桑枝叶提取物在作为或制备用于预防或治疗伪狂犬病毒感染药物中的应用

1.本发明属于病毒抑制药物技术领域，具体涉及一种桑枝叶提取物在作为或制备用于预防或治疗伪狂犬病毒感染药物中的应用。


背景技术：

2.伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus,prv)是疱疹病毒科的一种双链dna囊膜病毒，能感染猪、牛、羊等多种家畜和野生动物，引发以发热、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎为主要症状的伪狂犬病。prv具有典型的疱疹病毒粒子结构，直径一般200nm左右，在电子显微镜下观察呈圆形或者椭圆形。成熟的病毒粒子由外到内主要包括囊膜、蛋白质皮层、核衣壳和双链线状基因组dna，其中囊膜含有11个功能多样的糖蛋白包括gb、gc、gd等。
3.猪是prv的自然宿主和贮存宿主，受prv感染后，成年猪出现呼吸道症状并可建立终身性潜伏感染，仔猪出现脑脊髓炎，病死率可达100％，怀孕母猪流产、死胎。2011年prv强变异毒株在我国出现，不仅给生猪养殖行业造成巨大经济损失，还出现多起感染人的病例，prv已成为公共卫生和健康养殖领域共同面临的一个重要威胁，抗prv药物的开发对于prv的有效防控具有重要意义。


技术实现要素：

4.针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种桑枝叶提取物在作为或制备用于预防或治疗伪狂犬病毒感染药物中的应用，且预防或治疗效果显著。
5.为了达到上述目的，可以采用以下技术方案：
6.本发明一方面在于提供一种桑枝叶提取物在作为或制备用于预防或治疗伪狂犬病毒感染药物中的应用。
7.具体地，桑树(拉丁学名：morusalbal.)，荨麻目桑科桑属植物；桑枝为桑树的桑枝、桑条、嫩桑枝的总称，桑叶是桑科植物桑的干燥叶。现代药理学研究表明，桑枝叶的活性成分如鞣质、各种游离的糖类、生物碱类、黄酮类、甾醇类等对单纯疱疹病毒(hsv)、甲型h1n1流感病毒(flua-h1n1)、冠状病毒(coronavirus)等多种病毒均有较好的抑制作用。
8.本发明另一方面提供一种桑枝叶提取物在作为或制备用于预防或治疗伪狂犬病毒感染药物中的应用。
9.本发明再一方面提供一种桑枝叶提取物在作为或制备用于抑制伪狂犬病毒复制的药物中的应用。
10.本发明再一方面提供一种桑枝叶提取物在作为或制备用于阻断伪狂犬病毒对宿主细胞侵染的药物中的应用。
11.本发明再一方面提供一种用于预防或治疗伪狂犬病毒感染药物，其包括桑枝叶提取物。
12.本发明再一方面提供一种用于抑制伪狂犬病毒复制的药物，其包括桑枝叶提取
物。
13.本发明再一方面提供一种用于阻断伪狂犬病毒对宿主细胞侵染的药物，其包括桑枝叶提取物。
14.本发明再一方面提供一种抑制伪狂犬病毒复制的方法，其包括：将桑枝叶提取物或包含桑枝叶提取物的药物与伪狂犬病毒共同孵育后感染细胞。
15.需要说明的是，上述应用和上述药物以及上述抑制伪狂犬病毒复制的方法中，桑枝叶提取物优选桑枝叶醇提取物。具体地，在一些实施例中，以ipec-j2为细胞模型，检测了桑枝叶醇提物对伪狂犬病毒感染细胞是否有抑制作用，并与桑枝叶水提物(m3)做了比较，结果显示，桑枝叶醇提物的抑制效果优于桑枝叶水提物。
16.需要说明的是，在一些实施例中，利用超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)对m4中的代谢物进行了定性定量分析，一共在m4样品中鉴定得到了11类代谢物，共1218个，其中酚酸类物质当中的绿原酸相对含量最高；具体地，11类代谢物代谢物通过检索标准数据库比对得知，其中，黄酮类占比约28.08％；酚酸类占比约18.72％；脂质类占比约11.41％；其它类占比约9.69％；有机酸类占比约5.66％；生物碱类占比约5.50％；木脂素和香豆素类占比约6.65％；核苷酸及其衍生物类占比约4.60％；氨基酸及其衍生物类占比约6.24％；萜类占比约3.20％；醌类占比约0.25％。
17.需要说明的是，桑枝叶提取物分为桑枝叶醇提取物(m4)和桑枝叶水提取物(m3)，均由无血清dmem培养基溶解而成；上述应用和上述药物以及上述抑制伪狂犬病毒复制的方法中，桑枝叶醇提取物(m4)是按照本领域所已知的醇提取方法对桑枝叶提取而得；同样地，桑枝叶水提取物(m3)也是按照本领域所已知的水提取方法对桑枝叶提取而得。
18.需要说明的是，上述应用和药物中以及上述抑制伪狂犬病毒复制的方法中，上述提取物的有效浓度为0.5mg/ml-4mg/ml；应当理解的是，有效浓度指的是能够预防或治疗伪狂犬病毒感染的浓度；或能够抑制伪狂犬病毒复制的浓度；或可以阻断伪狂犬病毒对宿主细胞侵染的浓度；qpcr和蛋白免疫印迹分析也表明0.5mg/ml-4mg/ml的m4对prv的dna复制和ge蛋白的表达均有抑制作用，m4对prv的抑制效果与浓度成正相关，4mg/ml时抑制效果最强。
19.需要说明的是，上述药物中，除了包含桑枝叶提取物外，还可以包括一些药用的辅料或稀释剂，药用辅料或稀释剂可以将药物制成各种剂型的药物，比如片剂、乳剂或者颗粒剂型等，可以根据具体需要进行添加辅料或稀释剂。
20.需要说明的是，上述抑制伪狂犬病毒复制的方法中，除了将m4和病毒先共孵育后再一起加入细胞的方式可以抑制伪狂犬病毒复制外，还可以是先加入m4后感染prv和m4和prv先共孵育再加入细胞的方式；通过ifa检测和qpcr测定发现m4的三种加入方式均不同程度的抑制了prv的增殖并且降低了prvge蛋白的表达，其中，对prv复制抑制效果最明显的方式是m4和病毒先共孵育后再一起加入细胞，抑制率约为99.42％。
21.本发明有益效果至少包括：桑枝叶醇提物(m4)在有效安全浓度之下(≤4mg/ml)可以抑制伪狂犬病毒感染引起的细胞病变和死亡，对病毒dna增殖的抑制倍数可以达到1000倍；且对ge蛋白的表达也有显著的抑制作用。
附图说明
22.图1为桑枝叶提取物溶液m3不同浓度对细胞活性影响的实验结果图；
23.图2为桑枝叶提取物溶液m4不同浓度对细胞活性影响的实验结果图；
24.图3为桑枝叶提取物溶液m3和m4在抑制prv复制48h后在显微镜下对细胞cpe的观察结果图；
25.图4为桑枝叶提取物溶液m3在不同时间点prvdna拷贝数；
26.图5为桑枝叶提取物溶液m4在不同时间点prvdna拷贝数；
27.图6为桑枝叶醇提物溶液m4不同浓度prvdna拷贝数；
28.图7为桑枝叶醇提物溶液m4不同浓度prvge蛋白表达量；
29.图8是prv
→
m4加入方式prvdna拷贝数；
30.图9为m4
→
prv加入方式prvdna拷贝数；
31.图10为m4 prv
→
加入方式prvdna拷贝数；
32.图11为桑枝叶醇提物溶液m4不同加入方式抗prv的prvge蛋白间接免疫荧光；
33.图12为m4代谢物分类图；
34.图13为m4mrm代谢物检测多峰图；
具体实施方式
35.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
36.本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
37.为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
38.实施例1桑枝叶提取物溶液不同浓度对细胞活性影响的实验
39.把一个细胞培养瓶中的ipec-j2细胞进行消化，把细胞悬液转移到离心管中，吹打均匀，吸取10μl细胞悬液到自动计数板，计算出离心管里的细胞个数，然后把细胞悬液接种到96孔板中，并确保各孔细胞的数量在5
×
10^4个。
40.设置桑枝叶提取物溶液的浓度梯度，浓度梯度从高到低依次为：16mg/ml、4mg/ml、1mg/ml、0.25mg/ml和0.0625mg/ml，每个浓度设置6个重复；设置细胞对照孔(细胞和dmem培养基)和无细胞背景孔(dmem培养基)；待96孔板的细胞生长至80％-90％汇合度时，吸弃96孔板的培养基，pbs洗涤3次，加入不同浓度的桑枝叶提取液，每孔100μl，细胞对照孔与无细胞背景孔的加液量与实验组一致。放置于细胞培养箱37℃，5％co2培养48h。
41.在检测前1h拿出96孔板，室温静置30min平衡孔板和内容物的温度；向96孔板中添加与内容物等体积的试剂；掀开96孔板的盖子，放置于多功能酶标仪里面，设
置程序：先让96孔板在轨道振荡器上振荡2min(为了诱导细胞裂解)，然后让孔板在室温下孵育10min(稳定发光信号)，最后记录发光信号强度，计算细胞活力；
42.为排除桑枝叶提取物对细胞的影响，本发明实施例按照上述方法检测了m3、m4对ipec-j2细胞的毒性，结果如图1和图2所示，在添加m3、m448h后，m3、m4在ipec-j2细胞上有效安全浓度为0-4mg/ml。
43.实施例2 m3、m4在不同时间点抑制prv复制的实验
44.将ipec-j2接种至12孔细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养，待细胞生长至80％-90％汇合度时，在病毒对照组、细胞对照组中加入500μl含2％fbsdmem培养基，在实验组中分别加入500μl4mg/ml的m3和m4，于37℃、5％co2培养箱中孵育1h，之后弃液，pbs清洗三遍，病毒对照组、实验组加入500μlprv病毒液(moi＝0.1)，细胞对照组加入500μl无血清dmem，于37℃，5％co2培养箱中孵育1h，之后弃液，pbs清洗三遍，病毒对照组、细胞对照组换成病毒维持液1ml(含2％fbsdmem培养基)，实验组分别换成含有4mg/mlm3和4mg/mlm4的病毒维持液1ml继续培养12h、24h、36h、48h；48h后在显微镜下观察细胞的cpe，按时间收集细胞样品，提取核酸，以qpcr测定prvdna的拷贝数。
45.结果如图3、图4和图5所示，对比病毒对照组，实验组m4组无明显可见的cpe(如图3所示)；dna水平上，12h、24h、36h和48h细胞样品中，m4组中prv m4组prvdna的拷贝数显著低于阳性组(如图4所示)，说明了m4对prv有较强的抑制效果，48h抑制效果最强，抑制倍数约为1000倍；从24h、36h和48h细胞样品中prvdna的拷贝数来看，m3组对prv没有抑制效果(如图5所示)。
46.实施例3 m4不同浓度对prv抑制效果的实验
47.在之前的研究中，体外实验证明了m4相较于m3对prv的复制具有更好的抑制作用，本发明实施例为了验证浓度对m4抑制prv复制的影响，将制备好的m4用含2％fbsdmem二倍稀释，稀释梯度为0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml。将ipec-j2接种至6孔细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养，待6孔板的细胞生长至80％-90％汇合度时，在病毒对照组和细胞对照组中分别加入1ml含2％fbsdmem培养基，在实验组中分别加入1ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml的m4，于37℃，5％co2培养箱中孵育1h，之后弃液，pbs清洗三遍，病毒对照组和实验组分别加入prv病毒液(moi＝0.1)，细胞对照组加入无血清dmem，于37℃，5％co2培养箱中孵育1h，之后弃液，pbs清洗三遍，病毒对照组和细胞对照组换成病毒维持液(含2％fbsdmem)，实验组换成含有不同浓度m4的病毒维持液继续培养48h；48h后在显微镜下观察细胞的cpe，按时间收集细胞样品，提取核酸和蛋白，以qpcr测定prvdna的拷贝数，以westernblot检测prvge蛋白表达量。
48.结果如图6和图7所示，随着m4浓度的增加，感染ipec-j2细胞的prvdna拷贝数逐渐降低，表明m4的抗病毒作用与浓度成正相关(如图6所示)；同时，蛋白样品westernblot实验的结果也与之一致，结果随着m4浓度的增加，感染细胞中ge蛋白的表达水平逐渐降低(如图7所示)。
49.实施例4 m4三种加入方式对抗病毒作用影响的实验
50.本发明实施例为了解析m4对prv的抗病毒机制，首先验证m4不同加入方式对抗病毒作用的影响。采用三种不同的加入方式来研究m4的抗病毒作用：(1)prv
→
m4，即先接prv后加入m4，用0.1moiprv感染ipec-j2细胞，37℃孵育1h，pbs洗三次，然后加入1ml4mg/ml的
m4或等体积的2％fbsdmem培养基，37℃孵育2h，pbs清洗三次并加入新鲜的1ml2％fbsdmem培养基；(2)m4
→
prv，先加入m4后感染prv，将细胞用pbs清洗，加入1ml4mg/ml的m4或等体积的2％fbsdmem培养基，37℃孵育2h，而后pbs清洗，用0.1moiprv感染细胞，37℃孵育1h，pbs清洗三次并加入新鲜的2％fbsdmem培养基；(3)m4 prv
→
，即m4和prv先混合共孵育再加入细胞，将0.1moiprv和4mg/mlm4或无血清dmem培养基按等体积1:1混合，混合物在37℃孵育1h，之后添加到ipec-j2细胞中，37℃孵育1h，然后将细胞用pbs清洗并加入新鲜的2％fbsdmem培养基。
51.根据qpcr的结果显示，三种不同的给药方式对prv的复制具有不同程度的抑制效果，如图8、图9和图10所示，先感染病毒后给药抑制率约为47.52％(见图8)；先给药后接毒抑制率约为87.70％(见图9)；药物和病毒先共孵育再感染细胞抑制效果最显著，抑制率约为99.42％(见图10)；
52.同时，ifa结果也与qpcr结果保持一致性，如图11所示，从ifa结果可明显观察到，在先加入m4后感染prv时、m4和prv先共孵育再加入细胞时，这两种方式中prv m4组较prv dmem组中的绿色荧光信号下调非常显著，先感染prv后加入m4时，prv m4组较prv dmem组中的绿色荧光信号下调显著，结果表明m4在三种不同加入方式中均不同程度的降低了病毒ge蛋白的表达。
53.实施例5 m4广泛靶向代谢组检测
54.色谱与质谱联用实现了从利用色谱进行物质分离到利用质谱进行物质鉴定的整个流程，其中超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)能够准确定性定量。
55.样品提取流程：(1)称取50mg的m4粉末，溶解于1.2ml70％甲醇提取液中；(2)每30min涡旋一次，每次持续30s，共涡旋6次；(3)离心(转速12000r/min，3min)后，吸取上清，用微孔滤膜(0.22μm)过滤样品，并保存于进样瓶中，用于uplc-ms/ms分析。
56.色谱质谱采集条件：数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(ultraperformance liquidchromatography,uplc)和串联质谱(tandemmassspectrometry,ms/ms)。
57.液相条件主要包括：(1)色谱柱：agilent sb-c181.8μm，2.1mm
×
100mm；(2)流动相：a相为超纯水(加入0.1％的甲酸)，b相为乙腈(加入0.1％的甲酸)；(3)洗脱梯度：0minb相比例为5％，9min内b相比例线性增加到95％，并维持在95％1min，10min-11.1min，b相比例降为5％，并以5％平衡至14min；(4)流速0.35ml/min；柱温40℃；进样量4μl。
58.质谱条件主要包括：电喷雾离子源(electrosprayionization,esi)温度550℃；离子喷雾电压(is)5500v(正离子模式)/-4500v(负离子模式)；离子源气体i(gsi)，气体ii(gsii)和气帘气(cur)分别设置为50、60和25psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在qqq和lit模式下分别用10和100μmol/l聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准；qqq扫描使用mrm模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等。通过进一步的去簇电压(declusteringpotential,dp)和碰撞能(collisionenergy,ce)优化，完成了各个mrm离子对的dp和ce。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的mrm离子对。
59.代谢物定性与定量分析：基于自建数据库mwdb(metwaredatabase)，根据二级谱信息进行物质定性，分析时去除了同位素信号，含k

离子、na

离子、nh
4
离子的重复信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。代谢物定量是利用三重四级杆质谱的
多反应监测模式(multiplereactionmonitoring,mrm)分析完成。
60.通过对质谱数据进行分析，按物质一级分类，一共在m4样品中鉴定得到11类代谢物(见图12)，共1218个(见图13)，其中酚酸类物质当中的绿原酸相对含量最高。代谢物通过检索标准数据库比对得知，其中11类代谢物分别是黄酮类，占比约28.08％；酚酸类，占比约18.72％；脂质类，占比约11.41％；其它类，占比约9.69％；有机酸类，占比约5.66％；生物碱类，占比约5.50％；木脂素和香豆素类，占比约6.65％；核苷酸及其衍生物类，占比约4.60％，氨基酸及其衍生物类，占比约6.24％；萜类，占比约3.20％；醌类，占比约0.25％。
61.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。