明显包含于本发明的范围内。
[0024]
通式(i)化合物还可以其它被保护的形式或衍生物的形式存在，这些形式对本领域技术人员而言是显而易见的，均应该包含于本发明的范围内。
[0025]
如上所述的取代基自身还可被一个或多个取代基取代。这样的取代基包括在c.hansch和a.leo,substituent constants for correlation analysis in chemistry and biology(1979)中列出的那些取代基。优选的取代基包括烷基，烯基，烷氧基，羟基，氧基，硝基，氨基，氨基烷基(如氨甲基等)，氰基，卤素，羧基，羰基烷氧基(如羰基乙氧基等)，硫基，芳基，环烷基，杂芳基，杂环烷基(如哌啶基，吗啉基，吡咯基等)，亚氨基，羟烷基，芳基氧基，芳基烷基及其结合。
[0026]“药物组合物(pharmaceutical composition)”是指含有治疗上显著量的活性药剂的制备物，其以适于给予患者的形式被制备。因此，所述制备物不含有这样量的任何一种组分或多种组分，即，适当谨慎的医疗实施者发现所述制备物不适于给予普通对象。在许多情况下，这种药物组合物是无菌制备物。
[0027]
室温是指实验操作所处的环境温度，控制在10～30℃范围内。
[0028]
二、取代3-噻唑烷-2,4-二酮类mcl-1蛋白抑制剂的制备方法取代3-噻唑烷-2,4-二酮类mcl-1蛋白抑制剂的制备方法，步骤包括：以噻唑烷-2,4-二酮为起始原料，先与不同取代的甲醛发生knoevenagel缩合反应生成中间体1a-1c，然后在噻唑烷的3位n上与溴乙酸甲酯发生亲核取代反应并在酸性条件下脱去甲酯生成关键中间体2a-2c；此外，以不同取代的氨基酸3a-3e与不同取代的苯磺酰胺发生酰胺缩合反应生成关键中间体4a-4k；最后，关键中间体4a-4k先在氯化氢气体饱和的乙酸乙酯中脱去boc保护，然后利用混合酸酐法，在n-甲基吗啉与氯甲酸异丁酯的作用下，与另一个关键中间体2a-2c发生酰胺缩合反应得到目标化合物a1-a20。
[0029]
合成路线如下：其中，r
1-r3的定义同上通式(i)所述；试剂和条件：a)不同取代的甲醛，哌啶，乙醇，回流；b)i.溴乙酸甲酯，碳酸钾，丙酮，回流；ii.冰醋酸，浓盐酸，回流；c)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)，n,n-二异丙基乙胺(diea)，二氯甲烷，冰浴-室温；d)i.氯化氢饱和的乙酸乙酯溶液，室温；ii.n-甲基吗啉，氯甲酸异丁酯，四氢呋喃，-20℃-室温。
[0030]
合成路线中目标化合物的结构式如下表1所示：
表1目标化合物的结构式所述化合物的具体操作步骤将在实施例中将加以详细说明。
[0031]
本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率，他们可据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度，可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如t.greene,protecting groups in organic synthesis.三、取代3-噻唑烷-2,4-二酮类mcl-1蛋白抑制剂的应用本发明还提供了该系列化合物在制备预防或治疗因mcl-1蛋白表达异常导致的相关哺乳动物疾病药物中的应用。所述的与mcl-1蛋白异常表达相关的哺乳动物疾病包括癌症、神经变性疾病、病毒感染、炎症、白血病、疟疾和糖尿病等。
[0032]
此外，本发明还包括一种适于口服给予哺乳动物的药物组合物，包含上述通式(i)的任一化合物，和药学上可接受载体，任选包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
[0033]
此外，本发明还包括一种适于胃肠外给予哺乳动物的药物组合物，包含上述通式(i)和ii的任一化合物，和药学上可接受载体，任选包含一种或多种药学上可接受的赋形
剂。
[0034]
进行抑制酶活性和细胞活性两方面测试评价化合物在体外的生物活性。
[0035]
体外抑酶实验中，利用了荧光偏振实验测定方法，在具体测量体系中，采用5-fam标记的bid-bh3多肽为荧光标记分子，该分子能够与mcl-1蛋白发生特异性结合，其解离常数(kd)在30-60nm左右，二者结合后产生较高的极化值。如果所测试的目标化合物能够与靶蛋白进行结合，就会竞争性抑制bid与该蛋白结合，导致从而导致极化值降低，进而获得目标化合物竞争结合的量-效曲线，最终算出抑制常数ki。
[0036]
化合物的细胞活性的测试使用mtt检测方法，肿瘤细胞悬液(骨髓瘤细胞株km3、非小细胞肺癌h1299)和正常肝细胞株lo2分别接种于96孔板，每孔中加入含不同浓度化合物的培养基，经孵育后，用mtt染色，继续孵育后，于酶标仪上在570nm处测定每孔的吸光度od值，计算出细胞生长抑制率，从而确定化合物的活性。
[0037]
体外抑酶实验表明，本发明中的大部分化合物对于mcl-1蛋白有较强的抑制活性，其中，化合物a1、a8、a9等活性与阳性对照药umi-77相当，化合物a10对mcl-1蛋白的抑制活性高于阳性对照药umi-77。同时，体外抗肿瘤细胞增殖试验中，化合物a1、a8、a9和a10对骨髓瘤细胞株km3抑制活性较好，与阳性对照药at-101相当，有很大的开发前景，并可用于指导发现新型mcl-1蛋白抑制剂。
具体实施方式
[0038]
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。
[0039]
实施例1.5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮(1a)的合成将噻唑烷-2,4-二酮(1.17g，10mmol)缓慢加入到无水乙醇(80ml)中，室温搅拌溶解后，先后加入哌啶(0.8ml，8mmol)和4'-氯-联苯-4-甲醛(2.27g，10.5mmol)。然后在油浴中回流反应过夜。冷却至室温后，先加入200ml的蒸馏水，然后缓慢滴加2ml冰醋酸，室温搅拌30min。过滤收集沉淀物，用水洗涤，真空干燥，将所得固体通过甲醇进行重结晶，得到2.23g黄色结晶固体1a，收率为71％，mp:93-94℃。1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ12.65(s,1h),7.85(d,j＝8.5hz,3h),7.77(d,j＝8.5hz,2h),7.69(d,j＝8.0hz,2h),7.55(d,j＝8.5hz,2h).2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酸(2a)的合成将化合物1a(2.21g，7mmol)溶于100ml无水丙酮中，然后加入碳酸钾(1.93g，14mmol)和溴乙酸甲酯(1.3ml，14mmol)。将反应液转移至油浴中，回流搅拌过夜。冷却至室温后，过滤将滤液旋干，用甲醇进行重结晶得1.54g黄色固体，收率为59％。取1.24g溶于18ml冰醋酸中，溶解后加入4.5ml浓盐酸并将反应液转移至油浴。回流反应4h后，冷却过夜。过滤收集沉淀物，用水洗涤，真空干燥，得到1.12g黄色固体化合物2a，收率为94％，mp:100-101℃。1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ13.43(s,1h),8.04(s,1h),7.89(d,j＝8.5hz,2h),7.80-7.74(m,4h),7.56(d,j＝8.5hz,2h),4.41(s,2h).(s)-叔丁基(1-(3-硝基-4-氯苯磺酰胺基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基甲酸酯(4a)的合成冰浴条件下，将n-boc-l-苯丙氨酸3a(1.33g，5mmol)溶于30ml无水二氯甲烷中，然
后依次加入diea(1.75ml，10mmol)和hatu(2.29g，6mmol)。搅拌30min后，加入3-硝基-4-氯苯磺酰胺(1.3g，1.1mmol)。撤去冰浴，室温搅拌过夜，将溶剂旋干。然后用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤旋干后，经硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝8:1-6:1)分离纯化，得到1.96g的白色固体4a，收率为81％，mp:118-119℃。1h nmr(500mhz,cdcl
3-d6),δ10.22(s,1h),8.45(s,1h),8.17-8.25(m,1h),7.72(d,j＝8.5hz,1h),7.20-7.19(m,3h),7.03(d,j＝4.5hz,2h),5.16(s,1h),4.38(s,1h),3.04-3.00(m,1h),2.93-2.89(m,1h),1.38(s,9h).(s)-n-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(ljb-ii-20)(a1)的合成将一个关键中间体4a(0.58g，1.2mmol)溶于20ml氯化氢气体饱和的乙酸乙酯溶液，室温搅拌过夜后，将其过滤干燥，收集这一盐酸盐中间体备用。将另一个关键中间体2a(0.37g，1mmol)溶于20ml无水四氢呋喃中，并于-20℃下搅拌。每隔10min，先后加入n-甲基吗啉(0.24ml，2.2mmol)和氯甲酸异丁酯(0.2ml，1.5mmol)。继续搅拌1h后，加入备用的盐酸盐中间体，缓慢升至室温，搅拌过夜。将反应溶剂旋干，然后加入适量乙酸乙酯并转移到分液漏斗中，分别用1mol/l的盐酸溶液和饱和食盐水洗涤2遍，经过无水硫酸钠干燥，过滤旋干，再经过柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1-1:2)纯化分离得0.11g淡黄色固体a1，收率：14％，mp:208-209℃。1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ8.37(s,1h),8.18(s,1h),8.05-8.00(m,2h),7.89-7.84(m,3h),7.81-7.74(m,4h),7.57(d,j＝7.5hz,2h),7.12(s.3h),6.99(s,2h),4.32-4.27(m,3h),2.97(d,j＝8.5hz,1h),2.83(d,j＝6.0hz,1h).
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c nmr(125mhz,dmso-d6),δ166.80,165.18,164.14,146.47,140.59,137.56,133.17,132.62,132.21,131.52,130.85,129.30,129.03,128.58,127.65,127.42,125.92,124.48,121.08,56.17,43.26,37.61.实施例2.(s)-n-(4-甲基苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a2)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为20％，mp:228-229℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ12.44(s,1h),8.66(d,j＝7.0hz,1h),7.99(s,1h),7.88(d,j＝8.0hz,2h),7.79-7.73(m,6h),7.56(d,j＝8.0hz,2h),7.43(d,j＝7.5hz,2h),7.21-7.11(m,5h),4.52(d,j＝5.5hz,1h),4.30-4.20(m,2h),2.94-2.91(m,1h),2.73-2.69(m,1h),2.41(s,3h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ170.35,167.22,165.57,165.53,144.75,141.15,138.04,136.78,133.69,133.24,132.69,131.36,130.01,129.66,129.53,129.07,128.58,128.04,127.93,127.02,121.49,54.94,43.61,37.15,21.58.实施例3.(s)-n-(4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a3)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为26％，mp:238-239℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ12.63(s,1h),8.70(d,j＝7.5hz,1h),7.80(s,1h),7.90-7.87(m,4h),7.80(d,j＝8.0hz,2h),7.75-7.69(m,4h),7.57(d,j＝8.5hz,2h),7.21-7.11(m,5h),4.52-4.49(m,1h),4.31-4.22(m,2h),2.94-2.90(m,1h),2.76-2.72(m,1h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ170.59,167.24,165.61,165.58,141.15,139.20,138.25,138.04,136.68,133.70,133.27,132.69,131.37,130.00,129.75,129.65,129.53,129.07,128.58,127.92,
127.06,121.48,55.03,43.60,37.02.实施例4.(s)-n-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-甲基-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a4)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为25％，mp:195-196℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ8.40(s,1h),8.33(s,1h),8.07(d,j＝7.5hz,1h),7.99(s,1h),7.92(d,j＝8.0hz,1h)),7.86(d,j＝8.0hz,2h),7.73(d,j＝8.6hz,2h),7.67(d,j＝8.0hz,2h)),7.32(d,j＝7.5hz,2h),7.14-7.03(m,5h),4.31-4.23(m,3h),2.97-2.93(m,1h),2.82-2.78(m,1h),2.36(s,3h).
13
cnmr(125mhz,dmso-d6),δ170.81,170.21,167.25,165.58,165.55,144.61,141.16,139.77,138.05,136.27,133.69,133.24,132.70,131.90,131.39,129.95,129.54,129.10,128.04,127.95,121.50,120.29,54.74,43.65,36.53,21.59.实施例5.(s)-n-(4-甲基苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-甲基-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a5)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为45％，mp:251-252℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ12.46(s,1h),8.66(s,1h),7.99(s,1h),7.85-7.66(m,8h)),7.43-7.11(m,9h),4.51(s,1h),4.26(d,j＝11.5hz,2h),2.93-2.91(m,1h),2.73-2.70(m,1h),2.41(s,3h),2.36(s,3h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ170.35,167.29,165.61,165.56,144.77,142.53,138.33,136.78,136.67,136.32,133.45,132.04,131.36,130.19,130.02,129.67,128.59,128.05,127.66,127.14,127.04,120.97,54.93,43.60,37.14,21.58,21.21.实施例6.(s)-n-(4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a6)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为26％，mp:222-223℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ12.61(s,1h),8.50(d,j＝5.5hz,1h),7.93(s,1h),7.81-7.80(m,4h),7.70-7.66(m,4h),7.60(d,j＝8.5hz,2h),7.45-7.42(m,2h),7.37-7.34(m,1h),7.12-7.01(m,5h),4.41-4.37(m,1h),4.24-4.15(m,2h),2.88-2.84(m,1h),2.71-2.66(m,1h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ171.22,167.28,165.62,165.41,142.57,139.26,136.98,133.37,132.38,131.34,129.91,129.68,129.57,129.47,128.77,128.50,127.97,127.31,126.93,121.26,55.32,43.65,37.23.实施例7.(s)-n-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺(a7)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为22％，mp:232-233℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ8.70(d,j＝6.5hz,1h),8.49(d,j＝2.5hz,1h),8.12(dd,j1＝2.0hz,j2＝8.5hz,1h),8.02-8.00(m,2h),7.89(d,j＝8.5hz,2h),7.77-7.74(m,4h),7.52(t,j＝7.5hz,2h),7.44-7.41(m,1h),7.20-7.19(m,3h),7.12-7.11(m,2h),4.51-4.46(m,1h),4.30-4.23(m,2h),2.96-2.92(m,1h),2.82-2.77(m,1h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ171.22,167.29,165.67,165.62,147.51,142.58,139.54,139.26,136.65,133.40,132.87,132.38,131.37,131.14,129.68,129.59,128.79,128.54,128.00,127.33,127.05,125.61,121.23,55.24,43.57,36.94.
实施例8.(s)-n-(4-硝基苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-溴苯基)丙酰胺(a8)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为36％，mp:198-199℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ8.49(s,1h),8.36(d,j＝8.5hz,2h),8.08(d,j＝9.0hz,2h),8.00(s,1h),7.89(d,j＝8.0hz,2h),7.80(d,j＝8.5hz,2h),7.75(d,j＝8.0hz,2h),7.57(d,j＝8.5hz,2h),7.35(d,j＝8.0hz,2h),7.06(d,j＝8.0hz,2h),4.38(d,j＝6.0hz,1h),4.26(s,2h),2.95-2.91(m,1h),2.79-2.75(m,1h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ167.27,165.61,165.23,149.80,141.13,138.03,136.84,133.68,133.21,132.69,131.96,131.36,131.26,129.52,129.38,129.07,127.91,124.26,121.49,120.06,55.66,43.71,36.85.实施例9.(s)-n-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-溴苯基)丙酰胺(a9)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为37％，mp:232-233℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ8.44(s,1h),8.09(d,j＝8.5hz,1h),8.00(s,1h),7.94-7.88(m,4h),7.80(d,j＝8.5hz,2h),7.76(d,j＝8.5hz,2h),7.57(d,j＝8.5hz,2h),7.33(d,j＝8.5hz,2h),7.01(d,j＝8.0hz,2h),4.35-4.34(m,1h),4.27(s,2h),2.95-2.91(m,1h),2.80-2.76(m,1h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ166.72,165.07,164.77,146.74,140.60,140.56,137.51,136.17,133.15,133.07,132.67,132.64,132.26,132.17,131.43,130.82,130.68,128.97,128.51,127.36,124.83,120.96,119.64,55.08,43.20,36.25.实施例10.(s)-n-(4-硝基苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-甲基-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-溴苯基)丙酰胺(a10)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为39％，mp:211-212℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ12.87(s,1h),8.72(d,j＝7.0hz,1h),8.42(d,j＝8.5hz,2h),8.13(d,j＝8.5hz,2h),7.98(s,1h),7.86(d,j＝8.0hz,2h),7.73(d,j＝8.0hz,2h),7.67(d,j＝8.0hz,2h),7.40(d,j＝8.0hz,2h),7.32(d,j＝8.0hz,2h),7.11(d,j＝8.0hz,2h),4.50(dd,j1＝7.5hz,j2＝14.0hz,1h),4.25(s,2h),2.93-2.90(m,1h),2.77-2.73(m,1h),2.36(s,3h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ170.93,167.29,165.69,165.60,150.59,142.53,138.32,136.31,136.22,133.47,132.01,131.90,131.45,131.35,130.18,129.68,127.63,127.12,124.78,120.91,120.36,55.00,43.57,36.30,21.21.实施例11.(s)-n-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-溴苯基)丙酰胺(a11)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为17％，mp:178-179℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ8.40(s,1h),8.24(s,1h),8.06-8.01(m,2h),7.94-7.87(m,3h),7.77-7.74(m,4h),7.52-7.50(m,2h),7.44-7.41(m,1h),7.30(d,j＝7.0hz,2h),6.97(d,j＝7.0hz,2h),4.28(s,3h),2.95-2.92(m,1h),2.81-2.77(m,1h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ173.59,166.97,165.17,164.63,146.51,143.42,142.02,138.59,136.48,132.86,132.17,131.84,131.69,131.42,130.82,130.56,129.09,128.28,128.11,127.37,126.71,124.48,120.64,119.41,55.68,43.16,36.64.实施例12.(s)-n-(4-硝基苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-溴苯基)丙酰胺(a12)的合成
中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为22％，mp:184-185℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ12.79(s,1h),8.73(d,j＝7.5hz,1h),8.42(d,j＝9.0hz,2h),8.13(d,j＝8.5hz,2h),7.99(s,1h),7.89(d,j＝8.5hz,2h),7.77-7.74(m,4h),7.53(t,j＝7.5hz,2h),7.44-7.37(m,3h),7.11(d,j＝8.5hz,2h),4.50-4.46(m,1h),4.25(s,2h),2.93-2.90(m,1h),2.77-2.73(m,1h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ170.80,167.27,165.71,165.59,150.68,142.61,139.26,136.18,133.41,132.36,131.89,131.46,131.35,129.69,129.58,128.77,127.98,127.32,124.81,121.22,120.37,54.95,43.59,36.27.实施例13.(s)-n-(4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-溴苯基)丙酰胺(a13)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为55％，mp:174-175℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ12.62(s,1h),8.70(d,j＝7.5hz,1h),8.01(s,1h),7.89-7.84(m,4h),7.77-7.74(m,4h),7.71(d,j＝8.5hz,2h)7.53(t,j＝7.5hz,2h),7.44-7.38(m,3h),7.08(d,j＝8.5hz,2h),4.51(dd,j1＝8.0,j2＝13.5hz,1h),4.29-4.22(m,2h),2.91-2.87(m,1h),2.74-2.69(m,1h).
13
cnmr(125mhz,dmso-d6),δ169.81,166.80,165.20,165.10,142.08,138.80,138.74,137.60,135.61,132.91,131.85,131.38,130.93,130.87,129.51,129.27,129.09,128.28,127.48,126.82,120.72,119.89,54.24,43.10,36.20.实施例14.(s)-n-(4-甲基苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-溴苯基)丙酰胺(a14)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为18％，mp:182-183℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ12.43(s,1h),8.68(d,j＝6.5hz,1h),8.00(s,1h),7.89(d,j＝7.0hz,2h),7.77-7.75(m,6h),7.51-7-37(m,7h),7.07(d,j＝7.0hz,2h),4.51(s,1h),4.29-4.22(m,2h),2.90-2.88(m,1h),2.71-2.67(m,1h),2.42(s,3h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ169.61,166.79,165.10,144.26,142.08,138.74,136.16,135.71,132.88,131.85,131.38,130.91,130.86,129.49,129.08,128.28,127.55,127.48,126.82,120.73,119.82,54.18,43.13,36.00,21.09.实施例15.(s)-n-(4-硝基苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-氯-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-(4-溴苄氧基)苯基)丙酰胺(a15)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为15％，mp:189-190℃.1h nmr(500mhz,dmso-d6),δ8.67(d,j＝6.5hz,1h),8.41(d,j＝8.5hz,1h),8.14-8.10(m,1h),8.00-7.97(m,1h),7.89-7.85(m,2h),7.80-7.73(m,4h),7.60-7.55(m,4h),7.41-7.37(m,2h),7.16(d,j＝8.0hz,1h),7.06(d,j＝8.0hz,2h),6.94-6.81(m,3h),5.06-5.01(m,2h),4.44(d,j＝7.0hz,1h),4.25(s,2h),2.88-2.84(m,1h),2.73-2.68(m,1h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ166.74,165.09,164.91,156.79,140.64,140.60,137.53,136.60,136.56,133.18,132.76,132.73,132.17,131.29,130.86,130.25,129.66,129.03,128.57,127.41,124.06,120.94,120.84,114.34,68.24,55.18,43.13,35.85.实施例16.(s)-n-(4-硝基苯磺酰基)-2-(2-(5-((4'-甲基-[1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-(4-溴苄氧基)苯基)丙酰胺(a16)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为36％，mp:183-184℃.1h nmr(400mhz,dmso-d6),δ8.68(d,j＝7.2hz,1h),8.39(d,j＝8.8hz,2h),8.10(d,j＝8.8hz,
2h),7.95(s,1h),7.84(d,j＝8.0hz,2h),7.70(d,j＝8.0hz,2h),7.65(d,j＝8.0hz,2h),7.58(d,j＝8.4hz,2h),7.39(d,j＝8.4hz,2h),7.30(d,j＝8.0hz,2h),7.04(d,j＝8.4hz,2h),6.83(d,j＝8.0hz,2h),5.02(s,2h),4.44-4.38(m,1h),4.22(s,2h),2.86-2.81(m,1h),2.70-2.64(m,1h),2.33(s,3h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6),δ170.58,166.79,165.16,165.11,156.87,150.15,148.34,142.03,137.83,136.59,135.81,132.97,131.51,131.30,130.86,130.23,129.69,129.19,128.42,127.15,126.64,124.31,120.85,120.42,114.42,68.25,54.87,43.05,35.60,20.71.实施例17.(s)-n-(4-硝基苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-(4-溴苄氧基)苯基)丙酰胺(a17)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为31％，mp:155-156℃.1h nmr(400mhz,dmso-d6),δ12.86(s,1h),8.52(s,1h),8.35(d,j＝8.8hz,2h),8.06(d,j＝8.4hz,2h),7.96(s,1h),7.85(d,j＝8.0hz,2h),7.74-7.69(m,4h),7.57(d,j＝8.4hz,2h),7.49(t,j＝7.6hz,2h),7.41-7.36(m,3h),7.00(d,j＝8.4hz,2h),6.79(d,j＝8.4hz,2h),5.00(s,2h),4.34-4.31(m,1h),4.22(s,2h),2.86-2.81(m,1h),2.70-2.64(m,1h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6),δ171.06,167.23,165.66,165.58,157.16,150.68,147.43,145.61,141.18,138.04,133.70,133.27,132.67,131.38,130.81,129.70,129.54,129.22,129.09,128.61,127.94,124.84,124.07,121.44,114.97,68.41,55.36,43.57,36.10.实施例18.(s)-n-(4-硝基苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-(苄氧基)苯基)丙酰胺(a18)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为34％，mp:188-189℃.1h nmr(400mhz,dmso-d6),δ12.86(s,1h),8.72(s,1h),8.42(d,j＝7.2hz,2h),8.13(d,j＝7.2hz,2h),8.00(s,1h),7.89-7.75(m,6h),7.51-7.34(m,8h),7.07(d,j＝6.4hz,2h),6.86(d,j＝6.0hz,2h),5.06(s,2h),4.45(s,1h),4.26(s,2h),2.87-2.85(m,1h),2.73-2.68(m,1h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6),δ167.26,165.63,165.24,157.01,147.41,147.28,145.66,141.13,138.04,133.69,133.20,132.81,132.71,131.36,130.86,129.75,129.53,129.08,128.57,127.93,125.40,124.07,121.52,114.75,68.39,55.97,43.71,36.57.实施例19.(s)-n-(3-硝基-4-氯苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-(苄氧基)苯基)丙酰胺(a19)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为24％，mp:216-217℃.1h nmr(400mhz,dmso-d6),δ12.86(s,1h),8.73(d,j＝6.8hz,1h),8.53(d,j＝2.0hz,1h),8.14-8.12(m,1h),8.03-8.00(m,2h),7.89(d,j＝8.4hz,2h),7.77-7.73(m,4h),7.53-7.34(m,8h),7.05(d,j＝8.4hz,2h),6.86(d,j＝8.4hz,2h),5.06(s,2h),4.48(dd,j1＝7.2hz,j2＝13.6hz,1h),4.28(s,2h),2.90-2.86(m,1h),2.75-2.70(m,1h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6),δ171.10,167.29,165.71,165.62,157.64,147.53,142.59,139.26,137.60,133.46,133.40,132.87,132.38,131.36,131.32,130.74,129.59,128.90,128.78,128.66,128.27,128.12,127.99,127.32,125.69,121.25,114.84,69.61,55.40,43.58,36.10.实施例20.(s)-n-(4-硝基苯磺酰基)-2-(2-(5-(([1,1'-联苯]-4-基)亚甲基)-噻唑烷-2,4-二酮-3-基)乙酰胺基)-3-(4-(4-硝基苄氧基)苯基)丙酰胺(a20)的合成中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率为50％，mp:205-206℃.1h nmr
(400mhz,dmso-d6),δ12.88(s,1h),8.47(s,1h),8.37(d,j＝8.8hz,2h),8.28(d,j＝8.8hz,2h),8.09(d,j＝8.8hz,2h),7.99(s,1h),7.89(d,j＝8.4hz,2h),7.77-7.70(m,6h),7.53-7.49(m,2h),7.45-7.41(m,1h),7.04(d,j＝8.4hz,2h),6.85(d,j＝8.4hz,2h),5.23(s,2h),4.36-4.21(m,3h),2.92-2.87(m,1h),2.75-2.70(m,1h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6),δ167.30,165.65,165.20,156.98,149.83,147.41,145.67,142.56,139.24,133.34,132.36,131.34,130.85,129.92,129.58,129.41,128.78,128.57,127.96,127.31,124.31,124.06,121.23,114.82,68.39,56.03,43.70,36.62.目标化合物活性评价实验例1、目标化合物对mcl-1蛋白抑制试验(in vitro)实验试剂：n端用5-fam进行了荧光标记的bid-bh3多肽(5-fam-qediirniarhlaqvgdsmdrsippg)，溶于1
×
pbs；测试缓冲液：1
×
pbs；校正溶液：1nm fluorescein，10mm naoh；实验仪器：tecan genios pro型多功能酶标仪。
[0040]
实验步骤：(1)在测试缓冲液中加入靶蛋白和待测小分子化合物，混匀后室温避光孵育30min。再加入荧光标记的bid bh3多肽，使各溶液的总体积均为200μl，混匀后室温避光孵育20min。
[0041]
(2)将上述溶液及校正溶液各取60μl转移至黑色384孔板中(平行三组)，立即在酶标仪上进行荧光偏振的检测，以485nm为激发波长，535nm为发射波长，将校正溶液的荧光偏振值定为20mp。
[0042]
(3)所有化合物首先在三个典型浓度下(1μm、10μm、50μm)进行初筛，每个化合物在同一块板上做3个复孔的平行测定，极化值的测定结果取平均值。根据阴性对照、阳性对照以及受测化合物极化值的测定结果推算抑制率。测定中通常采用的靶蛋白浓度为300～500nm，荧光标记多肽采用5-fam-bid-bh3多肽，阳性化合物采用at-101。如果测试结果显示化合物在50μm浓度下抑制率大于50％，而且其抑制率在测试的三个浓度下表现出明显的剂量依赖关系，则认为该化合物与靶蛋白具有特异性结合，需要进一步测定比较准确的ic
50
数值。
[0043]
(4)对在初筛中显示出明显活性的化合物，在7个不同浓度下(1nm,10nm,100nm,1μm,10μm,50μm,100μm)进行完整结合曲线的测定。每个化合物均在同一块板上做3个复孔的平行测定，极化值测定结果取平均值。用graphpad prism软件处理数据和做图，得出该化合物的ic
50
值。
[0044]
(5)根据测量中所使用的蛋白总浓度、荧光多肽的总浓度、蛋白-多肽复合物的解离常数以及检测化合物的ic
50
值，使用下列文献中的计算方法得出检测化合物的竞争性抑制常数ki(nikolovska-coleska,z.；et al.development and optimization of a binding assay for the xiap bir3 domain using fluorescence polarization.anal biochem.2004,332,261-273).
实验结果见表2。
[0045]
表2.目标化合物对mcl-1蛋白体外抑制实验结果a表中数值为三次试验结果的平均值从表中可以看出，大部分化合物对mcl-1表现出亚微摩尔水平的抑制活性。当氨基酸为苯丙氨酸或4-溴苯丙氨酸，磺酰胺部分为4-氯-3硝基苯磺酰胺或4-硝基苯磺酰胺时，化合物对mcl-1蛋白抑制活性较好，如化合物a1、a4、a8、a9、a10和a11。其中，化合物a1、a4、a8、a9和a11对mcl-1的抑制活性于阳性药umi-77相当。此外，活性最高的化合物a10，表现出高于阳性对照药的抑制活性，对于进一步开发活性更高的mcl-1蛋白抑制剂以及制备预防和治疗因mcl-1蛋白表达异常导致的相关哺乳动物疾病的药物具有重要意义。
[0046]
实验例2.目标化合物抑制细胞增殖的活性试验(in vitro)从中选取酶活性较好的4个化合物进行体外抑制癌细胞增殖的活性试验，结果见表3。
[0047]
术语说明：骨髓瘤细胞株km3、非小细胞肺癌h1299和正常肝细胞株lo2。
[0048]
ic
50
：半数抑制浓度。
[0049]
材料:km3、h1299、lo2，四甲基偶氮唑蓝mtt，10％胎牛血清，96孔板方法：细胞培养细胞株采用常规培养。实验时均用对数生长期细胞。
[0050]
细胞生长检测(mtt法)将细胞悬液调整至5
×
104/ml(悬浮细胞调整至105/ml)，分别接种于96孔板(100μl/孔)，2000-5000个细胞/孔。铺板4h后，每孔中加入100μl含不同浓度化合物的培养基，每个浓度设三个复孔，不加细胞的孔读数时作空白，加细胞不加化合物的孔作化合物空白孔，umi-77作化合物阳性对照。于37℃，5％co2中孵育48h，每孔加入10μl 0.5％的mtt染色液，继续孵育。4h后，2500rpm，离心30min，然后抛弃板孔中培养基，每孔加入150μl dmso，37℃恒温震摇5-10min。酶标仪上于570nm处测定每孔的吸光度od值，细胞生长抑制率按下式计算：
表3化合物a1、a8、a9和a10的抗肿瘤细胞增殖实验结果a表中数值为三次试验的平均值，
“±”
后的数值表示标准偏差对酶活性较好的4个化合物进行km3、h1299两种肿瘤细胞和正常肝细胞株lo2的体外抗增殖活性实验。测试数据表明，测试的4个目标化合物对于两株肿瘤细胞均有抑制作用，特别是km3细胞。同时，这4个化合物对正常细胞的生长几乎没有影响。并且它们对km3细胞的抑制活性与阳性对照umi-77相当，表明取代3-噻唑烷-2,4-二酮类mcl-1蛋白抑制剂具有良好的开发前景，可进行深入的活性研究，开发出更有活性的化合物用于制备预防和治疗因mcl-1蛋白表达异常导致的相关哺乳动物疾病的药物。