用于激活和增幅NK细胞的经基因改造的细胞系以及其用途

immune cells)的血液样品；以及使所述nk细胞群的至少一部分与用于激活nk细胞的经基因改造的细胞接触，其中，所述经基因改造的细胞经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbil-18)、膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbil-21)和/或ox40l。技术方案
9.一方面提供一种细胞株，其经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbil-18)、膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbil-21)和/或ox40l。在一具体实施例中，所述细胞株经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbil-18)、膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbil-21)以及ox40l。
10.所述细胞株可用作仅选择性增幅nk细胞的饲养细胞。一般而言，作为用于nk细胞增殖的具有代表性的饲养细胞的k562细胞株，其仅用于nk细胞的增殖，因此k562细胞株本身不应增殖。因此，在与nk细胞一起培养之前，通过进行对所述k562细胞株照射强放射线(例如，50gy至100gy)的预处理，使所述k562细胞株本身完全不增殖，而仅有助于nk细胞的增殖。一方面，为了nk细胞的有效增殖，大多数细胞因子如il-2和il-15必须持续露出于nk细胞。因此，当进行基因改造在基于癌细胞株的饲养细胞中以表达细胞因子如il-2和/或il-15时，经放射线照射等预处理的癌细胞株在培养过程中不能长期存活，存在nk细胞的选择性增殖效率降低的问题。在一实施例中，当nk细胞在k562-ox40l存在下短期露出于il-18或il-21时，细胞增幅效果直到第21天也没有出现，但当同时露出于il-18和il-21时，确认细胞增幅效果造在28天后出现。因此，在il-18和il-21的情况下，尽管在培养开始日只有一次露出和短期露出，但对nk细胞的增殖有效果。换言之，在根据一方面的经基因改造以表达mbil-18和mbil-21的饲养细胞株中，尽管il-18和il-21的短期表达，nk细胞增殖的效率并未降低，而仅nk细胞可以被选择性增幅。
[0011][0012]
在本说明书中使用的术语“饲养细胞(feeder cells，也称为支持细胞)”可以指通过产生各种代谢物来帮助靶nk细胞增殖的细胞，因为这些细胞尽管没有通过照射放射线而分裂和增殖的能力，但具有代谢活性。在本说明书中可以使用的饲养细胞是导入了基因的动物细胞株(cell line)，其可以是人慢性骨髓性白血病细胞株(例如，k562细胞)、rpmi8866、ebv_lcl、721.221、hfwt、和nk-92等。
[0013]
在本说明书中使用的术语“经基因工程(genetic engineering)”或“基因改造的(genetically engineered)”是指将至少一种基因修饰(genetic modification)导入细胞的行为或由此产生的细胞。
[0014]
具体地，所述经基因改造的细胞可以包括编码上述基因的外源性基因(exogenous gene)。术语“外源性(exogenous)”是指将参考分子(referenced molecule)或参考活性(referenced activity)导入宿主细胞中。分子可以被插入宿主染色体，例如，作为导入宿主基因物质的编码核酸(encoding nucleic acid)，或作为非染色体基因物质如质粒。关于编码核酸的表达，所述术语“外源性”表示所述编码核酸以可表达的形式导入在个体内。关于生物合成活性，所述术语“外源性”是指导入宿主母细胞的活性。生物合成活性的来源(source)可以是例如同源性(homologous)或异源性(heterologous)编码核酸，其在被导入
在宿主母细胞后表达参考活性。因此，术语“内源性(endogenous)”是指在所述宿主细胞中存在的参考分子或活性。类似地，关于编码核酸的表达，术语“内源性”是指包括在个体中的编码核酸的表达。术语“异源性(heterologous)”是指来自不同于所提及物种的来源的分子或活性，而术语“同源性(homologous)”是指来自宿主母细胞的分子或活性。因此，编码核酸的外源性表达可以利用异源性(heterologous)或同源性(homologous)编码核酸中的任何一种或两种。
[0015]
因此，所述细胞可以包括编码mbil-18、mbil-21和/或ox40l的核酸。更具体地，所述细胞可以是由包括编码mbil-18、mbil-21和/或ox40l的核酸的载体转化的。
[0016]
在本说明书中使用的“载体”是指能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的载体，其并且是指包括可操作地连接以表达基因插入物的调节元素的基因建体。根据一实施例的载体可以包括用于表达的调节元素，例如，启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、加尾信号和/或增强子，并且载体的启动子可以是组成型的或诱导型的。此外，所述载体可以是能够在宿主细胞中稳定表达所述融合蛋白的用于表达的载体。所述用于表达的载体可以是通常在相关领域中用于在植物、动物或微生物中表达外源蛋白的。可以使用本领域已知的各种方法构建所述重组载体。例如，所述载体可以包括用于选择含有载体的宿主细胞的选择标记，并且在可复制的载体的情况下，其可以包括复制来源。此外，载体可以自我复制或导入宿主dna，所述载体可以是选自由质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒和牛痘病毒组成的组中。
[0017]
此外，在所述载体中，编码上述融合蛋白的多核苷酸序列可以与启动子可操作地连接。在本说明书中使用的术语“可操作地连接”是指用于核酸表达调控序列(例如，启动子、信号序列或转录因子的结合位点阵列)与另一核酸序列之间的功能结合，从而所述表达调控序列调控所述另一核酸序列的转录和/或翻译。
[0018]
在本说明书中，“膜结合白细胞介素(membrane bound interleukin)”是指与细胞膜结合的白细胞介素，并且可以具有与细胞外分泌的白细胞介素不同的含义。mbil-18可与seq id no：1的核酸序列或其氨基酸序列具有约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性。mbil-21可与seq id no：2的核酸序列或其氨基酸序列具有约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性。
[0019]
在本说明书中使用的术语“ox40l”是ox40(cd134)的配体，其是tnf家族的成员，并已知在诸如b细胞、巨噬细胞、内皮细胞和树突状细胞(dc；dendritic cell)的激活的抗原呈递细胞(apc；antigen presenting cell)上表达。ox40l可与seq id no：3的核酸序列或其氨基酸序列具有约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性。
[0020][0021]
另一方面提供一种用于培养nk细胞的组合物，其包括经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbil-18)、膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbil-21)和/或ox40l的细胞。
[0022]
所述经基因改造的细胞的具体细节如上所述。
[0023]
根据一具体实施例的用于培养nk细胞的组合物，其包括经基因改造以表达mbil-18、mbil-21和ox40l的细胞，且可以诱导nk细胞(例如，自然杀伤细胞)的增幅和/或激活，因此可有效用于nk细胞的培养、分离或增殖等。
[0024][0025]
另一方面提供一种增殖nk细胞的方法，包括收获含有混合的nk细胞(mixed immune cells)群的血液样品；以及使所述混合的nk细胞群的至少一部分与用于激活nk细胞的经基因改造的细胞接触，其中，所述经基因改造的细胞经基因改造以表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbil-18)、膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbil-21)和/或ox40l。
[0026]
在一具体实施例中，使接触的步骤包括共培养与所述经基因改造的细胞混合的nk细胞群以刺激、激活或增幅(expanding)所述nk细胞的亚群(subpopulation)。
[0027]
在本说明书中使用的术语“nk细胞的刺激”可指在体外或体内增加自然杀伤细胞的活性，例如细胞毒活性，或产生、增加、增幅或增殖激活的自然杀伤细胞。
[0028]
在一具体实施例中，所述nk细胞的非限制性实例包括巨噬细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。因此，在特定具体实施例中，nk细胞可以是选自由巨噬细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞(cd8 ctl)、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞组成的组中的任何一种。在特定具体实施例中，nk细胞可以是自然杀伤细胞或t淋巴细胞。所述混合的nk细胞可以包括选自由巨噬细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞组成的组的至少一种。
[0029]
在本说明书中使用的术语“自然杀伤细胞(natural killer cells)”或“nk细胞”是指构成先天免疫系统主要成分的细胞毒性淋巴细胞，其被定义为大颗粒淋巴细胞(lgl；large granular lymphocyte)，并构成从由普通淋巴祖细胞(clp；common lymphoid progenitor)产生的b和t淋巴细胞分化的第三细胞。所述“自然杀伤细胞”或“nk细胞”包括源自任何组织来源(source)的未经额外修饰的自然杀伤细胞，并且可以包括成熟的自然杀伤细胞以及自然杀伤祖细胞。所述自然杀伤细胞响应干扰素或巨噬细胞衍生的细胞因子而被激活，自然杀伤细胞包括两种类型的表面受体，其控制细胞的细胞毒活性，且标记为“激活受体”和“抑制受体”。自然杀伤细胞可以由任何来源产生，例如来自胎盘组织、胎盘灌注、脐带血、胎盘血、外周血、脾脏、肝脏等的造血细胞，例如来自造血干细胞或前驱体。
[0030]
在一具体实施例中，所述自然杀伤细胞可以是激活的自然杀伤细胞。所述激活的自然杀伤细胞可以指与母细胞例如造血细胞或自然杀伤祖细胞相比，其中细胞毒性或自然杀伤祖细胞本来的免疫调节能力被激活的细胞。在一具体实施例中，激活的自然杀伤细胞是cd3-cd56 。
[0031]
在一具体实施例中，激活的自然杀伤细胞或富含(enriched)激活的自然杀伤细胞的群可以通过检测至少一种在功能上相关的标志物来评估，例如，cd16、cd57、cd69、cd94、cd161、cd158a、cd158b、nkp30、nkp44、nkp46、dnam-1、2b4、nkp46、cd94、kir(例如，kir2dl1、kir2dl2/3、kir3dl1)和激活受体的nkg2家族(例如，nkg2a、nkg2c、nkg2d)。
[0032][0033]
在一具体实施例中，所述共培养可以在细胞因子存在下进行。
[0034]
在本说明书中使用的术语“细胞因子”可以指在细胞信号传递中起作用的蛋白(约5kda至20kda)。细胞因子由细胞释放并影响释放细胞因子的细胞和/或其他细胞的行为。细胞因子的非限制性实例包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子、单核因子和集落刺激因子。细胞因子可由广泛的细胞产生，所述细胞包括(但不限于)免疫细胞，例如巨噬细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞、肥大细胞和单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞和间质细胞。细胞因子可以由一种或多种类型的细胞产生。细胞因子通过受体起作用，在免疫系统中特别重要，调节体液免疫和细胞免疫反应之间的平衡，并调节细胞群的成熟、生长和反应性(responsiveness)。本说明书中的细胞因子可以是天然发生的细胞因子或天然发生的细胞因子的突变形式。在本技术中使用的“天然发生的”也可称为野生型，并且包括对立基因的变种。天然发生的细胞因子的突变形式或“突变”是指源自天然发生的序列以改变细胞因子的功能、活性和/或特异性的特定突变。在一具体实施例中，突变可以增强细胞因子的功能、活性和/或特异性。在另一具体实施例中，突变可以减少细胞因子的功能、活性和/或特异性。突变可包括细胞因子的一个或多个氨基酸残基的缺失或添加。
[0035]
所述细胞因子可以是选自由骨形成蛋白(bmp；bone morphogenetic protein)家族、趋化因子配体(ccl；cheomkine ligands)家族、cklf样marvel穿膜结构域成员(cmtm；cklf-like marvel transmembrane domain containing member)家族、c-x-c基序配体(cxcl；c-x-c motif ligand)家族、生长/分化因子(gdf；growth/differentiation factor)家族、生长激素、干扰素(ifn；interferon)家族、白细胞介素(il；interleukin)家族、肿瘤坏死因子(tnf；tumor necrosis factors)家族，糖磷脂酰肌醇(gpi；glycophosphatidylinositol)、分泌型ly-6/upar相关蛋白1(slupr-1；secreted ly-6/upar-related protein 1)、分泌型ly-6/upar相关蛋白2(slupr-2)以及其组合组成的组中的任何一种。
[0036]
在一具体实施例中，所述细胞因子是白细胞介素或其突变。许多白细胞介素由辅助cd4 t淋巴细胞以及单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成。白细胞介素可以促进t和b淋巴细胞和造血细胞的发育和分化。白细胞介素的非限制性例子包括il1、il2、il3、il4、il5、il6、il7、il8(cxcl8)、il9、il10、il11、il12、il13、il14、il15、il16、il17、il18、il19、il20、il21、il22、il23、il24、il25、il26、il27、il28、il29、il30、il31、il32、il33、il35、或il36。因此，在特定具体实施例中，所述细胞因子可以是包括(但不限于)il1、il2、il3、il4、il5、il6、il7、il8(cxcl8)、il9、il10、il11、il12、il13、il14、il15、il16、il17、il18、il19、il20、il21、il22、il23、il24、il25、il26、il27、il28、il29、il30、il31、il32、il33、il35或il36的野生型和突变型的白细胞介素或其突变。
[0037][0038]
在另一具体实施例中，添加到所述共培养的细胞因子可以是il-18和il-21。更具体地，所述共培养可以包括在il-2和il-15的存在下进行培养的同时，将il-18和il-21添加到培养基中。所述il-21可以以1ng/ml至20ng/ml、1ng/ml至15ng/ml、1ng/ml至10ng/ml或2ng/ml至8ng/ml的浓度使用。所述il-18可以以10ng/ml至200ng/ml、10ng/ml至180ng/ml、20ng/ml至160ng/ml、20ng/ml至120ng/ml、20ng/ml至40ng/ml、20ng/ml至80ng/ml、40ng/ml
至160ng/ml、40ng/ml至120ng/ml、40ng/ml至80ng/ml、80ng/ml至160ng/ml、或80ng/ml至120ng/ml的浓度使用。在一具体实施例中，通过在共培养时将细胞露出于il-18和il-21，nk细胞的增殖可能会更加协同地增加。
[0039]
在一具体实施例中，所述共培养可以是进行共培养2天至30天。
[0040]
在一具体实施例中，所述经基因改造的细胞可以是经50gy至300gy的放射线处理的。
[0041]
在一具体实施例中，所述样品可以是来自个体的生物样品，例如，包括人在内的哺乳动物等。此外，所述生物样品可以是从个体中分离的，并可以是血液、全血、血清、血浆、淋巴液、尿液、粪便、组织、细胞、器官、骨髓、唾液、痰液、脑脊液或其组合。另外，所述生物样品可以包括外周血单核细胞(pbmc；peripheral blood mononuclear cell)、纯化的nk细胞或原代静息细胞(primary resting cell)(即直接从血液中分离的)。
[0042][0043]
另一方面提供一种由所述增殖nk细胞的方法制备的nk细胞。
[0044]
另一方面提供一种细胞治疗剂，其包括所述免疫细胞或其细胞群作为有效成分。
[0045]
另一方面提供一种使用所述免疫细胞或其细胞群作为有效成分来预防或治疗癌症或传染性疾病的药物组合物。
[0046]
另一方面提供一种所述免疫细胞或其细胞群在制备药物中的用途。
[0047]
另一方面提供一种治疗疾病的方法，其包括将所述免疫细胞或其细胞群施用于个体。
[0048]
在本说明书中使用的术语“疾病”可以指一个病理状况，特别是癌症、传染性疾病、炎性疾病、代谢疾病、自身免疫疾病、退行性疾病、与细胞凋亡有关的疾病和移植物排斥。
[0049]
在本说明书中使用的术语“治疗”可以指或包括减轻、抑制进展或预防疾病、病症或病态或其一种或多种症状，并且“有效成分”或“药学有效量”是指在实施由本技术提供的发明的过程中所使用的组合物的任何量，其足以减轻、抑制进展或预防疾病、病症或病态或其一种或多种症状。
[0050]
在本说明书中使用的术语“施用”、“导入”和“植入”可互换使用，并且可以指通过导致根据一具体实施例的组合物至少部分定位到所需部位的方法或途径将根据一具体实施例的组合物放置到个体中。根据一具体实施例的组合物可以通过将细胞或细胞成分的至少一部分递送至个体中的期望位置的任何合适的途径来施用。细胞在施用于个体后的存活期可以短至几个小时，例如从24小时到几天，或长达几年。
[0051]
在本说明书中使用的术语“分离的细胞”，例如，“分离的免疫细胞”等是指实际上从该细胞起源的组织分离的细胞，例如，造血细胞。
[0052]
根据一具体实施例的药物组合物的施用方法没有特别限制，根据所期望的方法，可以口服施用或非口服施用，例如静脉内、皮下、腹腔内、吸入或局部应用。施用量根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间、施用方法、排泄率和疾病的严重程度而具有广泛的范围。一日施用量是指施用于需要治疗的个体的足以减轻疾病症状的根据一方面的用于治疗的物质的量。用于治疗的物质的有效量可以根据特定化合物、疾病的状态和严重程度、需要治疗的对象而变化，并且可以由本领域的普通技术人员确定。作为一个非限制性实例，根据一方面的组合物用于个体的施用量可以根据患者的年龄、体重、性别、施用形式、
健康状况和疾病程度而变化。对于体重为70kg的成年患者，例如，可以以1,000细胞/次至10,000细胞/次、1,000细胞/次至约100,000细胞/次、1,000细胞/次至1000,000细胞/次、1,000细胞/次至约10,000,000细胞/次、1,000细胞/次至100,000,000细胞/次、1,000细胞/次至1,000,000,000细胞/次、1,000细胞/次至约10,000,000,000细胞/次，每天以一定的时间间隔分开施用一次至数次，或者可以以一定的时间间隔施用数次。
[0053]“个体”是指需要治疗疾病的对象，更具体地，可以指人或非人的灵长类动物、诸如小鼠(mouse)、大鼠(rat),狗、猫、马和牛等的哺乳类动物。
[0054]
根据一具体实施例的药物组合物可以包括药学上可接受的载体和/或添加剂。例如，所述药物组合物可以包括无菌水、生理盐水、常规缓冲剂(磷酸、柠檬酸、其他有机酸等)、稳定剂、盐、抗氧化剂(抗坏血酸等)、表面活性剂、悬浮剂、等渗剂或防腐剂等。为了局部施用，还可以包括有机物如生物聚合物(biopolymer)等、无机物如羟基磷灰石等，具体而言，还可以包括与胶原基质、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物及其化学衍生物等的组合。当根据一具体实施例的药物组合物被制剂成合注射的剂型时，免疫细胞或增加其活性的物质可以溶解在药学上可接受的载体中，或者可以冻结成溶解的溶液的状态。
[0055]
根据一具体实施例的药物组合物可以根据其施用方法或剂型在需要时适当地包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、ph调节剂、镇痛剂、缓冲剂、还原剂和抗氧化剂等。适用于本发明的药学上可接受的载体和制剂包括上述示例，并详细描述于[雷明顿药物科学(remington's pharmaceutical sciences)，第十九版，1995]。根据一具体实施例的药物组合物可以根据本发明所属领域的普通技术人员可以容易地执行的方法，通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂制剂化，从而被制备成单位剂型，或者可以通过将组合物放入多剂量容器中来制备。此时，剂型可以是在油性或水性介质中的溶液、悬浮液或乳剂的形式，或粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式。有益效果
[0056]
与未经基因改造的细胞相比，根据一方面的经基因改造的细胞可以增加nk细胞的增殖和活性至少2倍至几倍，因此其可以通过增殖nk细胞用作细胞治疗剂。
附图说明
[0057]
图1a是确认根据一方面的饲养细胞中的mbil-18和mbil-21的表达特性的图表。
[0058]
图1b是根据一方面的饲养细胞与mil-18和mil-21的组合图像(左)以及通过荧光强度量化mil-18和mil-21的量的图表(右)。
[0059]
图2a是显示当nk细胞在k562-ox40l细胞存在下短时间露出于单独的il-21或il-18和il-21时nk细胞的扩增倍数(fold expansion)的图表。
[0060]
图2b是显示当nk细胞在k562-ox40l细胞存在下短时间露出于单独的il-21或il-18和il-21时nk细胞的纯度的图表。
[0061]
图2c是显示当nk细胞在k562-ox40l细胞存在下长时间露出于单独的il-21或il-18和il-21时nk细胞的扩增倍数的图表。
[0062]
图3是比较使用根据一方面的饲养细胞的nk细胞的增幅(左)和纯度(右)的图表。
[0063]
图4a和图4b是比较通过使用根据一方面的饲养细胞从正常供体(hd)增幅的nk细
胞中表达的标志物的图表。
[0064]
图5a是确认通过使用根据一方面的饲养细胞从正常供体(hd)增幅的nk细胞中表达的细胞因子的图表。
[0065]
图5b是显示通过使用根据一方面的饲养细胞从正常供体(hd)增幅的nk细胞的cd107a脱粒分析结果的图表。
[0066]
图6a是确认通过使用根据一方面的饲养细胞从正常供体(hd)增幅的nk细胞的细胞毒性的图表。
[0067]
图6b是确认通过使用根据一方面的饲养细胞从正常供体(hd)增幅的nk细胞的adcc细胞毒性的图表。
具体实施方式
[0068]
在下文中，公开优选的实施例以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例只是为了更容易理解本发明，本发明的内容不受以下实施例的限制。
[0069][0070]
[实施例]
[0071]
实施例1.制备经基因改造的饲养细胞(feeder cell)
[0072]
制备饲养细胞，其表达膜结合白细胞介素-18(membrane bound interleukin-18：mbil-18)、膜结合白细胞介素-21(membrane bound interleukin-21：mbil-21)和ox40l。具体地，将人源mbil18基因(seq id no：1)和mbil21基因(seq id no：2)克隆到慢病毒载体pcdh-cmv-rfp中，从而制备重组慢病毒生产用载体。然后，通过使用lipofectamin3000(invitrogen)和包装载体将所制备的重组基因(pcdh-cmv-rfp-mbil-1821)转染到293ft细胞。一段时间后换上新鲜培养基，培养细胞48小时，然后回收含有病毒的培养基。将所回收的培养基以500
×
g离心10分钟，并使用0.45μm的过滤器仅分离含有病毒的纯培养基，从而生产表达mbil18-mbil21的慢病毒。然后，将1ml的表达mbil18-mbil21的慢病毒溶解在9ml的包括以下比较例1的k562-ox40l细胞的培养基中，并加入聚凝胺(polybrene)(8μg/ml)，从而进行细胞培养48小时。接着，为了仅选择受感染的细胞，使用高速自动细胞分选仪仅选择表达绿色和红色荧光的细胞，并通过荧光激活细胞分类(facs；fluorescence-activated cell sorting)仪分析有否表达mbil18-mbil21，从而生产表达mbil18-mbil21的k562细胞株(在下文称为“k562-ox40l-mbil18-mbil21”)。
[0073][0074]
[比较例]
[0075]
比较例1.制备经基因改造的饲养细胞
[0076]
制备表达ox40l的饲养细胞。具体地，将人源ox40l基因(seq id no：3)克隆到作为慢病毒载体的plvx-ires-zsgreen中，从而制备用于重组慢病毒生产用载体。然后，为了生产病毒，将所述重组基因(ox40l-plvx-ires-zsgreen)通过使用lipofectamin3000(invitrogen)和包装载体转染到293ft细胞中。一段时间后换上新鲜培养基，培养细胞48小时，然后回收含有病毒的培养基。将所回收的培养基以500
×
g离心10分钟，并使用0.45μm的过滤器仅分离含有病毒的纯培养基，从而生产表达ox40l的慢病毒。之后，将1ml的表达ox40l的慢病毒溶解在9ml的包括k562细胞的培养基(rpmi 1640)中，并加入聚凝胺
(polybrene)(8μg/ml)，从而进行细胞培养48小时。接着，为了仅选择受感染的细胞，使用高速自动细胞分选仪仅选择表达绿色荧光的细胞，并通过facs分析有否表达ox40l，从而生产表达ox40l的k562细胞株(在下文称为“k562-ox40l”)。
[0077][0078]
[试验例]
[0079]
试验例1.经基因改造的饲养细胞的细胞特性
[0080]
为了确认根据一方面的经基因改造的饲养细胞的mbil-18和mbil-21的表达特性，确认mrna和表面蛋白的表达水平。
[0081]
具体地，通过使用rneasy迷你试剂盒(mini kit)(qiagen，芬洛，荷兰)分离在所述实施例1中制备的k562-ox40l-mbil18-mbil21细胞株和在比较例1中制备的k562-ox40l细胞株的总rna，并且使用implen超微量分光光度计(nanophotometer)p330(implen，慕尼黑，德国)进行量化。之后，使用quantitect反转录试剂盒(reverse transcription kit)(qiagen)将分离的rna转换为cdna，然后使用quantitect sybr绿pcr试剂盒(qiagen)和rotor-gene q(qiagen)在标准20ml的反应体积中进行聚合酶链式反应(pcr；polymerase chain reaction)。在此，使用下表1中的引物，并且所有试验重复实施3次。
[0082]
【表1】【表1】
[0083]
图1a是确认根据一方面的饲养细胞中的mbil-18和mbil-21的表达特性的图表。
[0084]
图1b是根据一方面的饲养细胞与mil-18和mil-21的组合图像(左-)以及通过荧光强度量化mil-18和mil-21的量的图表(右)。
[0085]
结果，如图1a-图1b所示，在实施例1的饲养细胞中检测到mbil-18和mbil-21mrna，但在比较例1的饲养细胞中检测不到mbil-18和mbil-21mrna。另外，如图1b所示，可以确认出，与比较例1的饲养细胞相比，实施例1的饲养细胞表面持续表达更大量的il-18和il-21。
[0086]
试验例2.通过添加k562-ox40l细胞、il18和il21确认nk细胞激活
[0087]
为了预测根据一方面的经基因改造的饲养细胞的nk细胞激活效能，在预备试验中确认在根据k562-ox40l细胞中添加细胞因子的nk细胞激活程度。
[0088]
具体地，在提供有5％的co2的培养基中，将在所述比较例1中制备的k562-ox40l细胞株培养于t-25烧瓶中，所述烧瓶为37℃且装有25ml的完全rpmi 1640培养基(含有胎牛血清(fbs；fetal bovine serum)、青霉素和链霉素)。此后，在400
×
g条件下离心3分钟，并将细胞沉淀物重悬于5ml的完全rpmi 1640培养基中以收获饲养细胞(feeder cell)。之后，为
3000elan辐射器以100gy的伽马射线照射所述饲养细胞并用于后续试验。以与所述试验例2相同的方法，将3
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106个分离的外周血单核细胞和0.5
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106个经100gy照射的k562-ox40l-mbil18-mbil21细胞接种到包括1ml的nk细胞培养基的24孔板上，然后加入含有20u/ml的il-2的1ml的nk细胞培养基，使培养基总体积为2ml/孔且il-2终浓度为10u/ml，然后然后轻轻吸取且混合后，在37℃下且5％的co2培养基中进行培养。培养第7天，向培养基中加入100u/ml的il-2和5ng/ml的il-15，并在每2天至3天更换一次新培养基的同时，进行培养14天。作为对照组，使用k562细胞。通过以与所述试验例2中相同的方法确认nk细胞的纯度和扩增倍数来确认nk细胞的激活程度。
[0101][0102]
图3是比较使用根据一方面的饲养细胞的nk细胞的增幅(左)和纯度(右)的图表。
[0103]
结果，如图3所示，可以确认出，与对照组相比，实施例1的饲养细胞显着增加nk细胞的扩增倍数。特别地，在对照组的情况下，nk细胞在培养后增加至第35天后都没有显示出任何进一步的增加。然而，在实施例1的情况下，在培养后到第42天显示出显着增加，之后显示出减少的模式，但可以确认能够持续增幅。此外，可以确认出，使用实施例1的饲养细胞培养的nk细胞的纯度显着高于使用对照组培养的nk细胞的纯度。
[0104]
即，根据一方面的饲养细胞不仅显着增加nk细胞的活性，而且允许nk细胞的长期培养，使得nk细胞可以大量增殖并用作细胞治疗剂。
[0105]
试验例4.通过k562-ox40l-mbil18-mbil2细胞增幅的nk细胞的表型特性
[0106]
确认了通过k562-ox40l-mbil18-mbil2细胞增幅的nk细胞的表型特性。具体地，在用facs缓冲液(含有1％fbs的pbs)洗涤在所述试验例2中增幅的来自正常供体(hd)的2
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105个nk细胞后，用apc-cyanine7-偶联的小鼠抗人cd3和pe-cyanine7-偶联的抗人cd56膜抗体处理15分钟。然后，收获细胞，并用分别不同的荧光-偶联的抗人cd16、cd69、nkg2d、nkp30、nkp44、nkp46、cd94、cd158a和cd158b膜抗体进一步染色30分钟。之后，用facs缓冲液洗涤所述细胞，然后使用facs calibur获取数据，并用kaluza分析。
[0107][0108]
图4a和图4b是比较通过使用根据一方面的饲养细胞从正常供体(hd)增幅的nk细胞中表达的标志物的图表。
[0109]
结果，如图4a-图4b所示，通过表达ox40l、mbil18和mbil21的饲养细胞增幅的nk细胞不仅表现出高nk纯度(》90％))，而且与培养的初始阶段相比，在第14天显示出nk细胞激活标志物的表达增加。
[0110]
即，可以看出通过根据一方面的饲养细胞增幅的nk细胞具有nk细胞的完整功能特性。
[0111]
试验例5.确认通过k562-ox40l-mbil18-mbil2细胞增幅的nk细胞的激活程度
[0112]
随着激活受体的表达增加，增幅的nk细胞的激活也一定要增加，因此，评估了nk细胞的细胞因子释放和通过细胞毒性的免疫调节活性，所述nk细胞通过使用实施例1的饲养细胞增幅并来源于正常供体(hd)。
[0113]
5-1.细胞内ifn-γ测量
[0114]
为了评估免疫调节活性，通过测量细胞内ifn-γ来评估细胞的细胞毒性。具体而言，在布雷非德菌素a(brefeldin a)(bd生物科学；bd biosciences)和莫能菌素(bd生物科
学)的存在下，将使用实施例1的饲养细胞增幅且来自正常供体(hd)的2
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105个nk细胞在37℃和5％co2的条件下在96孔圆底板中培养5小时。然后，收获细胞，用facs洗涤，然后用抗人cd3和cd56膜抗体染色20分钟。在洗涤、固定和穿透后，将nk细胞在冰上进一步用pe偶联的抗人ifn-γ抗体染色30分钟。此后，洗涤所述细胞并通过使用facs calibur流式细胞仪进行分析。
[0115][0116]
图5a是确认通过使用根据一方面的饲养细胞从正常供体(hd)增幅的nk细胞中表达的细胞因子的图表。
[0117]
结果，如图5a所示，可以确认出，来自正常供体的nk细胞中的ifn-γ的表达水平在nk细胞增幅的同时显着增加。
[0118]
5-2.cd107a脱粒和细胞毒性的确认
[0119]
将2
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105个的在所述5-1中增幅的来自正常供体(hd)的nk细胞、2
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105个靶细胞(k562、u266、rpmi8226)以及pe偶联的抗人cd107a在96孔圆底板(96-well u-bottom plate)培养。1小时后，加入莫能菌素和布雷非德菌素a(bd生物科学)，然后进一步培养4小时。然后，通过用抗人cd3和cd56抗体染色来获得nk细胞。
[0120][0121]
图5b显示通过使用根据一方面的饲养细胞从正常供体(hd)增幅的nk细胞的cd107a脱粒分析结果的图表。
[0122]
结果，如图5b所示，可以确认出，与培养初期(第0天)相比，14天后，在与来自正常供体的nk细胞一起培养的所有细胞(k562、u266、rpmi8226)中，cd107a的表达显着增加。
[0123]
即，这是指从正常供体的外周血单核细胞中成功地生成了活性增加的nk细胞。因此，根据一具体实施例的表达ox40l、mbil18和mbil21的饲养细胞对于生成具有增加的活性的nk细胞是有效的。
[0124]
试验例6.确认通过k562-ox40l-mbil18-mbil2细胞增幅的nk细胞的细胞毒性
[0125]
为了确认由根据一方面的饲养细胞增幅的nk细胞作为抗体治疗剂的效能，确认细胞毒性。
[0126]
具体而言，通过基于cfse的分析测量第14天的nk细胞对靶细胞的细胞毒性4小时。具体而言，靶细胞在facs缓冲液中用0.5μm的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse；carboxyfluorescein succinimidyl ester)在37℃下染色10分钟，然后用完全培养基洗涤两次。然后，将5
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104个靶细胞三重置于96孔圆底板中，并分别以0.5：1、1：1和2：1的效能细胞对目标细胞(e:t；effector-to-target)的比率将来自正常供体(hd)的nk细胞和来自具有多发性骨髓瘤(mm；multiple myeloma)患者的的nk细胞混合。将板以1,500rpm离心3分钟，然后在37℃下在5％co2的培养基中培养4小时。此后，然后将混合的细胞转移到facs管中，并将1μl的1mg/ml的碘化丙啶(pi；propidium iodide)(sigmaaldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)添加到每个管中。然后通过使用facs calibur收获细胞并使用kaluza软件进行分析。在减去自发死亡的靶细胞的百分比后，计算死亡的靶细胞之百分比(cfsf阳性和pi阳性)。
[0127][0128]
图6a是确认通过使用根据一方面的饲养细胞从正常供体(hd)增幅的nk细胞的细
胞毒性的图表。
[0129]
图6b是确认通过使用根据一方面的饲养细胞从正常供体(hd)增幅的nk细胞的adcc细胞毒性的图表。
[0130]
结果，如图6a所示，可以确认出，使用实施例1的饲养细胞增幅的nk细胞表现出与使用k562饲养细胞增幅的nk细胞相同的细胞毒性。并且，如图6b所示，可以确认出，使用实施例1的饲养细胞增幅的nk细胞在结合于利妥昔单抗的raji细胞表现出与使用k562饲养细胞增幅的nk细胞相似的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(adcc；antibody-dependent cell-medicated cytotoxicity)活性。
[0131]
换言之，通过根据一方面的饲养细胞增幅的nk细胞表现出细胞毒性，因此可以用作抗体治疗剂。
[0132][0133]
以上对本发明的描述是为了举例说明，本发明所属领域的普通技术人员可以理解，在不改变本发明的技术思想或本质特征的情况下，可以很容易地将其修改为其他具体形式。因此，应当理解，上述实施例在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。