一种水体中麻痹性贝类毒素的检测方法

1.本发明属于水体检测技术领域，具体涉及一种水体中麻痹性贝类毒素的检测方法。


背景技术：

2.随着气候变暖和人类活动影响的加剧，全球范围内有害藻发生的范围和强度明显上升。由有害藻产生和释放的生物毒素按溶解性可分为脂溶性贝类毒素和水溶性贝类毒素，它们对全球饮用水和渔业资源、公共健康、淡水和近海生态系统服务等都造成严重危害。其中，麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish toxin，pst)是一类典型的高极性的水溶性藻毒素，可以由淡水蓝藻与海洋产毒微藻产生，且这些产毒藻在全球淡水水域以及沿海水域都广泛分布。pst可以在鱼类、甲壳类、双壳类等渔业生物中大量积累，因此即使pst在水环境中的浓度比较低，仍可通过食物链导致人类中毒甚至死亡。据报道，在世界范围内由染毒贝类引起的人类中毒事件中，约87％是由pst造成的，且死亡率超过15％。所以pst是迄今为止发现的对海洋渔业危害最大的海洋贝类毒素。因此，实现水环境中pst的痕量检测对水质监管和污染预警十分重要，尤其是针对水产养殖水域。
3.目前，固相萃取结合液质联用技术是测定pst最先进的方法，但这些方法大都针对高浓度样品，如染毒贝类或产毒藻类，而针对浓度水平较低的水体样品，检测方法尚不成熟。这是因为pst有较强的亲水性以及丰富的化学多样性，所以水体中pst的富集和测定更加困难。目前水体中pst检测方法具有以下局限性：仅实现了对水体中某几种pst的测定，方法所覆盖pst的种类仍不能满足对天然水体中各类常见pst进行全面分析的要求(calado et al.,2017；li et al.,2021；riccardi et al.,2018)；方法灵敏度低，检出限多在μg/l级别，难以满足水体中痕量pst的检测要求，从而无法预测风险(bosch-orea et al.,2021)；需要对大体积(400-1000ml)水样进行浓缩富集，这不仅使采样工作变得繁重，也为后续的分析过程引入更多的基质干扰(zervou et al.,2017；haddad et al.,2019)。综上所述，现有检测方法尚需进一步完善。因此，有必要建立一种能够灵敏、准确的测定环境水体中多种pst的分析方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种水体中麻痹性贝类毒素的检测方法。该方法通过固相萃取结合亲水相互作用色谱串联质谱技术实现了能够一次性同步检测出环境水体中13种麻痹性贝类毒素。
5.本发明是通过以下技术方案实现的：
6.一种水体中麻痹性贝类毒素的检测方法，包括以下步骤：
7.步骤一：对采集的水样进行过滤预处理；
8.步骤二：对步骤一获得的水样进行初次固相萃取，得到的待检测的洗脱液；
9.步骤三：采用检测系统对步骤二得到的待检测洗脱液进行检测；
10.所述检测系统包括上样泵、进样器、spe柱、六通阀、分析泵、分析柱和质谱仪，上样泵的进口端与流动相a和流动相b连通，采用zic-hilic保护柱用作所述spe柱，采用hilic-z色谱柱用作所述分析柱；所述上样泵的出口端与进样器的进口连接，进样器的出口连接六通阀的第四接口，分析泵的进口端与流动相a和流动相b连通，分析泵的出口端与六通阀的第一接口连接，六通阀的第二接口连接分析柱的一端，分析柱的另一端连接质谱仪，六通阀的第三接口连接spe柱的一端，六通阀的第六接口连接spe柱的另一端，六通阀的第五接口作为废液出口；所述流动相a是水，流动相b是乙腈水溶液；
11.首先，将六通阀设置为加载位置p1，此位置下，六通阀的第四接口和第三接口导通，第五接口和第六接口导通，使上样泵、进样器、六通阀的第四接口、六通阀的第三接口、spe柱、六通阀的第六接口、六通阀的第五接口依次形成通路，向进样器中注入分析的洗脱液，以流动相b作为样品加载流动相，通过上样泵将待分析的洗脱液加载到spe柱上；
12.之后将六通阀切换到洗脱位置p2，此位置下，六通阀的第四接口和第五接口导通，六通阀的第一接口和第六接口导通，第二接口和第三接口导通，使分析泵、六通阀的第一接口、六通阀的第六接口、spe柱、六通阀的第三接口、六通阀的第二接口、分析柱、质谱仪依次形成通路，分析泵将spe柱捕集的目标化合物以反冲洗模式洗脱到分析柱上，进行色谱分离；与此同时，利用六通阀的第四接口和第五接口导通，上样泵提高流速冲洗整个进样器，去除前一次进样产生的样品残留；
13.之后将六通阀切换回p1位置，对spe柱进行等度洗脱进一步去除样品残留，对分析柱进行梯度洗脱使目标物得以分离，进入质谱仪检测。
14.在上述技术方案中，步骤一中，采用0.45μm的玻璃纤维膜进行现场过滤，去除悬浮颗粒物和浮游生物；过滤后的样品装于聚乙烯样品瓶内。
15.在上述技术方案中，步骤二中，采用多孔石墨化炭固相萃取柱对步骤一获得的水样进行固相萃取。
16.在上述技术方案中，步骤二中，包括以下步骤：
17.2.1，依次用二氯甲烷、甲醇和水对多孔石墨化炭固相萃取柱进行活化与平衡处理；
18.2.2，将80ml的水样加载到多孔石墨化炭固相萃取柱上，以使水样中的pst留在多孔石墨化炭固相萃取柱上；
19.2.3，加载结束后，用水淋洗多孔石墨化炭固相萃取柱以去除盐分与杂质；然后，用4ml含0.03％甲酸的乙腈溶液对多孔石墨化炭固相萃取柱进行洗脱，得到洗脱液；
20.2.4，向收集到的洗脱液中加入8μl的浓度为1mol/l的甲酸铵溶液，将洗脱液中的甲酸铵浓度调节为2mmol/l，再经过滤器过滤后，得到待检测的洗脱液。
21.在上述技术方案中，步骤二中，如果待检测的水样为淡水，向淡水中添加一定量的nacl，使待检测水样发生盐析效应以增强pst在萃取柱上的富集。
22.在上述技术方案中，步骤二中，如果待检测的水样为淡水，向80ml的淡水水样中添加3％(w/v)nacl。
23.在上述技术方案中，步骤三中，所述流动相b是90％乙腈水溶液，流动相a和流动相b二者均含2mmol/l甲酸铵，0.03％甲酸。
24.在上述技术方案中，步骤三中，以100％的流动相b作为样品加载流动相，通过上样
泵将待分析的洗脱液加载到spe柱上；以90％的流动相b和10％的流动相a将spe柱捕集的目标化合物以反冲洗模式洗脱到分析柱上。
25.在上述技术方案中，步骤三中，质谱检测条件为：采用正负离子同时扫描，在多反应监控(mrm)模式下对目标物进行定性定量分析；一级、二级质谱分辨率分别采用wide和unit模式；喷射流电喷雾电离源的优化电离参数如下：干燥气温度，300℃；鞘气温度，320℃；干燥气流量，8l/min；鞘气流速，11l/min；雾化器压力，20psi；正负模式下毛细管电压：3500v。
26.本发明的优点和有益效果为：
27.本发明通过固相萃取结合亲水相互作用色谱串联质谱技术实现了环境水体中pst的高效、灵敏检测，一次进样即可分析13种pst，方法检出限为0.13
–
4.1ng/l。
28.本发明采用多孔石墨化炭柱对水体中13种pst进行初次固相萃取，多孔石墨化炭材料主要通过吸附与极性相互作用实现对目标物的萃取，净化效果好，整体回收率高。并且，向淡水水样中添加一定量的nacl，使待检测水样发生盐析效应以增强pst在萃取柱上的富集，提高了对目标物的萃取效率。此外，本发明的方法只需要80ml水样，不仅减少了前处理时间，也降低了基质干扰。
29.本发明选用两性离子亲水相互作用色谱(zic-hilic)保护柱作为固相萃取(spe)柱，对样品进行进一步的富集净化。zic-hilic固定相提供了弱静电相互作用的位点，因此除了极性分配，离子相互作用也是高极性化合物的保留机制，所以对pst有较强的保留能力。通过系统优化固相萃取的各项条件，实现了对13种pst的有效提取，进一步降低基质干扰，并确保了与后续色谱分离条件的兼容性。同时，本发明采用hilic-z色谱柱作为分析柱，它能与zic-hilic保护柱良好兼容。此外，本发明通过合理优化流动相组成、洗脱梯度、六通阀设置和质谱参数，能够在17分钟内实现了对13种pst的有效分离，并具有良好的峰形、重现性和稳定性。
附图说明
30.图1是本发明实施例一的移载机构的立体结构示意图。
31.图2是比较不同加载流动相(a)和洗脱流动相(b)条件下pst在spe柱上的保留与洗脱情况(图中，前5min进行样品加载，5min后对目标物进行洗脱)。
32.对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
33.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
34.实施例一
35.一种水体中麻痹性贝类毒素(pst)的检测方法，包括以下步骤：
36.步骤一：样品预处理
37.对采集的淡水样品和海水样品都采用0.45μm的玻璃纤维膜进行现场过滤，去除悬浮颗粒物和浮游生物；过滤后的样品装于聚乙烯样品瓶内，置于4℃的条件下保存，从而得
到待检测的样品。将样品带回实验室，待检测。
38.步骤二：初次固相萃取
39.采用多孔石墨化炭固相萃取柱(型号为：envi-carbtm,250mg,6ml,supelco)对步骤一获得的待检测的样品进行固相萃取。具体流程如下：
40.2.1，依次用5ml二氯甲烷、5ml甲醇和5ml水以2ml/min的流速对多孔石墨化炭固相萃取柱进行活化与平衡处理；
41.2.2，将80ml的海水样品或添加3％(w/v)nacl的淡水样品以1ml/min流速加载到多孔石墨化炭固相萃取柱上，以使样品中的pst留在多孔石墨化炭固相萃取柱上。
42.需要说明的是，如果待检测的样品为淡水，需要向淡水中添加一定量的nacl，从而使待检测样品能够发生盐析效应，盐析效应能够增强pst在萃取柱上的富集，即水分子在离子盐分子周围形成水合球，降低了水分子用于溶解分析物的可用性。本发明通过试验发现，在0-3.5％(w/v)nacl添加范围内，stx、neo、dcstx和dcneo等麻痹性贝类毒素(pst)受盐析效应的影响比较大，其富集效率显著提高，因此本发明最终选择了3％的nacl添加量。
43.此外，需要说明的是，样品加载量可以直接影响目标分析物(即pst)的富集因子，目前现有技术中通常是通过增加上样量来提高富集因子，本发明考察了20、50、80、140和200ml样品加载量下目标分析物的信号强度，发现随着上样量的增加，gtx5、stx和neo等麻痹性贝类毒素(pst)的信号强度先增加后减小。原因是样品加载体积过大(》80ml)会导致吸附不良的pst从萃取柱上提前被洗脱下来，从而导致富集效率严重下降。此外，较大的上样量会引入更多的基质干扰，从而降低后续质谱检测的灵敏度。所以对于pst，不能一味的通过增加样品量来提升检测灵敏度。因此，本发明选择了80ml的样品加载体积，以实现各种痕量pst的良好回收率和精密度。
44.2.3，加载结束后，用4ml纯水淋洗多孔石墨化炭固相萃取柱以去除盐分与其它杂质；然后，用4ml乙腈(含0.03％甲酸，v/v)以1ml/min流速对多孔石墨化炭固相萃取柱上的pst进行洗脱，得到4ml洗脱液。
45.2.4，向收集到的4ml洗脱液中加入8μl的甲酸铵溶液(1mol/l)，将洗脱液中的甲酸铵浓度调节为2mmol/l，经0.22μm针式过滤器过滤至进样小瓶中，从而得到待检测的洗脱液，
–
20℃条件下避光保存。
46.步骤三：采用固相萃取结合亲水相互作用色谱串联质谱仪检测系统(以下简称为检测系统)对步骤二得到的待检测洗脱液进行检测。
47.检测系统的示意图如图1所示，该检测系统包括一个上样泵(采用四元泵)、进样器、spe柱、六通阀、分析泵(采用二元泵)、分析柱和配备喷射流电喷雾电离(ajs-esi)源的质谱仪，上样泵的进口端与流动相a和流动相b连通，上样泵的出口端与进样器的进口连接，进样器的出口连接六通阀的第四接口，分析泵的进口端与流动相a和流动相b连通，分析泵的出口端与六通阀的第一接口连接，六通阀的第二接口连接分析柱的一端，分析柱的另一端连接质谱仪，六通阀的第三接口连接spe柱的一端，六通阀的第六接口连接spe柱的另一端，六通阀的第五接口作为废液出口。
48.本发明采用zic-hilic保护柱(规格为2.1mm
×
20mm,3.5μm，merck)用作所述spe柱，采用hilic-z色谱柱(规格为2.1mm
×
50mm,1.9μm,agilent)用作所述分析柱。
49.所述流动相a是水，流动相b是90％乙腈水溶液，二者均含2mmol/l甲酸铵，0.03％
甲酸。
50.首先，将六通阀设置为加载位置p1(图1)，此位置下，六通阀的第四接口和第三接口导通，第五接口和第六接口导通，从而使上样泵、进样器、六通阀的第四接口、六通阀的第三接口、spe柱、六通阀的第六接口、六通阀的第五接口依次形成通路，向进样器中注入500μl待分析的洗脱液，以流动相b作为样品加载流动相(即100％的流动相b和0％的流动相a)，通过上样泵(四元泵)将500μl待分析的洗脱液加载到spe柱上，加载流速为0.8ml/min；
51.加载6min后将六通阀切换到洗脱位置p2(图1)，此位置下，六通阀的第四接口和第五接口导通，六通阀的第一接口和第六接口导通，第二接口和第三接口导通，从而使分析泵、六通阀的第一接口、六通阀的第六接口、spe柱、六通阀的第三接口、六通阀的第二接口、分析柱、质谱仪依次形成通路，分析泵选择90％的流动相b和10％的流动相a将spe柱捕集的目标化合物以反冲洗模式洗脱到分析柱上，进行色谱分离；与此同时，利用六通阀的第四接口和第五接口导通，上样泵提高流速以2.0ml/min的速度冲洗整个进样器，以去除前一次进样产生的样品残留。
52.2min后将六通阀切换回p1位置，对spe柱进行等度洗脱进一步去除样品残留，对分析柱进行梯度洗脱使目标物得以分离，随后进入质谱仪检测。详细的洗脱程序和六通阀位置如表1所示。
53.需要说明的是，在本步骤中，本发明进行了如下优化：
54.首先，为了实现pst的固相萃取，选择zic-hilic保护柱作为spe柱。这种两性离子hilic固定相由于离子和反离子在其官能团内以平衡的比例靠近，因此提供弱静电相互作用的场所，从而更容易通过调控流动相来提高对高极性化合物的保留能力。
55.然后，为了实现固相萃取体系与色谱分离体系的兼容，对分析柱进行了筛选。亲水相互作用色谱(hilic)柱对pst有很好的保留和分离效果，保留机制涉及极性化合物与固定相表面的停滞水相的亲水相互作用，以及离子交换相互作用。但hilic柱若想与zic-hilic保护柱兼容，前提是该分析柱对目标物的保留性能要大于zic-hilic保护柱。我们经过研究发现，hilic-z色谱柱与zic-hilic保护柱良好兼容，重现性和稳定性较好。因此，hilic-z色谱柱是一款理想的能与zic-hilic保护柱相结合检测各种pst的分析柱。
56.由于本发明采用的spe柱和分析柱都是hilic柱，都需要高百分比的有机相作为初始流动相，以实现目标物在柱上的保留。因此，为确保两柱兼容，需要仔细确定在spe柱的加载和洗脱流动相的组成，结果如图2所示，以95％和90％的流动相b加载样品时，会出现峰分叉以及目标物提前洗脱的问题，最终选择100％的流动相b作为样品加载流动相。当目标物从spe柱洗脱到分析柱时，流动相仍然需要保持高百分比有机相，因此，选择90％的流动相b进行洗脱。经测试，只有在反向洗脱的情况下，以90％的流动相b才能将所有pst从spe柱上快速洗脱下来，并成功加载和保留在分析柱上，从而保证峰形良好。因此，选择90％的流动相b和10％的流动相a作为spe柱的洗脱流动相和分析柱的初始加载流动相，并采用反向洗脱模式。
57.表1
[0058][0059][0060]
进一步的说，本发明采用的质谱检测条件为：采用正负离子同时扫描，在多反应监控(mrm)模式下对目标物进行定性定量分析。一级、二级质谱分辨率分别采用wide和unit模式。ajs-esi源的优化电离参数如下：干燥气温度，300℃；鞘气温度，320℃；干燥气流量，8l/min；鞘气流速，11l/min；雾化器压力，20psi；正负模式下毛细管电压：3500v。mrm离子对以及碎裂电压和碰撞能量如表2所示。使用agilent masshunter b 08软件处理数据。
[0061]
表2
[0062]
[0063][0064]
*:定量离子
[0065]
实施例二
[0066]
本实施例对本发明实施例一的检测方法进行实验验证。
[0067]
(1)线性关系考察
[0068]
由于环境水体基质复杂，为了抵消基质效应，使用基质匹配的标准溶液研究了线性。一系列基质匹配标准溶液的配制：13种常见pst标准品，包括gtx1、gtx2、gtx3、gtx4、gtx5、dcgtx2、dcgtx3、c1、c2、stx、dcstx、neo和dcneo均购自加拿大国家研究委员会(halifax,nova scotia,canada)。准确移取适量各标准溶液，用90％乙腈水溶液(含0.03％甲酸)配置成混标储备液。用空白水样连续稀释混标储备液，得到一系列浓度梯度的基质匹配标准溶液。采用步骤二的初次固相萃取处理后，在步骤三的最终测定条件下，按浓度从低到高的顺序依次进样分析。通过将每种分析物的峰面积与浓度作图来构建校准曲线，得线性回归方程和相关系数(r2)，用于评估线性度。
[0069]
(2)回收率考察
[0070]
向空白水样中加入pst标准品gtx1、gtx2、gtx3、gtx4、gtx5、dcgtx2、dcgtx3、c1、c2、stx、dcstx、neo和dcneo，最终浓度分别为53.91、16.12、24.85、8.1、35.27、10.36、45.15、17.16、21.13、10.34、12.34、25.49和10.15ng/l。采用基质匹配标准曲线计算空白加
标样品中目标物的检测浓度，通过计算检测浓度与实际浓度的比值得到所有pst的回收率。
[0071]
(3)检出限与定量限测定
[0072]
通过检测一系列低浓度基质匹配的标准溶液确定方法检测灵敏度。以定量离子的信噪比s/n≥3确定检测限(lod)，以定量离子的s/n≥10确定定量限(loq)。
[0073]
表3淡水中13种pst测定方法的线性、回收率、lod和loq的测试结果
[0074][0075][0076]
表4海水中13种pst测定方法的线性、回收率、lod和loq的测试结果
[0077][0078]
实施例三
[0079]
实际检测案例
[0080]
(1)样品采集
[0081]
莱州湾是渤海三大海湾之一，面积超过6000平方公里，是中国许多渔业物种的重要产卵和育苗地。2021年4月在中国莱州湾共采集了41个表层海水样本。海水样品立即通过0.45μm的玻璃纤维膜进行现场过滤，过滤后的水样在分析前存放在的聚乙烯瓶中，于4℃以下储存。
[0082]
(2)样品检测与结果
[0083]
采用步骤二的方案对水样进行初次固相萃取得到待检测的洗脱液，随后采用步骤三的方案对待检测洗脱液进行进一步富集和检测，检测结果如表5所示。由于方法灵敏度的提升，在41个海水样本中共检测到11种常见的pst，证明了pst在近岸养殖海域的广泛存在。这是首次对我国大面积养殖海域进行的系统调查。多种pst的普遍检出表明中国近岸海水面临pst污染的威胁，同时也验证了该方法的实用性与可行性，这将为中国近海养殖区海水中pst的监测和预警提供技术支撑。
[0084]
表5莱州湾表层海水样品中pst的检测结果
[0085]
[0086][0087]
[0088][0089]
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。