核酸修饰的超顺磁性光子晶体传感材料、制备方法和应用

1.本发明属于基于核酸生物化学反应的超顺磁性光子晶体传感材料领域，尤其涉及核酸修饰的超顺磁性光子晶体传感检测材料、制备方法和应用。


背景技术：

2.光子晶体(photonic crystals，pcs)是指由2种或2种以上具有不同折射率(即介电常数)的材料在空间中周期性有序排列形成的一类材料。当光子禁带的范围位于可见光范围内，不能传播的电磁波会发生相干衍射和反射，被人眼感知到，就是光子晶体的结构色(structural colors)。光子晶体传感材料已被广泛应用在微生物毒素检测、营养物质检测、空芯光子晶体光纤、光子晶体激光器、金属离子和有机化合物检测等食品科学、物理科学和环境科学等领域。
3.但传统构型的光子晶体凝胶膜等材料难于修饰核酸等大分子物质，无法实现一些生物学、免疫学方面的研究，此外其作为传感材料进行痕量物检测时，选择性和灵敏度也较差，因此需要寻找新的技术和方法进行结合来解决上述难题。
4.现阶段已有大量的方法测定金属ag

等痕量物质，如电热原子吸收光谱法、伏安法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱和电位测定法等。ag

检测方法各有不同，但这些检测方法仍存在仪器昂贵、操作费时、需专业人员操作，检测成本高等缺点。这给技术普及带来很大的困难，而且不适用于现场基层操作。为了实现金属银离子高效快速、高灵敏度、简洁方便、低成本的可视化现场实时检测，需要进一步的研究和探索。


技术实现要素：

5.为解决背景技术中的问题，本发明提供了核酸修饰的超顺磁性光子晶体传感材料、制备方法和应用，通过将光子晶体技术和超顺磁性纳米微球技术二者结合，通过氨基基团修饰超顺磁性纳米微球，利用静电作用直接吸附核酸基团(dna探针)于超顺磁性纳米微球表面。该超顺磁性纳米微球可通过外加磁场自组装成光子晶体材料，该材料用于重金属等痕量物检测时，可提高检测灵敏度和选择性，并且实验结果为肉眼可见的色变反应，最终实现可视化光子晶体材料的制备和可视化快速检测痕量目标物。
6.核酸修饰的超顺磁性光子晶体传感材料的制备方法，其步骤如下：
7.步骤一：制备磁性纳米微球
8.先量取100ml乙二醇，倒入20ml于烧瓶中，后直接称取1.95g无水三氯化铁于烧瓶中，并把量筒中剩余的乙二醇倒入烧瓶，盖上空心塞，用搅拌桨搅拌溶解；
9.再用称量纸称取9.0g无水醋酸钠，倒入烧瓶中搅拌溶解，称取3.0g聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)钠盐倒入搅拌溶解，称取1.6g氢氧化钠倒入搅拌溶解，然后量取20ml乙二醇将粘在瓶口的部分试剂冲入烧瓶中，然后安装到电动搅拌器上，逐滴加入300μl水，在500r/min条件下搅拌1h形成均匀的棕红色溶液，倒入聚四氟乙烯反应釜中，放入190℃真空干燥箱恒温反应9h，反应结束后关闭电源，打开箱门使其冷却。
10.最后，配制无水乙醇：水＝1:1(体积比)的溶液a，将冷却后的反应产物取出后去掉上清液，然后分装入4-6支离心管中，再加入溶液a，旋涡混匀、超声洗涤15min、在分析天平上配平，3200r/min离心10min，然后去掉上清液，后进入洗涤步骤，加入纯水30ml，旋涡混匀、超声洗涤15min，在分析天平上配平，3200r/min离心10min，去上清，将上述洗涤步骤重复3次，即得到了磁性纳米微球，将洗涤好的磁性纳米微球用45ml纯水溶解保存在50ml离心管中。
11.步骤二：利用法在磁性纳米微球外包覆一层sio2，制备出超顺磁性纳米微球
12.先吸取6ml磁性纳米微球于烧瓶中，加入80ml无水乙醇，4ml氨水，然后超声分散5min，后将烧瓶安装到电动搅拌器上，在50℃水浴、600r/min条件下搅拌10min，再逐滴加入200μl正硅酸四乙酯，间隔20min后再逐滴加入200μl硅酸四乙酯，连续搅拌反应1h。
13.反应完成后倒入烧杯中用磁铁吸附，待微球吸附沉降完成后弃去上清，加40ml无水乙醇超声洗涤10min，用磁铁吸附微球沉降后去上清；然后加30ml无水乙醇超声洗涤10min，用磁铁吸附微球沉降后去上清；最后再加30ml无水乙醇超声洗涤10min，用磁铁吸附微球沉降后去上清，即得到了超顺磁性纳米微球，将超顺磁性纳米微球用10ml无水乙醇溶解保存。
14.步骤三：在超顺磁性纳米微球表面进行氨基基团修饰
15.取1ml超顺磁性纳米微球于烧瓶中，加120ml无水乙醇，超声分散10min，加40ml纯水，安装到电动搅拌器上，500r/min搅拌5min后，逐滴加入400μl 3-氨丙基三乙氧基硅烷和5ml氨水，连续搅拌反应6h。反应完成后倒入烧杯中用磁铁吸附，待微球吸附沉降完成后去上清，加入20ml无水乙醇，超声洗涤8min，用磁铁吸附微球沉降后去上清；然后加入10ml无水乙醇，超声洗涤8min，用磁铁吸附微球沉降后去上清；最后再加入10ml无水乙醇，超声洗涤8min，用磁铁吸附微球沉降后去上清，即得到了修饰了氨基的超顺磁性纳米微球，后将洗涤好的产物用10ml纯水保存。
16.步骤四：利用氨基和dna之间的静电吸附作用吸附可识别重金属的核酸dna探针，制备修饰核酸的超顺磁性纳米微球
17.吸取3ml修饰了氨基的超顺磁性纳米微球，用磁铁吸附去上清，用无水乙醇超声洗涤3次，并用超纯水超声洗涤1次，磁铁吸附去上清，加入2ml的超纯水、寡核苷酸(500nm，5'-cct ccc tcc ttt tcc acc cac c-3')0.5ml并振摇10min，用磁铁吸附去上清，用超纯水超声洗涤3次，去除多余的未被吸附的dna，即得到了吸附了dna探针的超顺磁性纳米微球，将洗涤好的产物用3ml纯水保存,并放置于4℃冰箱中。
18.步骤五：制备核酸修饰的超顺磁性光子晶体传感材料
19.核酸(dna探针)吸附修饰的超顺磁性纳米微球在外加磁场下，形成核酸(dna探针)吸附修饰的超顺磁性光子晶体材料，即核酸修饰的超顺磁性光子晶体传感材料。
20.核酸修饰的超顺磁性光子晶体传感材料检测重金属离子的方法，其步骤如下：
21.步骤一：配置系列浓度的重金属水溶液，通过光纤光谱仪对所制备的超顺磁性光子晶体传感材料进行结合响应测试，绘制重金属浓度与反射峰信号响应图，获得检测范围。
22.步骤二：利用数码相机对吸附有核酸dna探针识别元件的超顺磁性光子晶体进行识别重金属的颜色变化响应进行拍照。
23.有益效果：
24.1.该材料用于重金属ag

等痕量物检测时，可提高检测灵敏度和选择性，并且结果为肉眼见的色变反应，实现了可视化光子晶体材料的制备和可视化快速检测痕量目标物。该新型传感材料检测时能像ph试纸一样发生肉眼可见的颜色变化，制备操作容易，检测方法简便。将来可以通过更换不同的核酸基团制备不同种类的核酸修饰超顺磁性光子晶体传感材料用于不同目标物的检测；还可通过利用磁诱导作用使超顺磁性纳米微球进入体内，实现无创体内检测。在进出口检验检疫、医学诊断、病毒检测、生物工程、过程监测等领域具有广泛的应用前景。
25.2.与核酸探针超顺磁性光子晶体传感材料、制备方法和应用相比，本发明制备出超顺磁性纳米微球，并在超顺磁性纳米微球表面修饰氨基，通过静电吸附作用直接吸附用于目标物检测的核酸识别基团于超顺磁性纳米微球上，该制备方法不同于化学键反应修饰，但仍可以将核酸dna修饰到超顺磁性纳米微球上，该方法相对化学键反应能节省制备时间和能量，同时操作简单，成本较低。
26.3.本发明制备出的核酸修饰的超顺磁性光子晶体材料，为液态下利用超顺磁性纳米微球构建新构型光子晶体，不同于传统光子晶体薄膜构型，与现有技术(cn201410742154.8)的光子晶体薄膜相比，有以下不同：
27.(1)光子晶体薄膜的制备方法是，先制备薄膜构型的光子晶体，即光子晶体材料成薄膜状，在光子晶体薄膜表面喷金，通过au-s键再将dna分子修饰到薄膜构型的光子晶体表面；或在光子晶体薄膜表面旋涂纳米c
60
制备修饰了c
60
的光子晶体薄膜，而本发明则是先制备超顺磁性纳米微球，并在超顺磁性纳米微球表面修饰氨基，再利用静电吸附作用制备吸附核酸dna的超顺磁光子晶体纳米微球，最后利用该微球在外加磁场的作用下组装成可用于重金属检测的光子晶体传感检测材料。相比而言本发明的操作步骤更简单，成本更低，即无需喷金和修饰荧光素等昂贵试剂和操作步骤。
28.(2)光子晶体薄膜的检测原理是，其dna上修饰了荧光素，检测时光子晶体材料的作用只是增强dna上的荧光信号(即光子晶体材料只起到增强信号的作用)，因此检测结果不是光子晶体薄膜本身的结构色色变信号，而是dna上荧光信号的强弱，而本发明不在dna上修饰荧光素，检测信号是光子晶体材料本身结构色的色变。
29.(3)光子晶体薄膜制备时是在其表面修饰dna，而光子晶体薄膜内部无法修饰dna，本发明制备的光子晶体材料是通过超顺磁性纳米微球与dna探针结合后再组装而成，突破了现有技术中核酸dna等大分子难与光子晶体技术直接结合的问题。本发明在外加磁诱导作用下自组装成具有检测响应性的可视化超顺磁性光子晶体材料，解决了传统构型光子晶体材料修饰核酸等大物质的难题。
附图说明
30.图1为核酸修饰的超顺磁性光子晶体传感材料制备原理图和检测过程图；
31.图2为磁性纳米微球的透射电镜图；
32.图3为二氧化硅包被的超顺磁性纳米微球透射电镜图；
33.图4为修饰氨基的超顺磁性纳米微球傅里叶红外扫描谱图；
34.图5为吸附核酸dna探针的超顺磁性纳米微球透射电镜图；
35.图6a为证明dna探针修饰成功的荧光显微镜图a；
36.图6b为证明dna探针修饰成功的荧光显微镜图b；
37.图7为吸附核酸dna探针的超顺磁性光子晶体对金属ag

识别响应测试结果图；
38.图8a为具修饰dna探针的超顺磁性光子晶体对重金属ag

识别响应颜色变化对比图；
39.图8b为具修饰dna探针的超顺磁性光子晶体对重金属ag

识别响应颜色变化对比图。
具体实施例
40.为了使本发明更清楚明白，下面通过实施例，对核酸修饰的超顺磁性光子晶体传感材料、制备方法和应用，通过说明书附图做进一步说明。
41.根据图1所示，先采用化学高温水热法制备磁性纳米微球，后利用法在磁性纳米微球外包覆一层sio2，制备出超顺磁性纳米微球，然后在其表面进行氨基基团修饰，并利用静电吸附作用吸附能识别重金属的核酸dna探针于超顺磁性纳米微球表面，该超顺磁性纳米微球可通过外加磁场组装成光子晶体材料。
42.实施例
43.根据图1-5所示，核酸(dna探针)修饰超顺磁性光子晶体传感材料的制备
44.(1)先量取100ml乙二醇，倒约20ml于烧瓶中，直接称取1.95g无水三氯化铁于烧瓶中，把量筒中剩余的乙二醇倒入烧瓶，盖上空心塞，用搅拌桨搅拌溶解；用称量纸称取9.0g无水醋酸钠，倒入烧瓶中搅拌溶解，称取3.0g聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)钠盐倒入搅拌溶解，称取1.6g氢氧化钠倒入搅拌溶解，然后量取20ml乙二醇将粘在瓶口的部分试剂冲入烧瓶中。然后安装到电动搅拌器上，逐滴加入300μl水，在500r/min条件下搅拌1h形成均匀的棕红色溶液，倒入聚四氟乙烯反应釜中，放入190℃真空干燥箱恒温反应9h，反应结束后关闭电源，打开箱门使其冷却，在第二天清洗反应产物。
45.配制无水乙醇：水＝1:1(体积比)的溶液，将冷却后的反应产物取出后去掉上清液，视产物的量的多少分装入4-6支离心管中。加入无水乙醇和水(体积比1：1)混合溶液，旋涡混匀、超声洗涤15min、在分析天平上配平，3200r/min离心10min，然后去掉上清液；加入纯水30ml，旋涡混匀、超声洗涤15min，在分析天平上配平，3200r/min离心10min，去上清；将上述洗涤步骤重复3次，最后将洗涤好的产物用45ml纯水溶解保存在50ml离心管中。
46.(2)吸取步骤(1)中过夜静置的6ml磁性纳米微球于烧瓶中，加入80ml无水乙醇，4ml氨水，然后超声分散5min。安装到电动搅拌器上，在50℃水浴、600r/min条件下搅拌10min，逐滴加入200μl正硅酸四乙酯，间隔20min后再逐滴加入200μl硅酸四乙酯，连续搅拌反应1h。反应完成后倒入烧杯中用磁铁吸附，待微球吸附沉降完成后弃去上清，加40ml无水乙醇超声洗涤10min，用磁铁吸附微球沉降后去上清；然后加30ml无水乙醇超声洗涤10min，用磁铁吸附微球沉降后去上清；最后再加30ml无水乙醇超声洗涤10min，用磁铁吸附微球沉降后去上清。洗好的超顺磁性纳米微球用10ml无水乙醇溶解保存，即为超顺磁性纳米微球。
47.(3)取1ml(2)中的超顺磁性纳米微球于烧瓶中，加120ml无水乙醇，超声分散10min，加40ml纯水，安装到电动搅拌器上，500r/min搅拌5min后，逐滴加入400μl 3-氨丙基三乙氧基硅烷和5ml氨水，连续搅拌反应6h。反应完成后倒入烧杯中用磁铁吸附，待微球吸
附沉降完成后去上清，加入20ml无水乙醇，超声洗涤8min，用磁铁吸附微球沉降后去上清；然后加入10ml无水乙醇，超声洗涤8min，用磁铁吸附微球沉降后去上清；最后再加入10ml无水乙醇，超声洗涤8min，用磁铁吸附微球沉降后去上清。将洗涤好的产物用10ml纯水保存，即为修饰了氨基的超顺磁性纳米微球。
48.(4)吸取3ml(3)中修饰了氨基的超顺磁性纳米微球，用磁铁吸附去上清，用无水乙醇超声洗涤3次，并用超纯水超声洗涤1次，磁铁吸附去上清，加入2ml的超纯水，寡核苷酸(500nm，5'-cct ccc tcc ttt tcc acc cac c-3')0.5ml并振摇10min，用磁铁吸附去上清，用超纯水超声洗涤3次，去除多余的未被吸附的dna。将洗涤好的产物用3ml纯水保存,并放置于4℃冰箱中，即为吸附了dna探针的超顺磁性纳米微球，该超顺磁性纳米微球在外加磁场下可形成吸附了dna探针的超顺磁性光子晶体材料。
49.超顺磁性光子晶体材料的表征：
50.(1)通过透射电镜观察制备好的磁性微球以及超顺磁性纳米微球和修饰了dna探针的超顺磁性纳米微球，确定其各自的大小及形态(如图2-3所示)，在磁性纳米微球的透射电镜图中，磁性纳米微球形状多似球形，且表面较为规整，粒径较为均一，大多为170
±
10nm，在二氧化硅包被的超顺磁性纳米微球透射电镜图中，二氧化硅包被的超顺磁性纳米微球形状为球形，表面规整，粒径较为均一，约为240
±
10nm，其中二氧化硅层的厚度约为80
±
10nm。图中内部的黑色部分为磁球，外面包裹灰色部分的为二氧化硅材料。
51.(2)为证明dna成功修饰到了超顺磁性纳米微球表面(如图4-6所示)，首先在修饰氨基的超顺磁性纳米微球傅里叶红外扫描谱图中，3300cm-1
位置上有像马鞍形的两个钝吸收峰，表明氨基已经修饰在超顺磁性纳米微球表面；其次在吸附核酸dna探针的超顺磁性纳米微球透射电镜图中，修饰dna探针的超顺磁性纳米微球发生了dna之间的粘连，其中微球粒径仍为240
±
10nm；最后在证明dna探针修饰成功的荧光显微镜图中，在dna探针的3'端c6位置修饰荧光基团fam用于证明dna探针是否成功修饰到超顺磁性纳米微球上。图6a为正常显微镜下修饰了dna探针的超顺磁性微球图片，图6b为激发光下吸附了核酸dna探针的超顺磁性微球图片，证明了核酸dna探针已经成功吸附到超顺磁性纳米微球表面。
52.根据图7-8所示，核酸(dna探针)修饰超顺磁性光子晶体传感材料用于金属ag

的检测：
53.(1)在外加磁场下组装超纯水中核酸修饰的超顺磁性光子晶体，待光纤光谱仪稳定后，记录检测基线。
54.(2)移除外加磁场，加入ag

溶液，使溶液中的ag

依次从1μg/l增加至5mg/l，每次加入被检目标物ag

后，再次使用相同外加磁场组装超顺磁性光子晶体，检测后立即记录检测响应数值。在吸附核酸dna探针的超顺磁性光子晶体对金属ag

识别响应测试结果图中，金属ag

的检出限为10μg/l，当ag

浓度从1μg/l上升到10μg/l时，超顺磁性光子晶体的反射峰位置基本没有变化，可是随着ag

浓度从10μg/l增加到5mg/l时，波长发生明显蓝移从652.8nm移到626.4nm，蓝移26.4nm。
55.(3)通过数码相机(iphone 7，美国)记录光子晶体检测前以及后结构色的变化，在具修饰dna探针的超顺磁性光子晶体对重金属ag

识别响应颜色变化对比图中，检测时，随着ag

的浓度增加，光子晶体的结构色从橙黄色变为黄绿色。其检测结果可用裸眼观察。图8a的容器内为光子晶体检测前色泽(橙黄色)，图8b的容器内为检测金属ag

后光子晶体的
最终颜色(黄绿色)。
56.最后应说明的是：通过本发明吸附其他碱基对序列核酸探针并进行其他目标物检测的超顺磁性光子晶体材料和检测方法实施例均属于本发明保护的范围。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。