一种多孔纳米金传感器

1.本发明涉及免疫传感器领域，特别涉及一种多孔纳米金传感器。


背景技术：

2.肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一。甲胎蛋白抗原为重要的肿瘤标志物之一。
3.免疫传感器是将高灵敏度的传感器技术与特异性免疫反应结合起来，用以监测抗原-抗体反应的生物传感器。其基本的工作原理是：采用电化学检测方法来检测标记的免疫试剂或一些由酶、金属离子和其他活性物质标记的标记物，从而对疾病诊断或病人状态检测中复杂体系的多组分混合物进行分析，提供有力的数据。由于电流性免疫传感器的高选择性、高灵敏度等特点，其应用越来越广泛。
4.现有公开号为cn203965377u的中国专利，其公开了一种电化学免疫传感器，其电极表面的中心有抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，所述抗体优选单克隆抗体，所述传感器优选含有双层纳米金膜，其电极优选玻碳电极，是以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶(hrp)复合物固定于电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，构建双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器。
5.上述的这种电化学免疫传感器可以用来检测食品中沙门氏菌和/或志贺氏菌，能够对沙门氏菌和/或志贺氏菌实现快速定量检测；但是上述的这种电化学免疫传感器依旧存在着一些缺点，如：无法在一定程度上分析检测抗原浓度的大小，且该传感器选择性差、灵敏度不高。


技术实现要素：

6.针对背景技术中提到的问题，本发明的目的是提供一种多孔纳米金传感器，以解决背景技术中提到的问题。
7.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
8.一种多孔纳米金传感器，包括多孔纳米金电极、参比电极和对电极，所述多孔纳米金电极的表面设置有l-半胱氨酸层、戊二醛层、鼠抗甲胎蛋白抗体层和小牛血清蛋白层，所述小牛血清蛋白层的表面滴加有甲胎蛋白抗原层，所述甲胎蛋白抗原层表面设置有过氧化氢酶标记的鼠抗甲胎蛋白二抗层。
9.较佳的，所述参比电极为银/氯化银参比电极。
10.较佳的，所述对电极为铂对电极。
11.较佳的，所述多孔纳米金电极连接有绿色接头，所述参比电极连接有白色接头，所述对电极连接有红色接头。
12.较佳的，所述鼠抗甲胎蛋白二抗为经过磷酸缓冲溶液清洗的鼠抗甲胎蛋白二抗。
13.综上所述，本发明主要具有以下有益效果：
14.本发明选择了多孔纳米金电极作为工作电极，同时将l-半胱氨酸层连接在多孔纳
米金电极的表面，并在其表面交联有戊二醛层、鼠抗甲胎蛋白抗体层，并利用小牛血清蛋白层封闭了多孔纳米金电极上的非特异性位点，阻碍了抗原与金电极上的点位的进一步结合。利用鼠抗甲胎蛋白抗体层与甲胎蛋白抗原层的特异性吸附，甲胎蛋白抗原层与过氧化氢酶标记的鼠抗甲胎蛋白二抗层的连接，然后催化过氧化氢氧化底物，即可检测出生成物的电化学信号，从而能够间接获知抗原浓度与响应电流之间的关系。该免疫传感器具有制作简单、操作便捷、选择性好、灵敏度高和响应快等特点。
附图说明
15.图1是对氨基酚的催化产物的机理图；
16.图2是过氧化氢氧化对氨基酚的机理图；
17.图3是过氧化氢氧化邻苯二胺的机理图；
18.图4是底物浓度配比分析图；
19.图5是免疫电极在修饰过程中的交流阻抗谱图；
20.图6是酶催化反应产物的差分脉冲伏安(dpv)图之一；
21.图7是酶催化反应产物的差分脉冲伏安(dpv)图之二；
22.图8是抗原浓度为50ng/ml的差分脉冲伏安(dpv)图；
23.图9是对氨基苯酚催化氧化的dpv响应电流线性关系；
24.图10是邻苯二胺催化氧化的dpv响应电流线性关系；
25.图11抗原浓度为0.1ng/ml时的dpv图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1
28.参考图1-图11，一种多孔纳米金传感器，包括多孔纳米金电极、参比电极和对电极，多孔纳米金电极的表面设置有l-半胱氨酸层、戊二醛层、鼠抗甲胎蛋白抗体层和小牛血清蛋白层，小牛血清蛋白层的表面滴加有甲胎蛋白抗原层，甲胎蛋白抗原层表面设置有过氧化氢酶标记的鼠抗甲胎蛋白二抗层。
29.其中，参比电极为银/氯化银参比电极。
30.其中，对电极为铂对电极。
31.其中，多孔纳米金电极连接有绿色接头，参比电极连接有白色接头，对电极连接有红色接头。
32.其中，鼠抗甲胎蛋白二抗为经过磷酸缓冲溶液清洗的鼠抗甲胎蛋白二抗。
33.综上分析可知：本发明选择了多孔纳米金电极作为工作电极，同时将l
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半胱氨酸层连接在多孔纳米金电极的表面，并在其表面交联有戊二醛层、鼠抗甲胎蛋白抗体层，并利用小牛血清蛋白层封闭了多孔纳米金电极上的非特异性位点，阻碍了抗原与金电极上的点位的进一步结合。利用鼠抗甲胎蛋白抗体层与甲胎蛋白抗原层的特异性吸附，甲胎蛋白抗
原层与过氧化氢酶标记的鼠抗甲胎蛋白二抗层的连接，然后催化过氧化氢氧化底物，即可检测出生成物的电化学信号，从而能够间接获知抗原浓度与响应电流之间的关系。该免疫传感器具有制作简单、操作便捷、选择性好、灵敏度高和响应快等特点。
34.实施例2
35.参考图1-图11，本实施例重点说明多孔纳米金电极的制备流程，流程如下：
36.1、先将沉积好的金电极泡入60％的硝酸溶液后，于50℃的烘箱中反应2 个小时，拿出后用二次水清洗，(去合金法)；
37.2、在沉积液中，以金电极为工作电极，ag-agcl电极为参比电极，pt电极为对电极，电化学工作站恒电位沉积，选择电流-时间曲线，设置好参数，当恒电位q达到0.05c时，停止沉积；其中沉积液的组成为：
38.0.05mol/l的kag(cn)2，
39.0.05mol/l的kau(cn)2，
40.0.2mol/l的na2co3；
41.3、将普通金电极表面在氧化铝粉上打磨抛光，先乙醇超声后，再用二次水超声。
42.实施例3
43.参考图1-图11，本实施例重点说明本传感器的具体实验使用方法：
44.1、在5ml离心管中加入0.5ml 4.0
×
10-3mol/l的h2o2溶液、0.5ml的ph 7.2的磷酸缓冲液、0.1ml 1.0
×
10-2mol/l的对氨基酚溶液和0.2ml 1.0
ꢀ×
10-2mol/l的邻苯二胺溶液，然后放入制备好的免疫传感器，在37℃的电热恒温鼓风干燥箱中反应1h；
45.2、将催化溶液立即转移到小烧杯中进行电化学检测即循环伏安法，差分脉冲伏安法，用三电极进行检测；
46.其中实验思路如说明书附图1：
47.其中说明书附图1中的对氨基酚的催化产物是3,4-双((4-羟苯基)氨基)-6-((4-羟苯基)亚氨基)环己-2,4-二烯酮；邻苯二胺的催化产物是2,3
‑ꢀ
二氨基吩嗪。
48.其中过氧化氢氧化对氨基酚的机理见说明书附图2；
49.其中过氧化氢氧化邻苯二胺的机理见说明书附图3。
50.参考说明书附图4，从图中的实验谱图可以看出，当浓度配比为1:2时，图中的两处的峰的高度几乎在同一水平线。所以选用对氨基酚：邻苯二胺的浓度比例为1:2的条件。
51.参考说明书附图5，在表面修饰了l-半胱氨酸，戊二醛以及连接一抗后，其半圆形直径明显增加，且其斜率也有相应的增加。至此，说明了l-半胱氨酸，戊二醛和一抗已经成功的吸附在电极表面。
52.参考说明书附图6，在图中明显可以看到图的下方有两个明显的氧化峰。故在本实验的dpv测试中选择的是氧化峰的测试。
53.参考说明书附图7，查得相关文献，2,3-二氨基吩嗪的氧化峰电位为 0.4 v，而3,4-双((4-羟苯基)氨基)-6-((4-羟苯基)亚氨基)环己-2,4-二烯酮的氧化峰电位在 0.20v。从右图中可看出在 0.187v和 0.364v出现了两个氧化峰。与文献的差异可能因为电极和ph的不同。
54.参考说明书附图8，多孔金电极在响应电流强度上相对于普通金电极有明显提高。
55.参考说明书附图9，对于对氨基酚，在抗原浓度1-120ng/ml内存在一定的线性关
系，线性曲线为ip(μa)＝0.03895c(ng/ml) 2.60577，r＝0.9804。
56.参考说明书附图10，对于邻苯二胺，在抗原浓度1-100ng/ml内存在一定的线性关系，线性曲线为ip(μa)＝0.02705c(ng/ml) 4.57417，r＝0.9973。
57.参考说明书附图11，按信噪比(s/n)＝3，得出甲胎蛋白浓度0.1ng/ml 为其检出限。
58.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。