(ch2)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2)
r-、-(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-和-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2)
r-；其中各rm独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
10.b为例如其中*连接m，**连接l，***连接g；
11.l为-(aa)
i-(ff)
f-，其中，aa为氨基酸或多肽，i是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；各ff独立为13、14、15、16、17、18、19或20；各ff独立为其中各rf独立为c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、-no2或卤素；z为0、1、2、3或4；f为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；其中*连接aa，**连接d；
12.g为其中n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；
13.p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
14.在一个或多个实施方式中，d为抗癌药物。
15.在一个或多个实施方式中，d为微管蛋白抑制剂、dna损伤剂或dna拓扑异构酶抑制剂。
16.在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、美登素(maytansine)类。
17.在一个或多个实施方式中，d为奥瑞他汀(auristatin)类，例如单甲基澳瑞他汀e(monomethyl auristatin e；mmae)、单甲基澳瑞他汀f(monomethyl auristatin f；mmaf)、和澳瑞他汀f(auristatin f；af)。
18.在一个或多个实施方式中，d为dna损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物pbd(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。
19.在一个或多个实施方式中，d为dna拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物sn-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、依喜
替康衍生物，硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(d-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3h)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(苯基甲基)-(2e)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(3-羟基苯基丙基)-(e)-2-丙烯酰胺、12-β-d-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5h-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6h)-二酮、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。
[0020]
在一个或多个实施方式中，所述dna拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康，或其盐。
[0021]
在一个或多个实施方式中，d为tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、cc-1065及其类似物、amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(pbd)二聚体类、阿霉素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素c，马法兰或苯丁酸氮芥衍生物。
[0022]
在一个或多个实施方式中，d具有氨基或被一个烷基取代氨基，其与ff通过酰胺键连接。
[0023]
在一个或多个实施方式中，d为其中
[0024]
x1和x2各自独立地为：
[0025]
h，
[0026]
羟基，
[0027]
c1-c6烷基，
[0028]
被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的c1-c6烷基，
[0029]
c2-c6烯基，
[0030]
c2-c6炔基，
[0031]
c1-c6烷氧基，
[0032]
c1-c6氨基烷氧基，
[0033]
卤素，
[0034]
硝基，
[0035]
氰基，
[0036]
巯基，
[0037]
烷硫基，
[0038]
氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基，
[0039]
在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基氨基，
[0040]
连接至杂环的c1-c6烷基，所述杂环任选被一个或多个c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，
[0041]
连接至杂环的c1-c6烷基氨基，所述杂环任选被c1-c6烷基、c1-c6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，
[0042]
氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个c1-c6烷基取代，
[0043]
杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或c1-c6烷基取代，
[0044]
任选被氨基甲酰基保护基或c1-c6烷基取代的氨基甲酰基，
[0045]
吗啉-1-基，或
[0046]
哌啶-1-基；
[0047]
x3为c1-c6烷基；
[0048]
x4为h、-(ch2)
q-ch3、-(chrn)
q-ch3、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
q-ch3、亚芳基-ch3、-(ch2)
q-亚芳基-ch3、-亚芳基-(ch2)
q-ch3、-(ch2)
q-(c3-c8碳环基)-ch3、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
q-ch3、c3-c8杂环基、-(ch2)
q-(c3-c8杂环基)-ch3、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3或-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3；其中各rn独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0049]
**与l连接；
[0050]
y为0、1或2；
[0051]
y为o、s或cr1r2，其中r1和r2各自独立地为h或c1-c6烷基；
[0052]
s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。
[0053]
在一个或多个实施方式中，x4为h或c1-c6烷基。
[0054]
在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪(niverazine)、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。
[0055]
在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。
[0056]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**与l连接。
[0057]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**与l连接。
[0058]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为-ch3。
[0059]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f、cl、br或i。
[0060]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为f或cl。
[0061]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为f。
[0062]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为-ch3、f或-oh。
[0063]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f或-ch3。
[0064]
在一个或多个实施方式中，x1为-ch3及x2为f。
[0065]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-。
[0066]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-，r为1或5。
[0067]
在一个或多个实施方式中，各aa独立选自以下的氨基酸或肽序列：val-cit、val-lys、phe-lys、lys-lys、ala-lys、phe-cit、leu-cit、ile-cit、trp、cit、phe-ala、phe-phe-lys、d-phe-phe-lys、gly-phe-lys、leu-ala-leu、ile-ala-leu、val-ala-val、ala-leu-ala-leu、β-ala-leu-ala-leu和gly-phe-leu-gly。
[0068]
在一个或多个实施方式中，i为1。
[0069]
在一个或多个实施方式中，aa为val-cit，i为1。
[0070]
在一个或多个实施方式中，各ff独立为在一个或多个实施方式中，各ff独立为其中*连接aa，**连接d，其中各rf独立为c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、-no2或卤素。
[0071]
在一个或多个实施方式中，卤素为f。
[0072]
在一个或多个实施方式中，各rf独立为-ch3、f、-no2或-och3。
[0073]
在一个或多个实施方式中，z为0。
[0074]
在一个或多个实施方式中，z为1或2。
[0075]
在一个或多个实施方式中，f为1。
[0076]
在一个或多个实施方式中，各ff独立为在一个或多个实施方式中，各ff独立为在一个或多个实施方式中，各ff独立为在一个或多个实施方式中，各ff独立为其中*连接aa，**连接d。
[0077]
在一个或多个实施方式中，f为1。
[0078]
在一个或多个实施方式中，ff为f为1，其中*连接aa，**连接d。
[0079]
在一个或多个实施方式中，l为其中*连接b，**连接d。
(ch2)
r-(c3-c8杂环基)-、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2)
r-、-(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-和-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2)
r-；其中各rm独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0095]
d为药物，如抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；
[0096]
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；
[0097]
p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0098]
在一个或多个实施方式中，d为微管蛋白抑制剂、dna损伤剂或dna拓扑异构酶抑制剂。
[0099]
在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类及美登素(maytansine)类。
[0100]
在一个或多个实施方式中，d为奥瑞他汀(auristatin)类，例如单甲基澳瑞他汀e(monomethyl auristatin e；mmae)、单甲基澳瑞他汀f(monomethyl auristatin f；mmaf)、和澳瑞他汀f(auristatin f；af)。
[0101]
在一个或多个实施方式中，d为dna损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物pbd(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。
[0102]
在一个或多个实施方式中，d为dna拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物sn-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(d-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3h)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(苯基甲基)-(2e)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(3-羟基苯基丙基)-(e)-2-丙烯酰胺、12-β-d-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5h-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6h)-二酮、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。
[0103]
在一个或多个实施方式中，所述dna拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康，或其盐。
[0104]
在一个或多个实施方式中，d为tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、cc-1065及其类似物、amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(pbd)二聚体类、阿霉素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素c，马法兰，或苯丁酸氮芥衍生物。
(ch2)
q-亚芳基-ch3、-亚芳基-(ch2)
q-ch3、-(ch2)
q-(c3-c8碳环基)-ch3、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
q-ch3、c3-c8杂环基、-(ch2)
q-(c3-c8杂环基)-ch3、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、或-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3；其中各rn独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0131]
**为连接点；
[0132]
y为0、1或2；
[0133]
y为o、s或cr1r2，其中r1和r2各自独立地为h或c1-c6烷基；
[0134]
s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。
[0135]
在一个或多个实施方式中，x4为h或c1-c6烷基。
[0136]
在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。
[0137]
在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。
[0138]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0139]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0140]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为-ch3。
[0141]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f、cl、br或i。
[0142]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为f。
[0143]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为-ch3、f或-oh。
(ch2)
r-(c3-c8杂环基)-、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2)
r-、-(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-和-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2)
r-；其中各rm独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0161]
d为药物，如抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；
[0162]
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；
[0163]
p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0164]
在一个或多个实施方式中，d为微管蛋白抑制剂、dna损伤剂或dna拓扑异构酶抑制剂。
[0165]
在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、及美登素(maytansine)类。
[0166]
在一个或多个实施方式中，d为奥瑞他汀(auristatin)类，例如单甲基澳瑞他汀e(monomethyl auristatin e；mmae)、单甲基澳瑞他汀f(monomethyl auristatin f；mmaf)、和澳瑞他汀f(auristatin f；af)。
[0167]
在一个或多个实施方式中，d为dna损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物pbd(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。
[0168]
在一个或多个实施方式中，d为dna拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物sn-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(d-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3h)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(苯基甲基)-(2e)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(3-羟基苯基丙基)-(e)-2-丙烯酰胺、12-β-d-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5h-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6h)-二酮、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。
[0169]
在一个或多个实施方式中，所述dna拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康，或其盐。
[0170]
在一个或多个实施方式中，d为tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、cc-1065及其类似物、amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(pbd)二聚体类、阿霉素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素c，马法兰，或苯丁酸氮芥衍生物。
(ch2)
q-ch3、c3-c8杂环基、-(ch2)
q-(c3-c8杂环基)-ch3、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、或-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3；其中各rn独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0198]
**为连接点；
[0199]
y为0、1或2；
[0200]
y为o、s或cr1r2，其中r1和r2各自独立地为h或c1-c6烷基；
[0201]
s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。
[0202]
在一个或多个实施方式中，x4为h或c1-c6烷基。
[0203]
在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。
[0204]
在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。
[0205]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0206]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0207]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为-ch3。
[0208]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f、cl、br或i。
[0209]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为f。
[0210]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为-ch3、f或-oh。
[0211]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f或-ch3。
[0212]
在一个或多个实施方式中，x1为-ch3及x2为f。
[0213]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-。
[0214]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-，r为1或5。
[0215]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0216]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0217]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0218]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0219]
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
[0220]
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
[0221]
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
[0222]
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
[0223]
在一个或多个实施方式中，所述式i为：
[0224][0225]
其中
[0226]
abu为多肽，如抗体或其抗原结合单元；
[0227]
d为药物，如抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；
[0228]
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；
[0229]
p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0230]
在一个或多个实施方式中，其中所述式i为：
[0231][0232][0233]
其中
[0234]
abu为多肽，如抗体或其抗原结合单元；
[0235]
d为药物，如抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；
[0236]
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；
[0237]
p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0238]
在一个或多个实施方式中，d为微管蛋白抑制剂、dna损伤剂或dna拓扑异构酶抑制剂。
[0239]
在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、及美登素(maytansine)类。
[0240]
在一个或多个实施方式中，d为奥瑞他汀(auristatin)类，例如单甲基澳瑞他汀e(monomethyl auristatin e；mmae)、单甲基澳瑞他汀f(monomethyl auristatin f；mmaf)、和澳瑞他汀f(auristatin f；af)。
[0241]
在一个或多个实施方式中，d为dna损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物pbd(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)、dna拓扑异构酶抑制剂。
[0242]
在一个或多个实施方式中，d为dna拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物sn-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(d-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3h)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(苯基甲基)-(2e)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(3-羟基苯基丙基)-(e)-2-丙烯酰胺、12-β-d-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5h-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6h)-二酮、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。
[0243]
在一个或多个实施方式中，所述dna拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康，或其盐。
[0244]
在一个或多个实施方式中，d为tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、cc-1065及其类似物、amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(pbd)二聚体类、阿霉素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素c，马法兰，或苯丁酸氮芥衍生物。
[0245]
在一个或多个实施方式中，d为其中
[0246]
x1和x2各自独立地为：
[0247]
h，
[0248]
羟基，
[0249]
c1-c6烷基，
[0250]
被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的c1-c6烷基，
[0251]
c2-c6烯基，
[0252]
c2-c6炔基，
[0253]
c1-c6烷氧基，
[0254]
c1-c6氨基烷氧基，
[0255]
卤素，
[0256]
硝基，
[0257]
氰基，
[0258]
巯基，
[0259]
烷硫基，
[0260]
氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基，
[0261]
在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基氨基，
[0262]
连接至杂环的c1-c6烷基，所述杂环任选被一个或多个c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，
[0263]
连接至杂环的c1-c6烷基氨基，所述杂环任选被c1-c6烷基、c1-c6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，
[0264]
氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个c1-c6烷基取代，
[0265]
杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或c1-c6烷基取代，
[0266]
任选被氨基甲酰基保护基或c1-c6烷基取代的氨基甲酰基，
[0267]
吗啉-1-基，或
[0268]
哌啶-1-基；
[0269]
x3为c1-c6烷基；
[0270]
x4为h、-(ch2)
q-ch3、-(chrn)
q-ch3、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
q-ch3、亚芳基-ch3、-(ch2)
q-亚芳基-ch3、-亚芳基-(ch2)
q-ch3、-(ch2)
q-(c3-c8碳环基)-ch3、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
q-ch3、c3-c8杂环基、-(ch2)
q-(c3-c8杂环基)-ch3、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、或-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3；其中各rn独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0271]
**为连接点；
[0272]
y为0、1或2；
[0273]
y为o、s或cr1r2，其中r1和r2各自独立地为h或c1-c6烷基；
[0274]
s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。
[0275]
在一个或多个实施方式中，x4为h或c1-c6烷基。
[0276]
在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。
[0277]
在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。
[0278]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0279]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0280]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为-ch3。
[0281]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f、cl、br或i。
[0282]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为f。
[0283]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为-ch3、f或-oh。
[0284]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f或-ch3。
[0285]
在一个或多个实施方式中，x1为-ch3及x2为f。
[0286]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0287]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0288]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0289]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0290]
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
[0291]
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
[0292]
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
[0293]
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
[0294]
在一个或多个实施方式中，所述式i为：
[0295]
[0296]
[0297]
[0298]
[0299]
[0300][0301]
其中
[0302]
abu为多肽，如抗体或其抗原结合单元；
[0303]
d为药物，如抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；
[0304]
p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0305]
在一个或多个实施方式中，d为微管蛋白抑制剂、dna损伤剂或dna拓扑异构酶抑制剂。
[0306]
在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、及美登素(maytansine)类。
[0307]
在一个或多个实施方式中，d为奥瑞他汀(auristatin)类，例如单甲基澳瑞他汀e(monomethyl auristatin e；mmae)、单甲基澳瑞他汀f(monomethyl auristatin f；mmaf)、和澳瑞他汀f(auristatin f；af)。
[0308]
在一个或多个实施方式中，d为dna损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物pbd(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。
[0309]
在一个或多个实施方式中，d为dna拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物sn-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(d-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3h)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(苯基甲基)-(2e)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(3-羟基苯基丙基)-(e)-2-丙烯酰胺、12-β-d-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5h-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6h)-二酮、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。
[0310]
在一个或多个实施方式中，所述dna拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康，或其盐。
[0311]
在一个或多个实施方式中，d为tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、cc-1065及其类似物、amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(pbd)二聚体类、阿霉
素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素c，马法兰，或苯丁酸氮芥衍生物。
[0312]
在一个或多个实施方式中，d为
[0313]
其中
[0314]
x1和x2各自独立地为：
[0315]
h，
[0316]
羟基，
[0317]
c1-c6烷基，
[0318]
被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的c1-c6烷基，
[0319]
c2-c6烯基，
[0320]
c2-c6炔基，
[0321]
c1-c6烷氧基，
[0322]
c1-c6氨基烷氧基，
[0323]
卤素，
[0324]
硝基，
[0325]
氰基，
[0326]
巯基，
[0327]
烷硫基，
[0328]
氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基，
[0329]
在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基氨基，
[0330]
连接至杂环的c1-c6烷基，所述杂环任选被一个或多个c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，
[0331]
连接至杂环的c1-c6烷基氨基，所述杂环任选被c1-c6烷基、c1-c6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，
[0332]
氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个c1-c6烷基取代，
[0333]
杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或c1-c6烷基取代，
[0334]
任选被氨基甲酰基保护基或c1-c6烷基取代的氨基甲酰基，
[0335]
吗啉-1-基，或
[0336]
哌啶-1-基；
[0337]
x3为c1-c6烷基；
[0338]
x4为h、-(ch2)
q-ch3、-(chrn)
q-ch3、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
q-ch3、亚芳基-ch3、-(ch2)
q-亚芳基-ch3、-亚芳基-(ch2)
q-ch3、-(ch2)
q-(c3-c8碳环基)-ch3、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
q-ch3、c3-c8杂环基、-(ch2)
q-(c3-c8杂环基)-ch3、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、或-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3；其中各rn独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0339]
**为连接点；
[0340]
y为0、1或2；
[0341]
y为o、s或cr1r2，其中r1和r2各自独立地为h或c1-c6烷基；
[0342]
s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。
[0343]
在一个或多个实施方式中，x4为h或c1-c6烷基。
[0344]
在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。
[0345]
在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。
[0346]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0347]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0348]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为-ch3。
[0349]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f、cl、br或i。
[0350]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为f。
[0351]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为-ch3、f或-oh。
[0352]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f或-ch3。
[0353]
在一个或多个实施方式中，x1为-ch3及x2为f。
[0354]
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
[0355]
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
[0356]
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
[0357]
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
[0358]
在一个或多个实施方式中，所述式i为：
[0359]
[0360]
[0361]
[0362]
[0363]
[0364]
[0365]
[0366]
[0367]
[0368][0369]
其中
[0370]
abu为药物，如抗体或其抗原结合单元；
[0371]
p为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0372]
在一个或多个实施方式中，abu为序列中含有半胱氨酸的多肽，并通过半胱氨酸的
硫原子与药物偶联物其他部分(如式i的m)连接。
[0373]
在一个或多个实施方式中，abu为含有fc区的多肽。在一个或多个实施方式中，abu通过fc区与药物偶联物其他部分(如式i的m)连接。
[0374]
在一个或多个实施方式中，abu结合的靶点选自：her2、trop-2、nection-4、b7h3、b7h4、cldn18、bmpr1b、e16、steap1、0772p、mpf、napi3b、sema5b、pscahlg、etbr、msg783、steap2、trpm4、cripto、cd20、cd21、cd22、cd30、fcrh2、nca、mdp、il20rα、短蛋白聚糖(brevican)、ephb2r、aslg659、psca、geda、baff-r、cd79a、cd79b、cxcr5、hla-dob、p2x5、cd72、ly64、fcrh1、irta2、tenb2、pmel17、tmeff1、gdnf-ra1、ly6e、tmem46、ly6g6d、lgr5、ret、ly6k、gpr19、gpr54、asphd1、酪氨酸酶、tmem118、epcam、ror1、gpr172a、fralpha(frα)。
[0375]
在一个或多个实施方式中，abu结合的靶点为her2、trop-2、cldn18.2、b7h3或frα。
[0376]
在一个或多个实施方式中，abu为抗体或其抗原结合单元，药物偶联物为抗体药物偶联物。
[0377]
在一个或多个实施方式中，abu为含有fc区的抗体或其抗原结合单元。在一个或多个实施方式中，所述fc区为人igg1,igg2,igg3 or igg4 fc区。
[0378]
在一个或多个实施方式中，abu通过fc区与药物偶联物其他部分(如式i的m)连接。
[0379]
在一个或多个实施方式中，abu为单域抗体。
[0380]
在一个或多个实施方式中，abu为fab片段。
[0381]
在一个或多个实施方式中，abu为单链抗体。
[0382]
在一个或多个实施方式中，abu为全抗。
[0383]
在一个或多个实施方式中，abu为抗her2抗体、抗trop2抗体、抗cldn18.2抗体、抗b7h3抗体或抗frα抗体。在一个或多个实施方式中，abu为抗her2单克隆抗体、抗trop2单克隆抗体、抗cldn18.2单克隆抗体、抗b7h3单克隆抗体或抗frα单克隆抗体。
[0384]
在一个或多个实施方式中，abu为曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、马妥珠单抗、利妥昔单抗、或西妥昔单抗。
[0385]
在一个或多个实施方式中，abu为抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含(a)-(f)中的一个或多个，其中：
[0386]
(a)vh cdr1，其包含如seq id no:7所示的氨基酸序列或由其组成；
[0387]
(b)vh cdr2，其包含如seq id no:8所示的氨基酸序列或由其组成；
[0388]
(c)vh cdr3，其包含如seq id no:9所示的氨基酸序列或由其组成；
[0389]
(d)vl cdr1，其包含如seq id no:10所示的氨基酸序列或由其组成；
[0390]
(e)vl cdr2，其包含如seq id no:11所示的氨基酸序列或由其组成；
[0391]
(f)vl cdr3，其包含如seq id no:12所示的氨基酸序列或由其组成。
[0392]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含如下cdr：
[0393]
(a)vh cdr1，其包含如seq id no:7所示的氨基酸序列或由其组成；
[0394]
(b)vh cdr2，其包含如seq id no:8所示的氨基酸序列或由其组成；
[0395]
(c)vh cdr3，其包含如seq id no:9所示的氨基酸序列或由其组成；
[0396]
(d)vl cdr1，其包含如seq id no:10所示的氨基酸序列或由其组成；
[0397]
(e)vl cdr2，其包含如seq id no:11所示的氨基酸序列或由其组成；
[0398]
(f)vl cdr3，其包含如seq id no:12所示的氨基酸序列或由其组成。
[0399]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含如seq id no:7所示的vh cdr1、如seq id no:8所示的vh cdr2、如seq id no:9所示的vh cdr3、如seq id no:10所示的vl cdr1、如seq id no:11所示的vl cdr2和如seq id no:12所示的vlcdr3。
[0400]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含重链可变区和轻链可变区；其中所述重链可变区包含如seq id no:13所示序列，或与seq id no:13所示序列相比具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:13所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0401]
所述轻链可变区包含如seq id no:14所示序列，或与seq id no:14所示序列相比具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:14所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0402]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含如seq id no:15或16所示的氨基酸序列。
[0403]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含如seq id no:17所示的氨基酸序列。
[0404]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含如seq id no:15所示的氨基酸序列；所述轻链恒定区包含如seq id no:17所示的氨基酸序列。
[0405]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含如seq id no:16所示的氨基酸序列；所述轻链恒定区包含如seq id no:17所示的氨基酸序列。
[0406]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体为h239h-2b-k-6a-1抗体，其重链可变区氨基酸序列如seq id no:13所示，重链恒定区氨基酸序列如seq id no:15所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:14所示，轻链恒定区氨基酸序列如seq id no:17所示。
[0407]
在一个或多个实施方式中，所述抗体为h239h-2b-k-6a-2抗体，其重链可变区氨基酸序列如seq id no:13所示，重链恒定区氨基酸序列如seq id no:16所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:14所示，轻链恒定区氨基酸序列如seq id no:17所示。
[0408]
在一个或多个实施方式中，所述抗体包含与h239h-2b-k-6a-1抗体相比具有至少80％同一性的序列，或与h239h-2b-k-6a-1抗体相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一个或多个实施方式中，所述抗体包含与h239h-2b-k-6a-2抗体相比具有至少80％同一性的序列，或与h239h-2b-k-6a-2抗体相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一个或多个实施方式中，abu为h239h-2b-k-6a-1抗体，其中所述抗体的轻链氨基酸序列如seq id no:20所示，重链氨基酸序列如seq id no:18所示。
[0409]
在一个或多个实施方式中，abu为h239h-2b-k-6a-2抗体，其中所述抗体的轻链氨基酸序列如seq id no:20所示，重链氨基酸序列如seq id no:19所示。
[0410]
在一个或多个实施方式中，abu为抗b7h3抗体或其抗原结合单元。
[0411]
在一个或多个实施方案中，所述抗b7h3抗体的重链氨基酸序列如seq id no:21所示，轻链氨基酸序列如seq id no:22所示。
[0412]
在一个或多个实施方式中，abu为抗frα抗体或其抗原结合单元。
[0413]
在一个或多个实施方案中，所述抗frα抗体的重链氨基酸序列如seq id no:23所示，轻链氨基酸序列如seq id no:24所示。
[0414]
在一个或多个实施方式中，所述抗体包含与任一上述抗体相比具有至少80％同一性的序列，或与任一上述抗体相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0415]
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
[0416]
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
[0417]
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
[0418]
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
[0419]
一个或多个实施方式提供了形成药物偶联物，如抗体药物偶联物，的连接子前体，其为式ii的化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：
[0420][0421]
其中
[0422]
m’为其中*连接b，r选自：-(ch2)
r-、-(chrm)r-、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
r-、亚芳基、-(ch2)
r-、亚芳基-、-亚芳基-(ch2)r-、-(ch2)
r-(c3-c8碳环基)-、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
r-、c3-c8杂环基、-(ch2)
r-(c3-c8杂环基)-、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2)
r-、-(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-和-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2)
r-；其中各rm独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0423]
b为其中*连接m’，**连接l’，***连接g；
[0424]
l’为-(aa)
i-(ff’)
f-，其中，aa为氨基酸或多肽，i是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；各ff’独立为
其中各rf独立为c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、-no2或卤素；z为0、1、2、3或4；f为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；其中*连接aa；
[0425]
g为其中n为1-24，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0426]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-。
[0427]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-，r为1或5。
[0428]
在一个或多个实施方式中，各aa独立选自以下氨基酸或肽序列：val-cit、val-lys、phe-lys、lys-lys、ala-lys、phe-cit、leu-cit、ile-cit、trp、cit、phe-ala、phe-phe-lys、d-phe-phe-lys、gly-phe-lys、leu-ala-leu、ile-ala-leu、val-ala-val、ala-leu-ala-leu、β-ala-leu-ala-leu和gly-phe-leu-gly。
[0429]
在一个或多个实施方式中，i为1。
[0430]
在一个或多个实施方式中，aa为val-cit，i为1。
[0431]
在一个或多个实施方式中，各ff’独立为独立为
其中*连接aa；其中各rf独立为c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、-no2或卤素。
[0432]
在一个或多个实施方式中，rf为f。
[0433]
在一个或多个实施方式中，z为0。
[0434]
在一个或多个实施方式中，z为1或2。
[0435]
在一个或多个实施方式中，f为1。
[0436]
在一个或多个实施方式中，b为其中*连接m’，**连接l’，***连接g。
[0437]
在一个或多个实施方式中，各ff’独立为
其中*连接aa。
[0438]
在一个或多个实施方式中，f为1。
[0439]
在一个或多个实施方式中，ff’为为f为1，其中*连接aa。
[0440]
在一个或多个实施方式中，l’为
其中*连接b。
[0441]
在一个或多个实施方式中，l’为为其中*连接b。
[0442]
在一个或多个实施方式中，l’为为其中*连接b。
[0443]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-。
[0444]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-，r为1或5。
[0445]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0446]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0447]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0448]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0449]
在一个或多个实施方式中，所述式ii为：
[0450][0451][0452]
其中
[0453]
r选自：-(ch2)
r-、-(chrm)r-、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
r-、亚芳基、-(ch2)
r-亚芳基-、-亚芳基-(ch2)r-、-(ch2)
r-(c3-c8碳环基)-、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
r-、c3-c8杂环基、-(ch2)
r-(c3-c8杂环基)-、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2)
r-、-(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-和-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2)
r-；其中各rm独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0454]
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0455]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-。
[0456]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-，r为1或5。
[0457]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0458]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0459]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0460]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0461]
在一个或多个实施方式中，所述式ii为：
[0462][0463][0464]
其中
[0465]
r选自：-(ch2)
r-、-(chrm)r-、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
r-、亚芳基、-(ch2)
r-亚芳基-、-亚芳基-(ch2)r-、-(ch2)
r-(c3-c8碳环基)-、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
r-、c3-c8杂环基、-(ch2)
r-(c3-c8杂环基)-、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2)
r-、-(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-和-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2)
r-；其中各rm独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0466]
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0467]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-。
[0468]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-，r为1或5。
[0469]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0470]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0471]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0472]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0473]
在一个或多个实施方式中，所述式ii为：
[0474][0475]
其中n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0476]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0477]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0478]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0479]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0480]
在一个或多个实施方式中，所述式ii为：
[0481]
[0482][0483]
其中n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0484]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0485]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0486]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0487]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0488]
在一个或多个实施方式中，式ii具有以下结构：
[0489]
[0490]
[0491]
[0492]
[0493]
[0494]
[0495]
[0496]
[0497][0498]
一个或多个实施方式提供了形成药物偶联物，如抗体药物偶联物的中间体，其为式iii的化合物或其立体异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：
[0499][0500]
d为药物，如抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；
[0501]
m’为其中*连接b，r选自：-(ch2)
r-、-(chrm)r-、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
r-、亚芳基、-(ch2)
r-、亚芳基-、-亚芳基-(ch2)r-、-(ch2)
r-(c3-c8碳环基)-、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
r-、c3-c8杂环基、-(ch2)
r-(c3-c8杂环基)-、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2)
r-、-(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-和-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2)
r-；其中各rm独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0502]
b为其中*连接m’，**连接l，***连接g；
[0503]
l为-(aa)
i-(ff)
f-，其中，aa为氨基酸或多肽，i是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；各ff独立为13、14、15、16、17、18、19或20；各ff独立为其中各rf独立为c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、-no2或卤素；z为0、1、2、3或4；f为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；其中*连接aa，**连接d；
[0504]
g为其中n为1-24，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0505]
在一个或多个实施方式中，d为抗癌药物。
[0506]
在一个或多个实施方式中，d为微管蛋白抑制剂、dna损伤剂或dna拓扑异构酶抑制剂。
[0507]
在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、及美登素(maytansine)类。
[0508]
在一个或多个实施方式中，d为奥瑞他汀(auristatin)类，选自单甲基澳瑞他汀e(monomethyl auristatin e；mmae)、单甲基澳瑞他汀f(monomethyl auristatin f；mmaf)、和澳瑞他汀f(auristatin f；af)。
[0509]
在一个或多个实施方式中，d为dna损伤剂，选自卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物pbd(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。
[0510]
在一个或多个实施方式中，d为dna拓扑异构酶抑制剂或其盐，选自伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物sn-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(d-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3h)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(苯基甲基)-(2e)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(3-羟基苯基丙基)-(e)-2-丙烯酰胺、12-β-d-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5h-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6h)-二酮、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、n-[2-(二甲基氨基)
乙基]-4-吖啶甲酰胺。
[0511]
在一个或多个实施方式中，所述dna拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康，或其盐。
[0512]
在一个或多个实施方式中，d为其中
[0513]
x1和x2各自独立地为：
[0514]
h，
[0515]
羟基，
[0516]
c1-c6烷基，
[0517]
被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的c1-c6烷基，
[0518]
c2-c6烯基，
[0519]
c2-c6炔基，
[0520]
c1-c6烷氧基，
[0521]
c1-c6氨基烷氧基，
[0522]
卤素，
[0523]
硝基，
[0524]
氰基，
[0525]
巯基，
[0526]
烷硫基，
[0527]
氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基，
[0528]
在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基氨基，
[0529]
连接至杂环的c1-c6烷基，所述杂环任选被一个或多个c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，
[0530]
连接至杂环的c1-c6烷基氨基，所述杂环任选被c1-c6烷基、c1-c6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，
[0531]
氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个c1-c6烷基取代，
[0532]
杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或c1-c6烷基取代，
[0533]
任选被氨基甲酰基保护基或c1-c6烷基取代的氨基甲酰基，
[0534]
吗啉-1-基，或
[0535]
哌啶-1-基；
[0536]
x3为c1-c6烷基；
[0537]
x4为h、-(ch2)
q-ch3、-(chrn)
q-ch3、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
q-ch3、亚芳基-ch3、-(ch2)
q-亚芳基-ch3、-亚芳基-(ch2)
q-ch3、-(ch2)
q-(c3-c8碳环基)-ch3、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
q-ch3、c3-c8杂环基、-(ch2)
q-(c3-c8杂环基)-ch3、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、或-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3；其中各rn独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0538]
**与l连接；
[0539]
y为0、1或2；
[0540]
y为o、s或cr1r2，其中r1和r2各自独立地为h或c1-c6烷基；
[0541]
s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。
[0542]
在一个或多个实施方式中，x4为h或c1-c6烷基。
[0543]
在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。
[0544]
在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。
[0545]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**与l连接。
[0546]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**与l连接。
[0547]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为-ch3。
[0548]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f、cl、br或i。
[0549]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为f。
[0550]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为-ch3、f或-oh。
[0551]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f或-ch3。
[0552]
在一个或多个实施方式中，x1为-ch3及x2为f。
[0553]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-。
[0554]
在一个或多个实施方式中，r为1或5。
[0555]
在一个或多个实施方式中，b为其中*连接m’，**连接l，***连接g。
[0556]
在一个或多个实施方式中，各aa独立选自以下氨基酸或肽序列：val-cit、val-lys、phe-lys、lys-lys、ala-lys、phe-cit、leu-cit、ile-cit、trp、cit、phe-ala、phe-phe-lys、d-phe-phe-lys、gly-phe-lys、leu-ala-leu、ile-ala-leu、val-ala-val、ala-leu-ala-leu、β-ala-leu-ala-leu和gly-phe-leu-gly。
[0557]
在一个或多个实施方式中，i为1。
[0558]
在一个或多个实施方式中，aa为val-cit，i为1。
[0559]
在一个或多个实施方式中，各ff独立为各ff独立为其中*连接aa，**连接d，其中rf为c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、-no2或卤素。
[0560]
在一个或多个实施方式中，所述卤素为f。
[0561]
在一个或多个实施方式中，各rf独立为-ch3、f、-no2或-och3。
[0562]
在一个或多个实施方式中，z为0。
[0563]
在一个或多个实施方式中，z为1或2。
[0564]
在一个或多个实施方式中，f为1。
[0565]
在一个或多个实施方式中，ff为
f为1；其中*连接aa，**连接d。
[0566]
在一个或多个实施方式中，ff为f为1；其中*连接aa，**连接d。
[0567]
在一个或多个实施方式中，l为其中*连接b，**连接d。
[0568]
在一个或多个实施方式中，l为其中*连接b，**连接d。
[0569]
在一个或多个实施方式中，l为其中*连接b，**连接d。
[0570]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0571]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0572]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0573]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0574]
在一个或多个实施方式中，所述式iii为：
[0575][0576]
其中
[0577]
r选自：-(ch2)
r-、-(chrm)r-、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
r-、亚芳基、-(ch2)
r-亚芳基-、-亚芳基-(ch2)r-、-(ch2)
r-(c3-c8碳环基)-、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
r-、c3-c8杂环基、-(ch2)
r-(c3-c8杂环基)-、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2)
r-、-(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-和-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2)
r-；其中各rm独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0578]
d为药物，如抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；
[0579]
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0580]
在一个或多个实施方式中，d为微管蛋白抑制剂、dna损伤剂或dna拓扑异构酶抑制剂。
[0581]
在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、及美登素(maytansine)类。
[0582]
在一个或多个实施方式中，d为奥瑞他汀(auristatin)类，例如单甲基澳瑞他汀e(monomethyl auristatin e；mmae)、单甲基澳瑞他汀f(monomethyl auristatin f；mmaf)、和澳瑞他汀f(auristatin f；af)。
[0583]
在一个或多个实施方式中，d为dna损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物pbd(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。
[0584]
在一个或多个实施方式中，d为dna拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物sn-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(d-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3h)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(苯基甲基)-(2e)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(3-羟基苯基丙基)-(e)-2-丙烯酰胺、12-β-d-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5h-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6h)-二酮、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。
[0585]
在一个或多个实施方式中，所述dna拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康，或其盐。
[0586]
在一个或多个实施方式中，d为tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、cc-1065及其类似物、amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(pbd)二聚体类、阿霉素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素c，马法兰，或苯丁酸氮芥衍生物。
[0587]
在一个或多个实施方式中，d为
[0588]
其中
[0589]
x1和x2各自独立地为：
[0590]
h，
[0591]
羟基，
[0592]
c1-c6烷基，
[0593]
被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的c1-c6烷基，
[0594]
c2-c6烯基，
[0595]
c2-c6炔基，
[0596]
c1-c6烷氧基，
[0597]
c1-c6氨基烷氧基，
[0598]
卤素，
[0599]
硝基，
[0600]
氰基，
[0601]
巯基，
[0602]
烷硫基，
[0603]
氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基，
[0604]
在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基氨基，
[0605]
连接至杂环的c1-c6烷基，所述杂环任选被一个或多个c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，
[0606]
连接至杂环的c1-c6烷基氨基，所述杂环任选被c1-c6烷基、c1-c6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，
[0607]
氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个c1-c6烷基取代，
[0608]
杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或c1-c6烷基取代，
[0609]
任选被氨基甲酰基保护基或c1-c6烷基取代的氨基甲酰基，
[0610]
吗啉-1-基，或
[0611]
哌啶-1-基；
[0612]
x3为c1-c6烷基；
[0613]
x4为h、-(ch2)
q-ch3、-(chrn)
q-ch3、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
q-ch3、亚芳基-ch3、-(ch2)
q-亚芳基-ch3、-亚芳基-(ch2)
q-ch3、-(ch2)
q-(c3-c8碳环基)-ch3、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
q-ch3、c3-c8杂环基、-(ch2)
q-(c3-c8杂环基)-ch3、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、或-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3；其中各rn独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0614]
**为连接点；
[0615]
y为0、1或2；
[0616]
y为o、s或cr1r2，其中r1和r2各自独立地为h或c1-c6烷基；
[0617]
s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。
[0618]
在一个或多个实施方式中，x4为h或c1-c6烷基。
[0619]
在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。
[0620]
在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。
[0621]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0622]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0623]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为-ch3。
[0624]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f、cl、br或i。
[0625]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为f。
[0626]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为-ch3、f或-oh。
[0627]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f或-ch3。
[0628]
在一个或多个实施方式中，x1为-ch3及x2为f。
[0629]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-。
[0630]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-，r为1或5。
[0631]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0632]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0633]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0634]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0635]
在一个或多个实施方式中，所述式iii为：
[0636][0637]
其中
[0638]
r选自：-(ch2)
r-、-(chrm)r-、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
r-、亚芳基、-(ch2)
r-亚芳基-、-亚芳基-(ch2)r-、-(ch2)
r-(c3-c8碳环基)-、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
r-、c3-c8杂环基、-(ch2)
r-(c3-c8杂环基)-、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2)
r-、-(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-、-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2ch2o)
r-ch
2-和-(ch2ch2o)rc(o)nrm(ch2)
r-；其中各rm独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0639]
d为药物，如抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；
[0640]
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0641]
在一个或多个实施方式中，d为微管蛋白抑制剂、dna损伤剂或dna拓扑异构酶抑制剂。
[0642]
在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、及美登素(maytansine)类。
[0643]
在一个或多个实施方式中，d为奥瑞他汀(auristatin)类，例如单甲基澳瑞他汀e(monomethyl auristatin e；mmae)、单甲基澳瑞他汀f(monomethyl auristatin f；mmaf)、和澳瑞他汀f(auristatin f；af)。
[0644]
在一个或多个实施方式中，d为dna损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物pbd(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。
[0645]
在一个或多个实施方式中，d为dna拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物sn-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(d-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3h)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(苯基甲基)-(2e)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(3-羟基苯基丙基)-(e)-2-丙烯酰胺、12-β-d-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5h-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6h)-二酮、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。
[0646]
在一个或多个实施方式中，所述dna拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康，或其盐。
[0647]
在一个或多个实施方式中，d为tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、cc-1065及其类似物、amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(pbd)二聚体类、阿霉素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素c，马法兰或苯丁酸氮芥衍生物。
[0648]
在一个或多个实施方式中，d为
[0649]
其中
[0650]
x1和x2各自独立地为：
[0651]
h，
[0652]
羟基，
[0653]
c1-c6烷基，
[0654]
被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的c1-c6烷基，
[0655]
c2-c6烯基，
[0656]
c2-c6炔基，
[0657]
c1-c6烷氧基，
[0658]
c1-c6氨基烷氧基，
[0659]
卤素，
[0660]
硝基，
[0661]
氰基，
[0662]
巯基，
[0663]
烷硫基，
[0664]
氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基，
[0665]
在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基氨基，
[0666]
连接至杂环的c1-c6烷基，所述杂环任选被一个或多个c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，
[0667]
连接至杂环的c1-c6烷基氨基，所述杂环任选被c1-c6烷基、c1-c6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，
[0668]
氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个c1-c6烷基取代，
[0669]
杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或c1-c6烷基取代，
[0670]
任选被氨基甲酰基保护基或c1-c6烷基取代的氨基甲酰基，
[0671]
吗啉-1-基，或
[0672]
哌啶-1-基；
[0673]
x3为c1-c6烷基；
[0674]
x4为h、-(ch2)
q-ch3、-(chrn)
q-ch3、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
q-ch3、亚芳基-ch3、-(ch2)
q-亚芳基-ch3、-亚芳基-(ch2)
q-ch3、-(ch2)
q-(c3-c8碳环基)-ch3、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
q-ch3、c3-c8杂环基、-(ch2)
q-(c3-c8杂环基)-ch3、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、或-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3；其中各rn独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0675]
**为连接点；
[0676]
y为0、1或2；
[0677]
y为o、s或cr1r2，其中r1和r2各自独立地为h或c1-c6烷基；
[0678]
s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。
[0679]
在一个或多个实施方式中，x4为h或c1-c6烷基。
[0680]
在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。
[0681]
在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。
[0682]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0683]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0684]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为-ch3。
[0685]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f、cl、br或i。
[0686]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为f。
[0687]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为-ch3、f或-oh。
[0688]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f或-ch3。
[0689]
在一个或多个实施方式中，x1为-ch3及x2为f。
[0690]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-。
[0691]
在一个或多个实施方式中，r为-(ch2)
r-，r为1或5。
[0692]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0693]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0694]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0695]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0696]
在一个或多个实施方式中，所述式iii为：
[0697][0698]
其中
[0699]
d为药物，如抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；
[0700]
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0701]
在一个或多个实施方式中，d为微管蛋白抑制剂、dna损伤剂或dna拓扑异构酶抑制剂。
[0702]
在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、及美登素(maytansine)类。
[0703]
在一个或多个实施方式中，d为奥瑞他汀(auristatin)类，例如单甲基澳瑞他汀e(monomethyl auristatin e；mmae)、单甲基澳瑞他汀f(monomethyl auristatin f；mmaf)、和澳瑞他汀f(auristatin f；af)。
[0704]
在一个或多个实施方式中，d为dna损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物pbd(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。
[0705]
在一个或多个实施方式中，d为dna拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物sn-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(d-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3h)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(苯基甲基)-(2e)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(3-羟基苯基丙基)-(e)-2-丙烯酰胺、12-β-d-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5h-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6h)-二酮、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。
[0706]
在一个或多个实施方式中，所述dna拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康，或其盐。
[0707]
在一个或多个实施方式中，d为tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、cc-1065及其类似物、amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(pbd)二聚体类、阿霉素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素c，马法兰，或苯丁酸氮芥衍生物。
(ch2)
q-亚芳基-ch3、-亚芳基-(ch2)
q-ch3、-(ch2)
q-(c3-c8碳环基)-ch3、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
q-ch3、c3-c8杂环基、-(ch2)
q-(c3-c8杂环基)-ch3、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、或-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3；其中各rn独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0735]
**为连接点；
[0736]
y为0、1或2；
[0737]
y为o、s或cr1r2，其中r1和r2各自独立地为h或c1-c6烷基；
[0738]
s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。
[0739]
在一个或多个实施方式中，x4为h或c1-c6烷基。
[0740]
在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。
[0741]
在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。
[0742]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0743]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0744]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为-ch3。
[0745]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f、cl、br或i。
[0746]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为f。
[0747]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为-ch3、f或-oh。
[0748]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f或-ch3。
[0749]
在一个或多个实施方式中，x1为-ch3及x2为f。
[0750]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0751]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0752]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0753]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0754]
在一个或多个实施方式中，所述式iii为：
[0755][0756][0757]
其中
[0758]
d为药物，如抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；
[0759]
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
[0760]
在一个或多个实施方式中，d为微管蛋白抑制剂dna损伤剂或dna拓扑异构酶抑制剂。
[0761]
在一个或多个实施方式中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、及美登素(maytansine)类。
[0762]
在一个或多个实施方式中，d为奥瑞他汀(auristatin)类，例如单甲基澳瑞他汀e(monomethyl auristatin e；mmae)、单甲基澳瑞他汀f(monomethyl auristatin f；mmaf)、和澳瑞他汀f(auristatin f；af)。
[0763]
在一个或多个实施方式中，d为dna损伤剂，例如卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物pbd(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。
[0764]
在一个或多个实施方式中，d为dna拓扑异构酶抑制剂或其盐，例如伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物sn-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(d-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3h)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(苯基甲基)-(2e)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-n-(3-羟基苯基丙基)-(e)-2-丙烯酰胺、12-β-d-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5h-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6h)-二酮、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、n-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。
[0765]
在一个或多个实施方式中，所述dna拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康，或其盐。
[0766]
在一个或多个实施方式中，d为tubulysin类、紫杉类药物衍生物、leptomycine衍生物、cc-1065及其类似物、amatoxin类、剪接体抑制剂、苯(并)二卓氮(pbd)二聚体类、阿霉素、甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素c，马法兰，或苯丁酸氮芥衍生物。
[0767]
在一个或多个实施方式中，d为其中
[0768]
x1和x2各自独立地为：
[0769]
h，
[0770]
羟基，
[0771]
c1-c6烷基，
[0772]
被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的c1-c6烷基，
[0773]
c2-c6烯基，
[0774]
c2-c6炔基，
[0775]
c1-c6烷氧基，
[0776]
c1-c6氨基烷氧基，
[0777]
卤素，
[0778]
硝基，
[0779]
氰基，
[0780]
巯基，
[0781]
烷硫基，
[0782]
氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基，
[0783]
在氨基部分任选被氨基保护基或c1-c6烷基取代的c1-c6氨基烷基氨基，
[0784]
连接至杂环的c1-c6烷基，所述杂环任选被一个或多个c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，
[0785]
连接至杂环的c1-c6烷基氨基，所述杂环任选被c1-c6烷基、c1-c6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，
[0786]
氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个c1-c6烷基取代，
[0787]
杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或c1-c6烷基取代，
[0788]
任选被氨基甲酰基保护基或c1-c6烷基取代的氨基甲酰基，
[0789]
吗啉-1-基，或
[0790]
哌啶-1-基；
[0791]
x3为c1-c6烷基；
[0792]
x4为h、-(ch2)
q-ch3、-(chrn)
q-ch3、c3-c8碳环基、-o-(ch2)
q-ch3、亚芳基-ch3、-(ch2)
q-亚芳基-ch3、-亚芳基-(ch2)
q-ch3、-(ch2)
q-(c3-c8碳环基)-ch3、-(c3-c8碳环基)-(ch2)
q-ch3、c3-c8杂环基、-(ch2)
q-(c3-c8杂环基)-ch3、-(c3-c8杂环基)-(ch2)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch3、-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2ch2o)
q-ch
2-ch3、或-(ch2ch2o)qc(o)nrn(ch2)
q-ch3；其中各rn独立为h、c1-c6烷基、c3-c8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
[0793]
**为连接点；
[0794]
y为0、1或2；
[0795]
y为o、s或cr1r2，其中r1和r2各自独立地为h或c1-c6烷基；
[0796]
s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。
[0797]
在一个或多个实施方式中，x4为h或c1-c6烷基。
[0798]
在一个或多个实施方式中，所述杂环为氮杂环丁烷、乙醛嗪、吗啉、吡咯烷、哌啶、咪唑、噻唑、噁唑或吡啶。
[0799]
在一个或多个实施方式中，所述氨基保护基为甲酰基、乙酰基、三苯甲基、叔丁氧基羰基、苄基或对甲氧基苄氧基羰基。
[0800]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独
立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0801]
在一个或多个实施方式中，d为其中x1和x2各自独立地为c1-c6烷基、卤素或-oh；**为连接点。
[0802]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为-ch3。
[0803]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f、cl、br或i。
[0804]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自为f。
[0805]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为-ch3、f或-oh。
[0806]
在一个或多个实施方式中，x1和x2各自独立地为f或-ch3。
[0807]
在一个或多个实施方式中，x1为-ch3及x2为f。
[0808]
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
[0809]
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
[0810]
在一个或多个实施方式中，n为4。
[0811]
在一个或多个实施方式中，n为8。
[0812]
在一个或多个实施方式中，式iii选自以下结构：
[0813]
[0814]
[0815]
[0816]
[0817]
[0818]
[0819]
[0820]
[0821]
[0822][0823]
一个或多个实施方式提供了化合物(1s,9s)-1-氨基-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10h,13h苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-10,13，或者其药学上可接受的盐或溶剂合物。
[0824]
一个或多个实施方式提供了药物组合物，其包含药物偶联物，如抗体药物偶联物，或者其药学上可接受的盐或溶剂合物以及药物可接受的载体、赋形剂和/或辅料，以及任选的其他抗癌药物。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上
皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，所述药物组合物可以静脉给药、皮下给药、口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。
[0825]
在一些实施方案中，术语“药物可接受的载体”通常指是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂等。
[0826]
术语“载体”是指可以与活性成分一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在e.w.martin的remington's pharmaceutical sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或抗原结合片段，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。亲本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0827]
在一些实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物通常是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。
[0828]
一个或多个实施方式提供了药物偶联物在制备用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的药物中的用途。
[0829]
在一个或多个实施方式中，所述药物偶联物与其他抗癌药物联合使用。
[0830]
一个或多个实施方式提供了连接子或中间体或者其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备药物偶联物，如抗体药物偶联物，或者其药学上可接受的盐或溶剂合物中的用途。
[0831]
药学上可接受的盐包括药物偶联物，如抗体药物偶联物，与该技术领域众所周知的各种各样的有机和无机抗衡离子产生的药学上可接受的盐，仅仅示例性盐包括，当分子含有酸性官能团时，有机或无机盐如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、异丙胺、三甲胺、二乙胺基、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲葡糖胺、可可碱、嘌呤哌嗪、
哌啶、n-乙基、哌啶、多胺树脂及四烷基铵盐等；以及当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、马来酸盐和草酸盐。酸的其它非限制例子包括硫酸、硝酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸水杨酸等。溶剂合物包括水合物。这些盐通常可以通过常规方法通过使例如适当的酸或碱与本发明adc反应来制备。
[0832]
一个或多个实施方式提供了治疗癌症的方法，该方法包括对患者施用有效量的抗体药物偶联。所述有效量是指活性化合物或药剂的量，其导致研究人员﹑兽医﹑医生或其他临床医生正寻求的组织、系统、动物、个体以及人的生物或药用响应，这包含治疗一种疾病。
[0833]
通常，合适的剂量范围可以是约0.1～100毫克/千克，给药频率可以例如是每月给药一次，每两周给药一次，每三周给药一次，每三周给药两次，每四周给药三次，每周给药一次，每周给药两次等。例如，给药方式可以是静脉输注，静脉推注，也可以是皮下注射、肌肉注射等。
[0834]
一个或多个实施方式提供了药物偶联物，如抗体药物偶联物，其用作药物。
[0835]
一个或多个实施方式提供了药物偶联物，如抗体药物偶联物，或包含药物偶联物，如抗体药物偶联物，的药物组合物在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用。
[0836]
一个或多个实施方式提供了药物偶联物，如抗体药物偶联物，其用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病；所述癌症包括三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤、尿路上皮癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌(透明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌)、卵巢癌(如卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、胰腺癌、胃癌、卡波西肉瘤、肺癌(如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、宫颈癌、结肠直肠癌、食管癌、口腔鳞状细胞癌、前列腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、肝胆管癌、结肠直肠癌、t细胞淋巴瘤、子宫癌、肝癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤(如滑膜肉瘤和癌肉瘤)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、骨癌、皮肤癌(如基底细胞癌和鳞状细胞癌)、胰癌、恶性黑色素瘤、小肠癌、睾丸胚胎性癌、胎盘绒毛膜癌、睾丸癌、淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤)。
[0837]
一个或多个实施方式提供了制品，其包含药物偶联物或者药物组合物；
[0838]
容器；和
[0839]
包装插页、说明书或标签，其指示该化合物或者组合物用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病。
附图说明
[0840]
图1表示cho-cldn18.2细胞流式检测结果，图中从左至右依次是cho细胞和cho-cldn18.2细胞；
[0841]
图2表示adc8、adc10、adc11及adc12对cho-cldn18.2细胞增殖抑制剂量曲线。
[0842]
图3表示adc1旁观者效应。
[0843]
图4表示adc4旁观者效应。
[0844]
图5表示adc9、adc11及adc12旁观者效应。
[0845]
图6表示adc14的旁观者效应。
[0846]
图7表示adc16的旁观者效应。
[0847]
图8表示adc4大鼠体内血药浓度变化。
[0848]
图9表示adc4抑制肿瘤生长的作用。
[0849]
图10表示adc1和adc2抑制肿瘤生长的作用。
[0850]
图11表示adc4和adc6抑制肿瘤生长的作用。
[0851]
图12表示adc9、adc11和adc12抑制肿瘤生长的作用。
[0852]
图13表示adc9、adc11、adc12和adc13在ga0006异种移植模型中各组小鼠肿瘤重量(平均值
±
标准误)。
[0853]
图14表示adc14的体内肿瘤抑制活性。
[0854]
图15表示adc16的体内肿瘤抑制作用。
[0855]
图16表示adc16的体内肿瘤抑制作用。
具体实施方式
[0856]“烷基”指饱和脂肪族烃基基团，该术语包括直链和支链烃基。例如，c1-c20烷基，如c1-c6烷基。c1-c20烷基指具有1至20个碳原子的烷基，例如具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子、6个碳原子、7个碳原子、8个碳原子、9个碳原子、10个碳原子、11个碳原子、12个碳原子、13个碳原子、14个碳原子、15个碳原子、16个碳原子、17个碳原子、18个碳原子、19个碳原子或20个碳原子的烷基。烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基等。所述烷基可以是非取代的或被一个或多个取代基所取代，所述取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羟基、羰基、羧基、芳基、杂芳基、胺基、卤素、磺酰基、亚磺酰基、膦酰基等。
[0857]“碳环基”是指仅仅由碳和氢原子组成的稳定的非芳香族的单环或多环的烃自由基，其可包括稠合或桥接环系统，具有3至15个碳原子，例如具有3至10个(例如3、4、5、6、7、8、9或10个)碳原子，并且其是饱和的或不饱和的并且通过单键与分子的剩余部分连接。单环自由基包括，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环自由基包括，例如金刚烷基、降冰片基、十氢萘基等。当在说明书中具体说明时，碳环基可被独立地选自下列中的一种或多种取代基任选取代：烷基、卤素、卤代烷基、氰基、硝基、氧代、芳基、芳烷基、碳环基、碳环基烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基、杂芳基烷基。
[0858]“芳基”指具有完全共轭的π电子体系的全碳单环或全碳稠合环，通常具有5-14个碳原子，例如，6个、10个、12个、14个碳原子。芳基可以是非取代的，或被一个或多个取代基所取代，所述取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羟基、羧基、芳基、芳烷基、胺基、卤素、磺酰基、亚磺酰基、膦酰基。非取代的芳基实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。
[0859]“杂环基”是指稳定的3元至18元芳香性或非芳香性环取代基，其由2至8个(例如2、3、4、5、6、7或8个)碳原子和选自氮、氧和硫中的1至6个(1、2、3、4、5或6个)杂原子组成。除非在说明书中另外具体说明，杂环基可以是单环、双环、三环或四环环系统，其可以包括稠合或桥接环系统；且杂环基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子任选地被季铵化；且杂环基可以部分或完全饱和。此类杂环基的实例包括但不限于，二氧戊环基、二噁英基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、
哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、哌咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、1,2,4-亚噻二唑-5(4h)-基、四氢呋喃基、三氧杂环己基、三噻烷基、三嗪烷基(triazinanyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫代吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。当在说明书中具体说明时，杂环基可以被选自下列中的一个或多个取代基任选取代：烷基、烯基、卤素、卤代烷基、氰基、氧代、硫代(thioxo)、硝基、芳基、芳烷基、环烃基、环烃基烷基、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基。
[0860]“烷氧基”是指式-o-(烷基)，其中烷基为本文定义的烷基。烷氧基的非限制性列举为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。烷氧基可为取代的或未取代的。
[0861]“卤素”是指氟(f)、氯(cl)、溴(br)、或碘(i)。
[0862]“氨基”指-nh2。
[0863]“氰基”，是指-cn。
[0864]“硝基”指-no2。
[0865]“羟基”，是指-oh。
[0866]“羧基”，是指-cooh。
[0867]“巯基”是指-sh。
[0868]“羰基”是指c＝o。
[0869]“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的两个或更多个氨基酸单体构成的分子，可以包括二肽、三肽、四肽、寡肽等。
[0870]“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸和β-氨基酸。氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：ala，一字母代码：a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、缬氨酸(val，v)、肌氨酸(sar)、茶氨酸(thea)、羟脯氨酸(hypro)、羟赖氨酸(hylys)、β-氨基异丁酸(β-aiba)、瓜氨酸(cit)和β-丙氨酸(β-ala)等。
[0871]
本领域技术人员理解当氨基酸或多肽作为一个分子(如抗体或adc)的组成部分时，氨基酸或多肽指氨基酸残基或多肽残基(不论是否写明)，即其在与该分子的其他部分结合时，其部分基团(例如其氨基一个氢原子和/或羧基的羟基)因其与分子的其他部分形成共价键(如酰胺键)而失去后的剩余部分。
[0872]
抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变化都涵盖在本公开之内，条件是氨基酸序列的同一性保持至少75％、如至少80％、90％、95％并又如99％。在一个或多个实施方式中，变化为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的取代。基因编码的氨基酸大致分以下类：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸盐、谷氨酸盐；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及(4)无电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。其它家族的氨基酸包括(i)脂肪族-羟基家族的丝氨酸和苏氨酸；(ii)含酰胺家族的天冬酰胺和谷氨酰胺；(iii)脂肪族家族的丙氨
酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；以及(iv)芳族家族的苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一个或多个实施方式中，保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。例如，可以合理地预测用异亮氨酸或缬氨酸单独的置换亮氨酸，用谷氨酸盐置换天冬氨酸盐，用丝氨酸置换苏氨酸，或用一个结构相关的氨基酸类似的置换一个氨基酸，且对所得分子的结合或特性不会有重要影响，特别是该置换不涉及结合位点内的氨基酸。氨基酸改变是否产生功能性肽可以容易地通过测定多肽衍生物的比活性来确定。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可由本领域普通技术人员容易地制备。
[0873]
在一个或多个实施方式中，氨基酸取代具有如下效果：(1)降低对蛋白水解作用的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变用于形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改进此类类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可包括序列不同于天然存在的肽序列的各种突变蛋白。例如，可在天然存在的序列(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)中进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应当显著改变亲本序列的结构特性(例如，置换的氨基酸不应当趋于破坏亲本序列中存在的螺旋结构，或破坏表征亲本序列的其它类型二级结构)。人工识别的多肽的二级和三级结构的示例描述于proteins,structures and molecular principles(creighton编辑，w.h.freeman and company,new york(1984))；introduction to protein structure(c.branden和j.tooze编辑，garland publishing,new york,n.y.(1991))；和thornton等人nature 354:105(1991)。
[0874]
vl、vh的保守氨基酸取代的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。重链恒定区、轻链恒定区、重链或轻链的保守氨基酸取代的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个、约18个、约19个、约22个、约24个、约25个、约29个、约31个、约35个、约38个、约41个、约45个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。
[0875]
术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。
[0876]“同源性”、“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性或同一性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的或同一的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。“至少80％同一性”为约80％同一性、约81％同一性、约82％同一性、约83％同一性、约85％同一性、约86％同一性、约87％同一性、约88％同一性、约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约94％同一性、约95％同一性、约98％同一性、约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。“至少90％同一性”为约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约93％同一性、约95％同一性、约96％同一性、约97％同一性、约98％同一性、约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。
[0877]“抗体”、“抗原结合片段”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体
可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。抗体和抗原结合片段包括但不局限重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(cdr)、重链可变区(vh)、轻链可变区(vl)、重链恒定区(ch)、轻链恒定区(cl)、框架区(fr)或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。cdr区包括轻链可变区的cdr区(vl cdr1-3)和重链可变区的cdr区(vh cdr1-3)。抗体或其抗原结合单元可以特异性识别和结合一个或多个(如两个)抗原的多肽或多肽复合物。特异性识别和结合多个(如两个)抗原的抗体或其抗原结合单元可以被称为多特异性(如双特异性)抗体或其抗原结合单元。
[0878]
术语“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的一部分，本发明抗体片段的组成形式可类似于单特异性抗体片段中的f(ab')2、f(ab)2、fab'、fab、fv、scfv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗原结合片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
[0879]
术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为igg、igm、iga、igg或ige。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、igg5等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。在一个或多个实施方式中，免疫球蛋白分子为igg种类。两条重链和两条轻链通过二硫键以“y”构型连接，其中轻链从“y”口开始并延续通过可变区包围重链。
[0880]
本发明公开的抗体、抗原结合片段或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、全人源、人源化、灵长类化、嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段(例如类fab、类fab'和类f(ab')2)、类单链fvs(scfv)。
[0881]
轻链可以分为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤、b细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从y构型的叉状末端的n末端延伸至每条链底部的c末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为vλ。
[0882]
轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能被使用。轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)决定了抗原识别和特异性。轻链恒定区(cl)和重链恒定区(ch)赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。n端部分是可变区，c端部分是恒定区；ch3和cl结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
[0883]
本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括但不限于鱼类、鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。
[0884]“重链恒定区”包括ch1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域，或变体或片段中的至少一种。抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自igg1分子的ch1结构域和源自igg3分子的
铰链区。在另一实施方案中，重链恒定区可以包括部分源自igg1分子和部分源自igg3分子的铰链区。在另一实施方案中，部分重链可以包括部分源自igg1分子和部分源自igg4分子的嵌合铰链区。
[0885]“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的一部分氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链-重链对”是指可通过轻链的cl结构域和重链的ch1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
[0886]
术语“抗体药物偶联物”或“adc”是指与一个或多个化学药物连接的结合多肽(如抗体或其抗原结合单元)，其可以任选地为治疗剂或细胞毒性剂。在优选的实施例中，adc包括抗体，药物(例如细胞毒性药物)和能够使药物与抗体附接或偶联的接头。可包含在adc中的药物的非限制性实例是有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、用于基因治疗的载体、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢物、含硼剂、化学保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素剂、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂(例如，tec-家族激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂)和放射增敏剂。
[0887]
术语“药物抗体偶联比”或“dar”是指adc的与抗体附接的药物(例如，依喜替康)的数量。adc的dar可以在1到10的范围内，但是取决于抗体上的连接位点的数量，更高的负载(例如20)也是可能的。提及负载到单个抗体上的药物的数量时，或可替代地，提及一组adc的平均或均值dar时，可以使用术语dar。在一些实施方式中，其值选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。当考虑小分子药物的平均结合个数时，即抗体的药物平均结合数，或称为平均药物抗体偶联比，其值选自约0至约10，或约2至约8。在一些实施方式中，药物抗体偶联比为约3至约6。在另一些实施方式中，药物抗体偶联比为约6至约8，或约7至约8。dar值在本文可用p表示。
[0888]
adc的dar值可利用紫外可见吸收光谱法(uv-vis)、高效液相色谱-疏水色谱(hplc-hic)、高效液相色谱-反相色谱(rp-hplc)、液相色谱质谱联用(lc-ms)等测定。这些技术在ouyang,j.methods mol biol,2013,1045:p.275-83中有记载。
[0889]
本文中的其它化学术语根据本领域的常规用法使用，如the mcgraw-hill dictionary of chemical terms(《麦格劳-希尔化学术语词典》)(parker,s.编，格劳-希尔公司(mcgraw-hill)，旧金山(1985))。
[0890]
本文中引用的所有出版物，专利，和专利申请全部内容通过参考并入本文用于所有目的。
[0891]
抗体部分
[0892]
本发明所述的抗体可以是任何一种适用于制备抗体药物偶联物的抗体，其可以具有完整的抗体结构，也可包括抗体片段(多克隆抗体和单克隆抗体)，如fab、fab’、f(ab)
’2和fv等。
[0893]
抗体能够特异性地结合至抗原，例如肿瘤特异性抗原等。肿瘤抗原可以用于肿瘤细胞的鉴别，也可以成为肿瘤治疗的潜在指示指标，或成为肿瘤治疗的靶点。故特异性抗体的选择主要依据疾病的类型，以及作为靶点的细胞和组织进行。
[0894]
本领域熟知的肿瘤抗原的实例包括但不限于egfr、her2、cd20、cd30、cd33、cd47、cd52、cd133、cea、vegf、trop2、b7h3、fralpha(frα)、nectin-4、b7h4、cldn18、bmpr1b、e16、steap1、0772p、mpf、napi3b、sema5b、pscahlg、etbr、msg783、steap2、trpm4、cripto、cd21、
cd22、fcrh2、nca、mdp、il20rα、短蛋白聚糖(brevican)、ephb2r、aslg659、psca、geda、baff-r、cd79a、cd79b、cxcr5、hla-dob、p2x5、cd72、ly64、fcrh1、irta2、tenb2、pmel17、tmeff1、gdnf-ra1、ly6e、tmem46、ly6g6d、lgr5、ret、ly6k、gpr19、gpr54、asphd1、酪氨酸酶、tmem118、epcam、ror1、gpr172a等。
[0895]
在一个或多个实施方案中，抗体可以是人源化单克隆抗体。
[0896]
在一些实施方案中，抗体是抗egfr抗体，包括但不限于：西妥昔单抗，其是一种抗egfr的人鼠嵌合单克隆抗体；帕尼单抗，其是一种全人源化单克隆抗体；尼妥珠单抗，其是一种抗egfr的人源化单克隆抗体。egfr过量表达于许多肿瘤组织，如转移性结直肠癌和头颈部癌症。
[0897]
一个或多个实施方案中，抗体为抗egfr抗体，重链和轻链序列分别为seq id no:1和seq id no:2。
[0898]
各序列编号对应的氨基酸序列如表1所示。
[0899]
表1
[0900][0901]
在一个或多个实施方案中，抗体是抗her2抗体，其能特异性地作用于人类表皮生长因子受体2，如曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗，margetuximab，zw25等。抗her2抗体可以是修饰的，如一种或多种氨基酸序列改变、增加或减少，以实现相应的目的，如增强抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用。
[0902]
一个或多个实施方案中，抗her2抗体为曲妥珠单抗(trastuzumab)，重链和轻链序列分别为seq id no:3和seq id no:4。
[0903]
各序列编号对应的氨基酸序列如表2所示。
[0904]
表2
[0905][0906]
在一个或多个实施方案中，抗体为抗trop2抗体，能特异性的作用于trop2蛋白，其中trop2蛋白为滋养层细胞表面糖蛋白抗原2。在一个或多个实施方案中，抗trop2抗体是全人单克隆抗体，在一个或多个实施方案中，抗trop2的抗体是人源化的单克隆抗体抗。
[0907]
在一个或多个实施方式中，所述抗trop2抗体为如下专利文件公开的抗体：wo2021147993a1(如pd3)、cn101264325b(如rs7、hrs7)、cn105849126b(如htina1－h1l1、htina1－h2l1、htina1－h2l2、htina1－h3l3)、cn110903395a(如m1、m2、m3)、cn113896796a(如4d3、7f11)、us20130089872a(如k5-70、k5-107、k5-116-2-1、t6-16、t5-86)、us5840854a(如br110)、us20130122020a(如3e9、6g11、7e6、15e2、18b1)、us20120237518a(如77220、km4097、km4590)。
[0908]
在一个或多个实施方式中，所述抗trop2抗体是可购买的，其中包括ls-c126418、ls-c178765、ls-c126416、ls-c126417(lifespan biosciences，inc.，seattle，wa)；10428-mm01、10428-mm02、10428-r001、10428-r030(sino biological inc.，beijing，china)；mr54(ebioscience，san diego，ca)；sc-376181、sc-376746，santa cruz biotechnology(santacruz，ca)；mm0588-49d6(novus biologicals，littleton，co)；ab79976和ab89928(cambridge，ma)。
[0909]
在一个或多个实施方式中，所述抗trop2抗体为lipinski等人(1981，proc natl.acad sci usa，78：5147-50)公开的抗trop-2抗体162-25.3和162-46.2或ikeda等人(2015，biochem biophys res comm 458：877-82)公开的pr1e11抗trop-2抗体，其识别trop-2上的独特表位。
[0910]
在一个或多个实施方案中，抗体为hrs9抗体，抗体的重链和轻链序列分别为seq id no:5和seq id no:6。
[0911]
各序列编号对应的氨基酸序列如表3所示。
[0912]
表3
[0913][0914]
在一个或多个实施方式中，所述抗体为抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元具有以下一种或多种特性：a)与cldn18.2特异性结合；b)高亲和力；c)强的adcc活性；d)强的cdc活性。
[0915]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
[0916]
在一个或多个实施方式中，抗cldn18.2抗体的抗原结合片段或抗原结合单元是fab、fab'、f(ab')2、fv、二硫键连接的fv、scfv、单结构域抗体或双抗体。在一个或多个实施方式中，抗cldn18.2抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
[0917]
在一个或多个实施方式中，，抗cldn18.2抗体可以为单克隆抗体。
[0918]
在一个或多个实施方式中，抗体包含重链恒定区，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区。在一个或多个实施方式中，抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含选自人igg恒定结构域、人iga恒定结构域、人ige恒定结构域、人igm恒定结构域和人igd恒定结构域的免疫球蛋白重链恒定结构域。在一个或多个实施方式中，抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含igg1重链恒定区、igg2重链恒定区、igg3重链恒定区或igg4重链恒定区。在一个或多个实施方式中，重链恒定区为igg1重链恒定区或igg4重链恒定区。在一个或多个实施方式中，抗体或其抗原结合单元包含轻链恒定区，例如κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。在一个或多个实施方式中，抗体或其抗原结合单元包含κ轻链恒定区。
[0919]
本发明所述抗cldn18.2抗体包括人源化抗体或其抗原结合单元。这些抗体或其抗原结合单元适用于给人施用，而不会造成人对所施用的免疫球蛋白产生有害的免疫应答。在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元选自wo2020043044、us2021403552、wo2021238831、wo2021160154、wo2021111003所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元。在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元选自zolbetuximab、claudiximab、tst001、ab011、m108、或nbl-015或其抗原结合单元。
[0920]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含(a)-(f)
中的一个或多个，其中：
[0921]
(a)vh cdr1，其包含如seq id no:7所示的氨基酸序列或由其组成；
[0922]
(b)vh cdr2，其包含如seq id no:8所示的氨基酸序列或由其组成；
[0923]
(c)vh cdr3，其包含如seq id no:9所示的氨基酸序列或由其组成；
[0924]
(d)vl cdr1，其包含如seq id no:10所示的氨基酸序列或由其组成；
[0925]
(e)vl cdr2，其包含如seq id no:11所示的氨基酸序列或由其组成；
[0926]
(f)vl cdr3，其包含如seq id no:12所示的氨基酸序列或由其组成。
[0927]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含如下cdr或由其组成：
[0928]
(a)vh cdr1，其包含如seq id no:7所示的氨基酸序列；
[0929]
(b)vh cdr2，其包含如seq id no:8所示的氨基酸序列；
[0930]
(c)vh cdr3，其包含如seq id no:9所示的氨基酸序列；
[0931]
(d)vl cdr1，其包含如seq id no:10所示的氨基酸序列；
[0932]
(e)vl cdr2，其包含如seq id no:11所示的氨基酸序列；和
[0933]
(f)vl cdr3，其包含如seq id no:12所示的氨基酸序列。
[0934]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含如seq id no:7所示的vh cdr1、如seq id no:8所示的vh cdr2、如seq id no:9所示的vh cdr3、如seq id no:10所示的vl cdr1、如seq id no:11所示的vl cdr2和如seq id no:12所示的vlcdr3，或由其组成。
[0935]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元为人源化抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元。在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元的重链可变区包含如seq id no:13所示序列，或与seq id no:13所示序列相比具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:13所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0936]
所述抗cldn18.2抗体或抗原结合单元的轻链可变区包含如seq id no:14所示序列，或与seq id no:14所示序列相比具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:14所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0937]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含重链恒定区，所述重链恒定区包含如seq id no:15或16所示的氨基酸序列。
[0938]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含如seq id no:15所示的氨基酸序列；所述轻链恒定区包含如seq id no:17所示的氨基酸序列。
[0939]
在一个或多个实施方式中，所述抗cldn18.2抗体或其抗原结合单元包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含如seq id no:16所示的氨基酸序列；所述轻链恒定区包含如seq id no:17所示的氨基酸序列。
[0940]
在一个或多个实施方式中，所述人源化抗cldn18.2抗体为h239h-2b-k-6a-1抗体，其重链可变区氨基酸序列如seq id no:13所示，重链恒定区氨基酸序列如seq id no:15所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:14所示，轻链恒定区氨基酸序列如seq id no:17所示。
[0941]
在一个或多个实施方式中，所述人源化抗cldn18.2抗体为h239h-2b-k-6a-2抗体，其重链可变区氨基酸序列如seq id no:13所示，重链恒定区氨基酸序列如seq id no:16所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:14所示，轻链恒定区氨基酸序列如seq id no:17所示。
[0942]
在一个或多个实施方式中，所述抗体包含与任一上述抗体相比具有至少80％同一性的序列，或与任一上述抗体相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0943]
在一个或多个实施方式中，所述h239h-2b-k-6a-1抗体的轻链氨基酸序列如seq id no:20所示，重链氨基酸序列如seq id no:18所示。
[0944]
在一个或多个实施方式中，所述h239h-2b-k-6a-2抗体的轻链氨基酸序列如seq id no:20所示，重链氨基酸序列如seq id no:19所示。
[0945]
在一个或多个实施方式中，所述抗体为抗b7h3抗体或其抗原结合单元。
[0946]
在一个或多个实施方案中，所述抗b7h3抗体的重链氨基酸序列如seq id no:21所示，轻链氨基酸序列如seq id no:22所示。
[0947]
在一个或多个实施方式中，所述抗体为抗frα抗体或其抗原结合单元。
[0948]
在一个或多个实施方案中，所述抗frα抗体的重链氨基酸序列如seq id no:23所示，轻链氨基酸序列如seq id no:24所示。
[0949]
抗体可以通过使用常规重组dna技术制备。使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的载体及细胞系等。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如recombinant dna technology for production of protein therapeutics in cultured mammalian cells，d.l.hacker,f.m.wurm,in reference module in life sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
[0950]
在一个或多个实施方式中，可以按常规方法根据本文所述抗体氨基酸序列设计合成编码抗体的dna，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体。在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polya尾。其他元件包括增强子，kozak序列及插入序列两侧rna剪接的供体和受体位点。可以通过sv40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如rsv、htlv1、hivi及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pires1neo，pretro-off，pretro-on，plxsn，或者plncx，pcdna3.1( /-)，pcdna/zeo( /-)，pcdna3.1/hygro( /-)，psvl，pmsg，prsvcat，psv2dhfr，pbc12mi和pcs2等。常使用的哺乳动物宿主细胞包括hek293细胞、cos1细胞、cos7细胞、cv1细胞、鼠l细胞和cho细胞等。
[0951]
在一个或多个实施方式中，插入基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、新霉素抗性、潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。抗体将通过一个或多个纯化步骤纯化。纯化可以采用常规方法进行，例如先离心细胞悬液并收集上清液，再次离心进一步去除杂质。protein a亲和柱和离子交换柱等方法可以用于纯化抗体蛋白。
[0952]
本发明的一个或多个实施方式中，在抗体药物偶联物中一个抗体与小分子药物的结合个数，即抗体的药物结合数，称为药物抗体偶联比(dar)。在一些实施方式中，其值选自
1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。当考虑小分子药物的平均结合个数时，即抗体的药物平均结合数，或称为平均药物抗体偶联比，其值选自约0至10，或2至8。在一些实施方案中，药物抗体偶联比为3-6，在另一些实施例中，药物抗体偶联比为约6至约8，或约7至约8。
[0953]
合成方法
[0954]
本发明还提供了药物偶联物，如抗体药物偶联物，及中间体的制备方法。本发明的药物偶联物，如抗体药物偶联物，及中间体可以通过已知制剂和方法制备。在一些实施方式中，制备方法如下所述。
[0955]
的制备方法
[0956][0957]
第一步：通式1-1化合物和通式1-1’化合物在碱性条件下反应得到通式1-2化合物；
[0958]
第二步：通式1-2化合物和通式(aa)
i-(ff1)f在缩合剂存在下、在碱性条件下反应得到通式1-3化合物；
[0959]
第三步：去除通式1-3化合物氨基保护基w1得到通式1-4化合物；
[0960]
第四步：通式1-4化合物和通式1-5化合物在碱性条件下反应得到通式1-6化合物；
[0961]
第五步：通式1-6化合物和二(对硝基苯)碳酸酯在碱性条件下反应得到通式1-7化合物。
[0962][0963]
第一步：通式1化合物和通式1’化合物在碱性条件下反应得到通式2化合物；
[0964]
第二步：通式2化合物和通式(aa)
i-(ff1)f在缩合剂存在下、在碱性条件下反应得到通式3化合物；
[0965]
第三步：去除通式3化合物氨基保护基w1得到通式4化合物；
[0966]
第四步：通式4化合物和通式5化合物在碱性条件下反应得到通式6化合物；
[0967]
第五步：通式6化合物和二(对硝基苯)碳酸酯在碱性条件下反应得到通式7化合物。
[0968]
其中
[0969]
w1为氨基保护基，例如为9-芴甲氧羰基；w2为羧酸活性酯，例如为琥珀酰亚胺酯。
[0970]
其中，n、aa、r、i、f如本文如上式ii中所述，ff1为为ff2为
其中*与aa连接。
[0971]
上述碱性条件可以用试剂来提供，该试剂包括有机碱和无机碱类，所述有机碱类包括但不限于三乙胺、二乙胺、n-甲基吗啉、吡啶、六氢吡啶、n,n-二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾，所述无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂。
[0972]
上述缩合剂可以选自n,n,n',n'-四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐、1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n,n'-二环己基碳化二亚胺、n,n'-二异丙基碳二酰亚胺、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。
[0973]
的制备方法
[0974][0975]
通式1-7化合物和d在缩合剂存在下、在碱性条件下反应得到通式1-8化合物。
[0976][0977]
通式7化合物和d在缩合剂存在下、在碱性条件下反应得到通式8化合物。
[0978]
其中，n、aa、r、i、f、ff、d如式iii中所述，ff2为
其中*与aa连接。
[0979]
上述碱性条件可以用试剂来提供，该试剂包括有机碱和无机碱类，所述有机碱类包括但不限于三乙胺、二乙胺、n-甲基吗啉、吡啶、六氢吡啶、n,n-二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾，所述无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂。
[0980]
上述缩合剂可以选自n,n,n',n'-四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐、1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n,n'-二环己基碳化二亚胺、n,n'-二异丙基碳二酰亚胺、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。
[0981]
的制备方法
[0982][0983]
通式1-8化合物和abu在弱酸性条件下偶联得到通式1-9化合物。
[0984][0985]
通式8化合物和abu在弱酸性条件下偶联得到通式9化合物。
[0986]
其中，n、aa、r、i、f、ff、d、abu如式i中所述。
[0987]
上述弱酸性条件可以用试剂来提供，该试剂包括有机酸和无机酸类，所述有机酸
类包括但不限于乙酸、苯甲酸、酒石酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、抗坏血酸、柠檬酸、枸椽酸、水杨酸、咖啡酸、山梨酸、奎宁酸、齐墩果酸、丁二酸、绿原酸、甲酸、丙酸，所述无机酸类包括但不限于碳酸、亚硝酸、乙酸、次氯酸、氢氟酸，亚硫酸、氢硫酸、硅酸、偏硅酸、磷酸、偏磷酸、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠。
[0988]
药物偶联物可以采用常规方法进行纯化，例如用制备型高效液相色谱(prep-hplc)等方法。
[0989]
实施例
[0990]
实施例1.抗体制备
[0991]
以下抗体按常规方法进行制备，在进行载体构建后，瞬时转染真核细胞如hek293细胞(life technologies cat.no.11625019)，或者稳转cho细胞，挑选稳定细胞株，纯化表达。
[0992]
trastuzumab抗体的制备和纯化
[0993]
参照wood et al.,j immunol.145:3011(1990)等的方法，特异性结合her2胞外区的单克隆抗体抗her2抗体在cho细胞产生。含抗体基因的表达载体opticho
tm antibody express system(invitrogen)分别用常规的分子生物学方法构建，cho细胞作为宿主细胞。
[0994]
hrs9抗体的制备和纯化
[0995]
参照wood et al.,j immunol.145:3011(1990)等的方法，抗trop2特异性的单克隆抗体在cho细胞产生。含抗体基因的表达载体分别用常规的分子生物学方法构建，其中重组人源化抗trop2单克隆抗体hrs9抗体重链和轻链的氨基酸序列分别见seq id no:5和seq id no:6。
[0996]
抗clnd18.2抗体的制备和纯化
[0997]
含抗clnd18.2抗体基因的表达载体分别用常规的分子生物学方法构建，转染hek293f细胞，培养并纯化得到抗体。抗cldn18.2抗体的相关序列见表4和5；其中h239h-2b-k-6a-1抗体的轻链氨基酸序列如seq id no:20所示，重链氨基酸序列如seq id no:18所示；h239h-2b-k-6a-2抗体的轻链氨基酸序列如seq id no:20所示，重链氨基酸序列如seq id no:19所示。
[0998]
表4抗cldn18.2抗体的氨基酸序列
[0999]
[1000][1001]
表5抗cldn18.2抗体的组成
[1002]
抗体名称vh序列号ch序列号vl序列号cl序列号h239h-2b-k-6a-1seq id no:13seq id no:15seq id no:14seq id no:17h239h-2b-k-6a-2seq id no:13seq id no:16seq id no:14seq id no:17
[1003]
抗b7h3抗体的制备和纯化
[1004]
含抗b7h3抗体a基因的表达载体分别用常规的分子生物学方法构建，转染hek293f细胞，培养并纯化得到抗体。抗b7h3抗体a的相关序列见表6，其中抗体的重链氨基酸序列如seq id no:21所示，轻链氨基酸序列如seq id no:22所示。
[1005]
表6抗b7h3抗体a的氨基酸序列
[1006][1007]
抗frα抗体的制备和纯化
[1008]
含抗frα抗体a基因的表达载体分别用常规的分子生物学方法构建，转染hek293f细胞，培养并纯化得到抗体。抗frα抗体a的相关序列见表7，其中抗体的重链氨基酸序列如seq id no:23所示，轻链氨基酸序列如seq id no:24所示。
[1009]
表7抗frα抗体a的氨基酸序列
[1010][1011]
实施例2.化合物(1s,9s)-1-氨基-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10h,13h苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮盐酸盐(d-1)的合成步骤
[1012]
1.n,n'-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1,7-二基)二乙酰胺的合成
[1013][1014]
氮气氛围中，将叔丁醇钾四氢呋喃溶液(42ml，1m)加入干燥反应瓶中搅拌，降温至
0-5℃。将溶于四氢呋喃(25ml)的n-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺(cas号：143655-49-6，5g，21mmol)，缓慢滴加到反应瓶中，随后滴加亚硝酸叔丁酯(4.32g，2eq)(控温0-5℃)，升温至15-20℃搅拌2小时(h)。反应完全后，降温至0-5℃，滴加醋酸(25ml)、醋酸酐(25ml)(控温不超过10℃)，滴完搅拌20分钟(min)。保持5-10℃，根据n-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺的量加锌粉(8eq)，20-25℃搅拌1h。过滤，乙酸乙酯(50ml)漂洗固体，降温至0-5℃，滴加15％naco3水溶液(50ml)洗三次，乙酸乙酯(25ml)萃取，合并有机相，饱和nacl水溶液洗涤。加入乙酸乙酯(10ml)，40℃搅拌30min，缓慢降至0-5℃搅拌2h。过滤，固体用乙酸乙酯/石油醚(1/2，10ml)洗涤。真空干燥得灰色粉末(2.1g，33.7％)。lc-ms:[m h]
＝297。
[1015]
2.n-(8-氨基-5,6-二氟-1-氧代-1,2,3,4-四氢萘-2-基)乙酰胺的合成
[1016][1017]
将n,n'-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1,7-二基)二乙酰胺(500mg，1.68mmol)加入2m盐酸乙醇溶液(5ml)，50℃搅拌4h，检测反应完全后，加水(7.5ml)，降温至0-5℃，滴加三乙胺(1.03g)搅拌3h。过滤，分别用40％冷乙醇水溶液(3ml)，水(3ml)洗涤。真空干燥得灰色粉末(320mg，74.6％)。lc-ms:[m h]
＝255。
[1018]
3.n-((9s)-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h苯并[de]哌喃并[3'；4':6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺的合成
[1019][1020]
氮气氛围下将n-(8-氨基-5,6-二氟-1-氧代-1,2,3,4-四氢萘-2-基)乙酰胺(1.1g，1eq)、(s)-4-乙基-4-羟基-7,8-二氢-1h-哌喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮(1.15g，1eq)及甲苯(50ml)加入到反应瓶，升温至回流，搅拌1h后加入4-甲基苯磺酸吡啶(100mg)，继续搅拌回流20h。降至室温搅拌1h。过滤，固体分别用丙酮(10ml)，冷乙醇(5ml)洗涤。真空干燥得灰褐色粉末(1.1g，53％)。lc-ms:[m h]
＝482。
[1021]
4.(1s,9s)-1-氨基-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10h,13h苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮盐酸盐的合成
[1022][1023]
将n-((9s)-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺(1.1g，2.28mmol)、6m盐酸水溶液(44ml)加入到反应瓶，氮气氛围下回流搅拌4h。浓缩除去溶剂，hplc纯化得到白色粉末(200mg，18％)。lc-ms:[m h]
＝440。
[1024]
实施例3. 4-((30s,33s)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(cb07)的合成步骤
[1025][1026]
1)(s)-30-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-26-氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27-氮杂-三十一烷-31-酸(cb01)的合成。
[1027][1028]
0-5℃氮气保护下，将8.14g n2-芴甲氧羰基-l-2,4-二氨基丁酸(cb00-2)用40ml二甲基甲酰胺(dmf)溶解，加入10g 4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂二十六烷酸-n-琥珀酰亚胺酯(cb00-3)和10ml dmf，保持0-5℃滴加6.5ml dipea，加完1h后室温下搅拌反应4h，反应完成后减压除去dmf，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比20:1作为洗脱溶剂)得到淡黄色油状液体14.2g cb01。
[1029]
2)[(s)-1-[[(s)-1-[[4-(羟甲基)苯基]氨基]-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基]氨基]-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸(9h-芴-9-基)甲酯(cb02)的合成。
[1030][1031]
室温氮气保护下，11g(s)-2-((s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酸(cb00-4)和5.5g对氨基苯甲醇(cb00-5)用400ml二氯甲烷和200ml甲醇溶解，机械搅拌下，分批加入17g2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(eedq)，避光下反应15h。反应完成后减压除去溶剂得到糊状固体，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比20:1作为洗脱溶剂)得到灰白色固体11.9g。
[1032]
3)(s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-n-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(cb03)的合成。
[1033][1034]
室温氮气保护下，11.9g[(s)-1-[[(s)-1-[[4-(羟甲基)苯基]氨基]-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基]氨基]-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸(9h-芴-9-基)甲酯(cb02)中加入300ml乙腈，搅拌下滴加18ml哌啶，滴加完毕后室温下反应2h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂和哌啶，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比20:1作为洗脱溶剂)得到白色固体7.5g cb03。
[1035]
4)(9h-芴-9-基)甲基((30s,33s)-41-氨基-36-((4-(羟甲基)苯基)氨基甲酰基)-33-异丙基-26,31,34,41-四氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,32,35,40-四氮杂-30-基)氨基甲酸酯(cb04)的合成。
[1036][1037]
0℃氮气氛围下，将14.2g(s)-30-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-26-氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27-氮杂-三十一烷-31-酸(cb01)溶解于100ml dmf中，分批加入11g n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(hatu)，搅拌反应30min后，加入7.5g的(s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-n-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(cb03)，保持0℃下反应2.5h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比10:1作为洗脱溶剂)得到固体9.66gcb04。
[1038]
5)n-((3s)-3-氨基-4-(((2s)-1-((1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧代-5-脲基
戊烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基)胺基)-4-氧基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(cb05)的合成。
[1039][1040]
室温氮气保护下，9.66g的(9h-芴-9-基)甲基((30s,33s)-41-氨基-36-((4-(羟甲基)苯基)氨基甲酰基)-33-异丙基-26,31,34,41-四氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,32,35,40-四氮杂-30-基)氨基甲酸酯(cb04)溶解于50ml dmf，加入12ml二乙胺，搅拌反应1.5h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比7.5:1作为洗脱溶剂)得到淡黄色固体7.7gcb05。
[1041]
6)n-((3s)-3-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-4-(((2s)-1-((1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧-5-脲基戊烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-丁酮-2-基)胺基)-4-氧代)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(cb06)的合成。
[1042][1043]
7.7g n-((3s)-3-氨基-4-(((2s)-1-((1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基)胺基)-4-氧基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(cb05)溶于40ml dmf中，0-5℃氮气氛围下，分批加入马来酰亚胺基乙酸琥珀酰亚胺酯(cb00-1),保持0-5℃下反应4h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比10:1作为洗脱溶剂)得到淡黄色固体9.5gcb06。
[1044]
7)4-((30s,33s)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(cb07)的合成。
[1045][1046]
9.5gn-((3s)-3-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-4-(((2s)-1-((1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧-5-脲基戊烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-丁酮-2-基)胺基)-4-氧代)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(cb06)溶于50ml dmf中，0℃氮气氛围下，加入14.0g二(对硝基苯)碳酸酯((pnp)2co)，溶解后再加入8.2ml n,n-二异丙基乙胺(dipea)，保持0℃反应4h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比8:1作为洗脱溶剂)得到白色固体2.6gcb07。
[1047]
实施例4. 4-((18s,21s)-18-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺基)-21-异丙基-14,19,22-三氧-24-(3-脲丙基)-2,5,8,11-四氧-15,20,23-三氮杂二十五烷-25-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(cb14)的合成
[1048][1049]
cb14的制备参考实施例3中cb07的合成，将4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂二十六烷酸-n-琥珀酰亚胺酯替换为4,7,10,13-四氧杂十四烷酸-n-琥珀酰亚胺酯。最终得到白色固体cb14。
[1050]
实施例5.中间体(cb07-exatecan)的合成
[1051]
4-(30s,33s)-30-(2-(2,5-二氧六环-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-三七庚基-37-乌头烷基)-(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃[3’,4’:6,7]吲哚啉[1,2-b]喹啉-1-氨基甲酸酯的合成。
[1052][1053]
将4-((30s,33s)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(cb07)(2.6g，2.21mmol)与n,n-二甲基甲酰
胺(23ml)加入反应瓶r1，氮气保护下搅拌降温至0-5℃。同时取(1s,9s-1-氨基-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10h，13h-苯并[3’,4’:6,7]吲哚啉[1,2-b]喹啉-10,13-二酮甲磺酸盐(依喜替康甲磺酸盐，0.98g，1.84mmol，advanced chemblocks公司)与n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入到另一个反应瓶r2，0-5℃滴加三乙胺(230mg，2.27mmol)，搅拌至全溶后。将反应瓶r2中溶液滴加到反应瓶r1中，然后用n,n-二甲基甲酰胺(2ml)洗涤反应瓶r2后，洗涤液加入到反应瓶r1中。再称取1-羟基苯并三唑(497mg，3.68mmol)、吡啶(1.45g，18.4mmol)加入到反应瓶r1。0-5℃搅拌10min，升至室温搅拌5.5h反应完全后，35℃减压浓缩除去溶剂。用制备型高效液相色谱(prep-hplc)纯化，冻干，得到白色粉末(1.6g，59％)。lc-ms:[1/2m h]
＝737。
[1054]
实施例6.中间体(cb07-d-1)的合成
[1055]
4-(30s,33s)-30-(2-(2,5-二氧六环-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧代-36-(3-脲基丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-三七庚基-37-乌头烷基)-(1s,9s)-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃[3’,4’:6,7]吲哚啉[1,2-b]喹啉-1-氨基甲酸酯的合成
[1056][1057]
将4-((30s,33s)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(cb07)(220mg，0.189mmol)与n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入反应瓶r1，氮气保护下搅拌降温至0-5℃。同时取(1s,9s)-1-氨基-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10h,13h苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮盐酸盐(d-1)(90mg，0.189mmol)与n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入到另一个反应瓶r2，0-5℃滴加三乙胺3滴，搅拌至全溶后。将反应瓶r2中溶液滴加到反应瓶r1中，再称取1-羟基苯并三唑(60mg，0.44mmol)、吡啶(0.5ml)加入到反应瓶r1。0-5℃搅拌10min，升至室温搅拌3h反应完全后，减压浓缩除去溶剂。用制备型高效液相色谱(prep-hplc)纯化，冻干，得到白色粉末(55mg，20％)。lc-ms:[1/2m h]
＝739。
[1058]
实施例7.中间体(cb14-exatecan)的合成
[1059]
4-(18s,21s)-18-(2-(2,5-二氧六环-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-21-异丙基-14,19,22-三氧代-24-(3-脲基丙基)-2,5,8,11-四氧-15,20,23-三氮杂二十五烷-25-胺基)-(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃[3’,4’:6,7]吲哚啉[1,2-b]喹啉-1-氨基甲酸酯的合成
[1060][1061]
类似地，将4-((18s,21s)-18-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-21-异丙基-14,19,22-三氧-24-(3-脲丙基)-2,5,8,11-四氧-15,20,23-三氮杂二十五烷-25-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(190mg，0.19mmol)与n,n-二甲基甲酰胺(23ml)加入反应瓶r1，氮气保护下搅拌降温至0-5℃。同时取(1s,9s)-1-氨基-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10h,13h-苯并[3’,4’:6,7]吲哚啉[1,2-b]喹啉-10,13-二酮甲磺酸盐(依喜替康甲磺酸盐；101mg，0.19mmol；advanced chemblocks公司)与n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入到另一个反应瓶r2，0-5℃滴加三乙胺(3滴)，搅拌至全溶后。将反应瓶r2中溶液滴加到反应瓶r1中，然后用n,n-二甲基甲酰胺(1ml)洗涤反应瓶r2后，洗涤液加入到反应瓶r1中。再称取1-羟基苯并三唑(60mg，0.44mmol)、吡啶(0.5ml)加入到反应瓶r1。0-5℃搅拌10min，升至室温搅拌5.5h反应完全后，35℃减压浓缩除去溶剂。用制备型高效液相色谱(prep-hplc)纯化，冻干，得到白色粉末。
[1062]
实施例8.adc1的合成
[1063][1064]
根据抗体的物质的量，向trastuzumab加入4.5摩尔当量tcep(tris(2-carboxyethyl)phosphine)，然后用1m tris碱将体系ph调至8。25℃孵育1.5小时还原。用10mm琥珀酸超滤换液去除tcep。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与dtnb(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
[1065]
偶联反应时，根据抗体的物质的量，加入12摩尔当量的cb07-exatecan，25℃搅拌1小时后，加入0.1m n-乙酰半胱氨酸至终浓度为2mm，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mm琥珀酸经sephadex g-25树脂洗脱交换。
[1066]
最终获得adc1的浓度为7.5mg/ml，通过反相色谱测得的dar即p为8。
[1067]
实施例9.adc2的合成
[1068][1069]
根据抗体的物质的量，向trastuzumab中加入4.5摩尔当量tcep，然后用1m tris碱将体系ph调至8。25℃孵育1.5小时还原。用10mm琥珀酸超滤换液去除tcep。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与dtnb(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
[1070]
偶联反应时，根据抗体的物质的量，加入12摩尔当量的cb07-d-1，25℃搅拌2小时后，加入0.1m n-乙酰半胱氨酸至终浓度为2mm，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mm琥珀酸经sephadex g-25树脂洗脱交换。
[1071]
adc2浓度为3.61mg/ml，dar即p通过反相色谱测定为7.4。
[1072]
实施例10.adc3的合成(对照药物)
[1073][1074]
根据抗体的物质的量，向trastuzumab中加入4.5摩尔当量tcep，然后用1m tris碱将体系ph调至8。25℃孵育1.5小时还原。用10mm琥珀酸超滤换液去除tcep。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与dtnb(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
[1075]
偶联反应时，根据抗体的物质的量，加入12摩尔当量的deuxtecan,(mce,cat.#hy-13631e)，25℃搅拌2小时后，加入0.1m n-乙酰半胱氨酸至终浓度为2mm，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mm琥珀酸经sephadex g-25树脂洗脱交换。
[1076]
adc3浓度为4.19g/l，dar即p通过rp-hplc测定为7.6。
[1077]
实施例11.adc4的合成
[1078][1079]
根据抗体的物质的量，向hrs9抗体中加入2.7摩尔当量tcep，然后用1m tris碱将体系ph调至7。25℃孵育2小时还原。用10mm琥珀酸超滤换液去除tcep。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与dtnb(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
[1080]
偶联反应时，根据抗体的物质的量，加入6摩尔当量的cb07-exatecan，25℃搅拌2小时后，加入0.1m n-乙酰半胱氨酸至终浓度为2mm，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mm琥珀酸经sephadex g-25树脂洗脱交换。
[1081]
adc4的蛋白浓度为8.46mg/ml，dar即p通过rp-hplc检测为4.2。
[1082]
实施例12.adc5的合成
[1083][1084]
根据抗体的物质的量，向hrs9抗体中加入2.7摩尔当量tcep，然后用1m tris碱将体系ph调至7。25℃孵育2小时还原。用10mm琥珀酸超滤换液去除tcep。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与dtnb(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
[1085]
偶联反应时，根据抗体的物质的量，加入6摩尔当量的cb07-d-1，25℃搅拌2小时后，加入0.1m n-乙酰半胱氨酸至终浓度为2mm，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mm琥珀酸经sephadex g-25树脂洗脱交换。
[1086]
adc5的蛋白浓度为6.5mg/ml，dar即p通过rp-hplc检测为4.8。
[1087]
实施例13.adc6的合成
[1088][1089]
根据抗体的物质的量，向hrs9抗体中加入2.7摩尔当量tcep，然后用1m tris碱将体系ph调至7。25℃孵育2小时还原。用10mm琥珀酸超滤换液去除tcep。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与dtnb(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
[1090]
偶联反应时，根据抗体的物质的量，加入6摩尔当量的mc-ggfg-dxd(deruxtecan,mce,cat.#hy-13631e/cs-0045125)，25℃搅拌2小时后，加入0.1m n-乙酰半胱氨酸至终浓度为2mm，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mm琥珀酸经sephadex g-25树脂洗脱交换。
[1091]
adc6的蛋白浓度为2.83mg/ml，dar即p通过rp-hplc检测为4.6。
[1092]
实施例14.adc7的合成
[1093][1094]
根据抗体的物质的量，向hrs9抗体中加入4.5摩尔当量tcep，然后用1m tris碱将体系ph调至8。25℃孵育2小时还原。用10mm琥珀酸超滤换液去除tcep。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与dtnb(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，aldrich公司)的反应物，然
后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
[1095]
偶联反应时，根据抗体的物质的量，加入12摩尔当量的cl2a-sn38(具体可参考专利us2018161440a1)，25℃搅拌2小时后，加入0.1m n-乙酰半胱氨酸至终浓度为2mm，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mm琥珀酸经sephadex g-25树脂洗脱交换。
[1096]
adc7的蛋白浓度为6.79mg/ml，dar即p通过rp-hplc检测约为8.3。
[1097]
实施例15.adc8的合成
[1098][1099]
取5ml的11.5mg/ml的h239h-2b-k-6a-1抗体，加入100μl的0.1m edta水溶液，根据抗体的物质的量，加入2.7摩尔当量的10mm tcep水溶液，25℃恒温箱反应2h，超滤换液，去除体系中的还原剂tcep。随后，根据抗体的物质的量加入6摩尔当量的10mm mc-ggfg-dxd(deruxtecan,mce,cat.#hy-13631e/cs-0045125)的二甲基乙酰胺(dma)溶液进行偶联，加入有机溶剂dma至其体积占偶联体系的20％，25℃恒温箱反应2h，加入0.1m nac(n-乙酰半胱氨酸)水溶液至其终浓度为1.5mm，反应15分钟后终止反应。
[1100]
纯化后adc8的dar即p通过rp-uplc检测约为3.43。
[1101]
实施例16.adc9的合成
[1102][1103]
取5ml的11.5mg/ml的h239h-2b-k-6a-1抗体，加入100μl的0.1m edta水溶液，根据抗体的物质的量，加入7摩尔当量的10mm tcep水溶液，25℃恒温箱反应2h，超滤换液，去除体系中的还原剂tcep。随后，根据抗体的物质的量加入12摩尔当量的10mm mc-ggfg-dxd(deruxtecan,mce,cat.#hy-13631e/cs-0045125)的二甲基乙酰胺(dma)溶液进行偶联，加入有机溶剂dma至其体积占偶联体系的20％，25℃恒温箱反应2h，加入0.1m nac(n-乙酰半
胱氨酸)水溶液至其终浓度为2mm，反应15分钟后终止反应。
[1104]
纯化后adc9的dar即p通过rp-uplc检测约为7.67。
[1105]
实施例17.adc10的合成
[1106][1107]
取5ml的11.5mg/ml的h239h-2b-k-6a-1抗体，加入100μl的0.1m edta水溶液，根据抗体的物质的量，加入2.7摩尔当量的10mm tcep水溶液，25℃恒温箱反应2h，超滤换液，去除体系中的还原剂tcep。随后，根据抗体的物质的量加入6摩尔当量的10mm cb07-exatecan的二甲基乙酰胺(dma)溶液进行偶联，加入有机溶剂dma至其体积占偶联体系的20％，25℃恒温箱反应2h15min，加入0.1m nac(n-乙酰半胱氨酸)水溶液至其终浓度为1.5mm，反应15分钟后终止反应。
[1108]
纯化后adc10的dar即p通过rp-uplc检测约为4.05。
[1109]
实施例18.adc11的合成
[1110][1111]
取15.2ml的11.5mg/ml的h239h-2b-k-6a-1抗体，加入326μl的0.1m edta水溶液，根据抗体的物质的量，加入7摩尔当量的10mm tcep水溶液，25℃恒温箱反应2h，超滤换液，去除体系中的还原剂tcep。随后，根据抗体的物质的量加入12摩尔当量的10mm cb07-exatecan的二甲基乙酰胺(dma)溶液进行偶联，加入有机溶剂dma至其体积占偶联体系的20％，25℃恒温箱反应2.5h，加入0.1m nac(n-乙酰半胱氨酸)水溶液至其终浓度为2mm，反应15分钟后终止反应。
[1112]
纯化后adc11的dar即p通过rp-uplc检测约为7.49。
[1113]
实施例19.adc12的合成
[1114][1115]
取2.5ml的11.5mg/ml的h239h-2b-k-6a-1抗体，加入50μl的0.1m edta水溶液，根据抗体的物质的量，加入6摩尔当量的15mm tcep水溶液，25℃恒温箱反应2h，超滤换液，去除体系中的还原剂tcep。随后，根据抗体的物质的量加入12摩尔当量的10mm cb07-d-1的二甲基乙酰胺(dma)溶液进行偶联，加入有机溶剂dma至其体积占偶联体系的20％，25℃恒温箱反应2.5h，加入0.1m nac(n-乙酰半胱氨酸)水溶液至其终浓度为2mm，反应15分钟后终止反应。
[1116]
纯化后adc12的dar即p通过rp-uplc检测约为7.65。
[1117]
实施例20.adc13的合成
[1118][1119]
取3ml的7.89mg/ml的h239h-2b-k-6a-2抗体，加入60μl的0.1m edta水溶液，根据抗体的物质的量，加入7摩尔当量的10mm tcep水溶液，25℃恒温箱反应2h，超滤换液，去除体系中的还原剂tcep。随后，根据抗体的物质的量加入15摩尔当量的100mm cb07-exatecan的二甲基乙酰胺(dma)溶液进行偶联，25℃恒温箱反应2h，加入0.1m nac(n-乙酰半胱氨酸)水溶液至其终浓度为2mm，反应15分钟后终止反应。
[1120]
纯化后adc13的dar即p通过rp-uplc检测约为7.19。
[1121]
实施例21.adc14的合成
[1122][1123]
取7.0l 23.9g/l抗b7h3抗体a溶液，用10mm琥珀酸水溶液将抗体v3浓度调整至18g/l得到抗体溶液，加入0.1m edta水溶液至edta终浓度为2mm，调ph至7，根据抗体物质的量，加入5.4摩尔当量0.2m tcep(tris(2-carboxyethyl)phosphine)水溶液(体积30.2ml)，25℃180rpm搅拌反应2h；用10mm琥珀酸水溶液、使用截留分子量为30kd的超滤膜包超滤换液10个体积去除tcep。
[1124]
偶联反应时，根据抗体物质的量，加入15倍摩尔当量的100mm cb07-exatecan的二甲基乙酰胺(dma)溶液，25℃180rpm搅拌反应2小时，加入0.4m n-乙酰半胱氨酸水溶液至其终浓度为2mm，继续搅拌15分钟终止偶联反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mm琥珀酸水溶液经sephadex g-25树脂洗脱交换。
[1125]
最终获得adc14的浓度为18.8mg/ml，通过反相色谱测得的dar即p为8.0。
[1126]
实施例22.adc15的合成(对照药物)
[1127]
取5ml 3.08g/l的抗b7h3抗体a溶液，加入0.1m edta水溶液至edta终浓度为2mm，根据抗体物质的量，加入2.7摩尔当量10mm tcep(tris(2-carboxyethyl)phosphine)水溶液(体积27.7μl)，调ph至7，25℃摇床振荡反应2h；用10mm琥珀酸水溶液、使用截留分子量为30kd的超滤膜包超滤换液10个体积去除tcep。
[1128]
偶联反应时，根据抗体物质的量，加入6倍摩尔当量的mc-ggfg-dxd(medchem express，lot#41557，cas：1599440-13-7，产品名称：deruxtecan)，25℃摇床振荡反应2小时，加入0.1m n-乙酰半胱氨酸水溶液至其终浓度为1.5mm，继续振荡15分钟终止偶联反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mm琥珀酸水溶液经sepha dex g-25树脂洗脱交换。
[1129]
最终获得adc15的浓度为6.3mg/ml，通过反相色谱测得的dar即p为3.7。
[1130]
实施例23.adc16的合成
[1131][1132]
使用偶联缓冲液(10mm琥珀酸水溶液)将抗frα抗体a浓度调整至18g/l，加入0.1m edta水溶液至edta终浓度为2mm，根据抗体物质的量加入5.4摩尔当量0.2m tcep水溶液，调ph至7，25℃180rpm搅拌反应2h，使抗体链间二硫键被还原为游离巯基。使用30kd的超滤膜包超滤换液10个体积，去除体系中的还原剂tcep。
[1133]
根据抗体物质的量，加入15倍摩尔当量的100mm cb07-exatecan的二甲基乙酰胺(dma)溶液，25℃180rpm搅拌反应2h。最后加入0.2m的n-乙酰半胱氨酸水溶液至其终浓度为2mm，继续反应15min终止偶联反应，反应混合物经纯化、超滤后获得浓度为23.56mg/ml的adc16，通过反向色谱测得的dar即p为8。
[1134]
实施例24.adc17的合成
[1135][1136]
使用偶联缓冲液(10mm琥珀酸水溶液)将抗frα抗体a浓度调整至约18g/l，加入0.1m edta水溶液至edta终浓度为2mm，根据抗体物质的量加入2.5摩尔当量10mm tcep水溶液，调ph至7，25℃摇床振荡反应2h，使抗体链间二硫键被还原为游离巯基。超滤换液10个体积，去除体系中的还原剂tcep。
[1137]
根据抗体物质的量，加入6倍摩尔当量的100mm cb07-exatecan的二甲基乙酰胺(dma)溶液，25℃摇床振荡反应1小时。最后加入0.1m的n-乙酰半胱氨酸水溶液至其终浓度
为1.5mm，继续反应15min终止偶联反应，反应混合物经纯化后获得浓度为1.34mg/ml的adc17，通过反向色谱测得的dar即p为4。
[1138]
活性实施例
[1139]
实施例1
[1140]
adc1的体外生物学活性
[1141]
我们使用her2阳性乳腺肿瘤细胞系nci-n87、mda-mb-453、sk-br-3、bt474和her2阴性细胞系mda-mb-468(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)评价了adc1抗体对肿瘤细胞的生长抑制。简言之，细胞生长至对数生长期后，胰蛋白酶消化，使细胞剥离，然后悬浮于100μl完全培养基，4000-8000个细胞接种于96孔板进行培养，37℃贴壁生长3-5h或者过夜，然后加入100μl含有不同浓度的抗adc1的培养基，120小时后，除去培养皿中的培养基，用细胞计数试剂盒-8(cck-8，日本同仁化学)试剂进行相对细胞增殖分析。结果表明，adc1对her2阳性的细胞均有生长抑制作用，对阴性细胞mda-mb-468生长抑制作用ec50＞10000ng/ml。
[1142][1143]
实施例2
[1144]
adc4的体外生物学活性
[1145]
我们使用trop2阳性乳腺肿瘤细胞系mda-mb-453、mda-mb-468和mx-1以及trop2阴性细胞系hgc27(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)评价了adc4抗体对肿瘤细胞的生长抑制。简言之，细胞生长至对数生长期后，胰蛋白酶消化，使细胞剥离，然后悬浮于100μl完全培养基，4000-8000个细胞接种于96孔板进行培养，37℃贴壁生长3-5h或者过夜，然后加入100μl含有不同浓度的抗adc4的培养基，120小时后，除去培养皿中的培养基，用细胞计数试剂盒-8(cck-8，日本同仁化学)试剂进行相对细胞增殖分析。结果表明，adc4对trop2阳性的细胞均有生长抑制作用，对阴性细胞hgc27生长抑制作用ec50＞15000ng/ml。
[1146][1147]
实施例3
[1148]
1、cho-cldn18.2稳定细胞系构建
[1149]
人cldn18.2全长氨基酸序列，(来自ncbi，nm_001002026.3)：
[1150]
mavtacqglgfvvsligiagiiaatcmdqwstqdlynnpvtavfnyqglwrscvressgftecrgyft
llglpamlqavralmivgivlgaigllvsifalkcirigsmedsakanmtltsgimfivsglcaiagvsvfanmlvtnfwmstanmytgmggmvqtvqtrytfgaalfvgwvaggltliggvmmciacrglapeetnykavsyhasghsvaykpggfkastgfgsntknkkiydggartedevqsypskhdyv(seq id no:25)。
[1151]
对应的核酸序列如下：
[1152]
atggccgtgactgcctgtcagggcttggggttcgtggtttcactgattgggattgcgggcatcattgctgccacctgcatggaccagtggagcacccaagacttgtacaacaaccccgtaacagctgttttcaactaccaggggctgtggcgctcctgtgtccgagagagctctggcttcaccgagtgccggggctacttcaccctgctggggctgccagccatgctgcaggcagtgcgagccctgatgatcgtaggcatcgtcctgggtgccattggcctcctggtatccatctttgccctgaaatgcatccgcattggcagcatggaggactctgccaaagccaacatgacactgacctccgggatcatgttcattgtctcaggtctttgtgcaattgctggagtgtctgtgtttgccaacatgctggtgactaacttctggatgtccacagctaacatgtacaccggcatgggtgggatggtgcagactgttcagaccaggtacacatttggtgcggctctgttcgtgggctgggtcgctggaggcctcacactaattgggggtgtgatgatgtgcatcgcctgccggggcctggcaccagaagaaaccaactacaaagccgtttcttatcatgcctcaggccacagtgttgcctacaagcctggaggcttcaaggccagcactggctttgggtccaacaccaaaaacaagaagatatacgatggaggtgcccgcacagaggacgaggtacaatcttatccttccaagcacgactatgtg(seq id no:26)。
[1153]
合成上述人cldn18.2对应的核酸序列，并在序列两端添加酶切位点hindiii和ecori的序列，然后构建到pcdna3.1表达载体(invitrogen，货号为v79020)上，接着通过电转的方法转染到cho细胞(life technologies，货号：a13696-01)中，电转条件为：电压300v，时间17毫秒，4mm电转杯，48h后加入50μm的msx(蛋氨酸亚氨基代砜)筛选压，2周后，筛选阳性细胞。利用facs检测，筛选高表达的细胞株。收集细胞，用pbs(磷酸缓冲液，1l pbs含nacl 8.0g，na2hpo
4 0.9g，kh2po
4 0.156g，kcl 0.125g，ph 7.2-7.4)洗一遍后，加入3μg/ml抗cldn18.2抗体(imab362，其序列与专利us20090169547中杂交瘤细胞175d10表达的抗体的序列是相同的)，4℃孵育1h后，用pbs洗2遍，加入100μl 1:500稀释的羊抗人igg-fc pe荧光二抗(货号：12-4998-82，ebioscience)，4℃孵育1h后，用pbs洗2遍，c6流式细胞仪(bd，型号：c6 flow cytometer)分析。将最终得到的细胞命名为cho-cldn18.2细胞，facs检测结果如图1所示。
[1154]
2、adc8、adc10、adc11及adc12的增殖抑制实验
[1155]
我们使用cho-cldn18.2细胞评价抗cldn18.2 adc对细胞的生长抑制。收集对数生长期的cho-cldn18.2细胞，800rpm，离心5min，去上清，用cd-cho-agt(货号：12490；life technologies)培养基洗一遍，800rpm，离心5min，去上清。用0.5％fbs(货号：fsp500；excell bio)cd-cho-agt培养基重悬细胞，调整细胞密度为5
×
104个/ml，100μl/孔铺于96孔细胞培养板中(货号：3599；costar)。加入用0.5％fbs cd-cho-agt梯度稀释好的adc，100μl/孔，adc8、adc10、adc11、adc12终浓度为：500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.9、1.95nm。置于37℃，5％co2培养箱中，培养5天后，每孔加入20μl cck-8(货号：ck04，dojindo)，37℃放置1h，于酶标仪(型号：spectramax m3，molecular devices)读取od450nm吸光值，计算细胞抑制率。抑制率％＝(1-样品孔吸光值/对照孔吸光值)
×
100。
[1156]
由图2显示，adc8、adc10、adc11及adc12对cho-cldn18.2细胞有明显的增殖抑制作用。
[1157]
实施例4
[1158]
adc1和adc2旁观者效应
[1159]
将her2阳性细胞sk-br-3和her2阴性细胞mda-mb-468按照密度(7.5万/孔：20万/孔)的比例接种至6孔板中，培养3-5h后，加入终浓度为0.1nm、0.5nm和5nm的adc1和对照药物adc3，加入0.3nm、2nm和20nm的adc2，37℃继续培养120h后，用胰酶消化细胞，终止后pbs洗一遍，对细胞进行计数，随后4℃使用标记fitc的抗her2抗体(与trastuzumab结合表位不同)标记细胞30min-1h，流式细胞仪检测不同细胞的比例，计算出不同处理后培养皿中的各个细胞比例，由图3可知。adc1、adc2和adc3均可见旁观者效应，其中adc1旁观者效应强于adc2和对照药物adc3。
[1160]
实施例5
[1161]
adc4和adc5旁观者效应
[1162]
将trop2阳性细胞mda-mb-468和trop2阴性细胞hgc27按照3:1的密度(15万 5万)的比例接种至6孔板中，培养3-5h后，加入终浓度为分别为0.1nm、5nm和50nm的adc4和adc5和对照药物adc6，37℃继续培养120h后，用胰酶消化细胞，终止后pbs洗一遍，对细胞进行计数，随后4℃使用标记fitc的抗her2抗体标记细胞30min-1h，流式细胞仪检测不同细胞的比例，计算出不同处理后培养皿中的各个细胞比例，由图4可知。adc4、adc5和adc6均可见旁观者效应，其中adc4旁观者效应强于adc5和对照药物adc6。
[1163]
实施例6
[1164]
adc9、adc11及adc12旁观者效应
[1165]
在体外共培养cldn18.2阳性细胞kato3和阴性细胞hgc-27的条件下，观察不同adc对这两个细胞的杀伤情况。收集对数生长期的kato3(cldn18.2阳性细胞)和hgc-27(cldn18.2阴性细胞)，用2％fbs rpmi 1640重悬细胞，铺于6孔板(货号：3516；costar)中，kato3每孔12万个细胞，hcg-27每孔8万个细胞。置于37℃、5％co2培养箱培养过夜，第二天加入3mladc9、adc11、adc12，adc终浓度为10nm、1nm、0.1nm，并以不加adc孔作为阴性对照。置于37℃，5％co2培养箱，培养5天，用胰蛋白酶(货号：25200-072；gibco)消化收集细胞，计算活细胞总数。
[1166]
按蛋白质：fitc＝1mg：150μg的比例将溶解于dmso(d2650，sigma)中的fitc(3326-32-7，sigma)缓慢加入到1mg/ml的hrs9抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4℃反应8小时。加入5m的nh4cl(a501569，生工生物)至终浓度50mm，4℃终止反应2小时，将交联物在pbs(b548117-0500，生工生物)中透析四次以上，至透析液清亮，得到hrs9-fitc抗体。
[1167]
为了确定总存活细胞中kato3和hgc-27的比例，将细胞使用hrs9-fitc抗体染色(kato3是trop2阳性细胞)并在冰上孵育30min，洗涤后，使用cytoflex流式细胞仪(型号：aoo-1-1102，贝克曼)测量染色细胞的荧光信号。根据每个处理孔中kato3阳性和hgc-27阴性细胞的数量和比例，计算kaot3和hgc-27细胞的数量，结果见图5。
[1168]
由图5可知，adc9、adc11及adc12对阳性细胞和阴性细胞都有杀伤作用，其中adc11对阴性细胞的旁观者效应最强。
[1169]
实施例7
[1170]
1、adc14的体外细胞毒性
[1171]
使用b7-h3阳性细胞calu-6和cho-k1-b7-h3和b7-h3阴性细胞cho-k1评价adc14对
肿瘤细胞的体外细胞毒性。简而言之，对于calu-6，将细胞重悬于2％胎牛血清的dmem培养基中，按照100μl/孔(5000个细胞)接种于96孔板，37℃，5％co2培养箱贴壁过夜，加入100μl不同浓度的adc(初始浓度为200μg/ml，4倍梯度稀释，溶媒为含有10％胎牛血清的dmem培养基，继续培养7天；
[1172]
对于cho-k1或cho-k1-b7-h3，将细胞重悬于含有2％胎牛血清的cd cho agt培养基(gibco，货号12490-003)中，按照100μl/孔(4000个细胞)接种于96孔板，37℃，5％co2培养箱贴壁过夜，加入100μl不同浓度的adc(初始浓度为200μg/ml，4倍梯度稀释，溶媒为含有2％胎牛血清的cd cho agt培养基(gibco，货号12490-003))，继续培养6天，加入100μl cck8溶液(细胞计数试剂盒-8(购买公司dojindo及货号ck04))，37℃，5％co2培养箱孵育30分钟，使用酶标仪测量450nm处的吸光度，计算ic
50
值。
[1173]
表8 adc14对肿瘤细胞的体外细胞毒性
[1174][1175]
注：
“‑”
代表杀伤作用不显著
[1176]
结果见表8，adc14对b7-h3阳性细胞calu-6和cho-k1-b7-h3呈现出较强的体外细胞毒性，adc14对b7-h3阴性细胞cho-k1杀伤作用不显著。
[1177]
2、adc14的旁观者效应
[1178]
使用b7-h3阳性细胞cho-k1-b7-h3和b7-h3阴性细胞cho-k1-frα评价adc14的旁观者效应。简而言之，将b7-h3阳性细胞cho-k1-b7-h3或b7-h3阴性细胞cho-k1-frα重悬于含有2％胎牛血清的cd cho agt培养基(gibco，货号12490-003)中，按照100μl/孔(10000个细胞)接种于96孔板，37℃，5％co2培养箱贴壁过夜，加入100μl不同浓度的adc14(初始浓度为6.25μg/ml，4倍梯度稀释，溶媒为含有2％胎牛血清的cd cho agt培养基(gibco，货号12490-003))，37℃，5％co2培养箱孵育3d；adc14处理结束前一天，将b7-h3阴性细胞cho-k1-frα重悬于含有2％胎牛血清的cd cho agt培养基(gibco，货号12490-003)中，按照100μl/孔(6000个细胞)接种于96孔板，37℃，5％co2培养箱孵育过夜；将不同浓度的adc14处理的b7-h3阳性细胞cho-k1-b7-h3或b7-h3阴性细胞cho-k1-frα培养上清液直接加入前一天铺板的b7-h3阴性细胞cho-k1-frα的孔中，继续培养4d，弃培养上清液，加入100μl cck8溶液(细胞计数试剂盒-8(购买公司dojindo及货号ck04))，37℃，5％co2培养箱孵育30分钟，使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
[1179]
结果如图6所示，adc14处理的b7-h3阳性细胞cho-k1-b7-h3培养上清液对b7-h3阴性细胞cho-k1-frα有显著的杀伤作用，而adc14处理的b7-h3阴性细胞cho-k1-frα培养上清液对b7-h3阴性细胞cho-k1-frα没有显著的杀伤作用。
[1180]
实施例8
[1181]
1、adc16体外细胞毒性
[1182]
以frα阳性细胞株jeg-3、mcf-7评价adc16介导的体外细胞毒性。通过胰蛋白酶收获细胞，用梯度稀释的adc16培养，然后在37℃孵育。使用cck-8在5天后测定生存能力。在
spectramax gemini(美谷分子)上读取和分析，以确定ic
50
(半最大抑制浓度)值。
[1183]
实验过程：
[1184]
1)jeg-3细胞用dmem 10％fbs调整细胞密度为6万个细胞/ml，并以每孔100μl接种于96孔板(厂家：corning，货号：3599)中，放在seriesⅱwater jacketed co2 incubator中37℃，5％co2条件下静置3h。
[1185]
mcf-7细胞用dmem 2％fbs调整细胞密度为4万个细胞/ml，并以每孔100μl接种于96孔板(厂家：corning，货号：3599)中，放在seriesⅱwater jacketed co2 incubator中37℃，5％co2条件下静置2h。
[1186]
2)用对应细胞的培养基稀释adc16。
[1187]
jeg-3细胞：adc16浓度从1000nm开始4倍稀释，共8个浓度梯度，再以每孔100μl的体积加入到细胞中。
[1188]
mcf-7细胞：adc16浓度从250nm开始4倍稀释，共8个浓度梯度，再以每孔100μl的体积加入到细胞中。
[1189]
致死对照选用3000nm exatecan。空白对照为对应细胞的培养基。
[1190]
每个浓度设置3个复孔。
[1191]
3)放在seriesⅱwater jacketed co2 incubator中培养5天，条件为37℃，5％co2。
[1192]
4)5天后弃培养上清，加入含10％cck-8的rpmi基础培养基1640(1
×
)，放在seriesⅱwater jacketed co2 incubator中37℃，5％co2条件下静置1h左右。
[1193]
5)在酶标仪spectramax m3进行读数，吸收光波长为450nm。
[1194]
6)数据分析整理：以exatecan处理孔数据为完全杀伤对照，以空白对照为零杀伤对照。计算细胞活率公式如下：
[1195]
细胞活率(％)＝(实验组-致死对照组)/(空白对照组-致死对照组)
×
100
[1196]
7)用graphpad prism处理数据和分析数据。
[1197]
结果如表9所示。结果表明，adc16对frα阳性细胞株具有很高的体外细胞毒性。
[1198]
表9 adc16对frα阳性细胞株的体外细胞毒性
[1199]
细胞系ic
50
(nm)jeg-33.611mcf-70.645
[1200]
2、adc16旁观者效应
[1201]
为了证实adc16诱导的旁观者效应，进行了体外共培养细胞杀伤试验和条件培养基(cm)细胞毒性试验。
[1202]
选择了frα阳性的jeg-3细胞以及frα阴性的a549细胞(adc16对a549细胞基本没有杀伤作用。)进行实验。分别用adc16处理jeg-3细胞2、3、4天。然后将cm转移到a549细胞，监测细胞活力的变化，可以发现a549细胞的活力显著下降。
[1203]
实验过程：
[1204]
1)jeg-3用dmem 10％fbs调整细胞密度为10万个细胞/ml，并以每孔100μl接种于96孔板(厂家：corning，货号：3599)中，放在seriesⅱwater jacketed co2 incubator中37℃，5％co2条件下静置2h。
[1205]
2)用dmem 10％fbs培养基稀释adc16，浓度从2000nm开始4倍稀释，10个浓度梯度，再以每孔100μl的体积加入到细胞中。
[1206]
3)在第二天和第三天重复步骤1)和2)。
[1207]
4)在第五天用dmem 2％fbs培养基调整a549细胞密度为4万个细胞/ml，并以每孔100μl接种于96孔板中，放在seriesⅱwater jacketed co2 incubator中37℃，5％co2条件下静置2h。并加入步骤1)、2)、3)的培养上清，每孔100μl。在列1中加入100μl 3000nm exatecan作为致死对照，在列12中加入100μl dmem 2％fbs培养基作为空白对照。
[1208]
5)放在seriesⅱwater jacketed co2 incubator中培养3天。培养条件为37℃、5％co2。
[1209]
6)弃培养液，加入含10％cck-8的dmem培养基。放在seriesⅱwater jacketed co2incubator中，37℃避光显色1h。随后在酶标仪spectramax m3进行读数，吸收光波长为450nm。
[1210]
7)整理数据。细胞活力计算公式如下：
[1211]
细胞活力(％)＝(实验孔-致死孔)/(空白孔-致死孔)*100
[1212]
8)用graphpad prism进行数据分析。
[1213]
结果如图7所示，adc16与frα阳性的jeg-3细胞体外共培养的培养上清对a549细胞有显著的杀伤作用。
[1214]
实施例9
[1215]
大鼠体内药代动力学检测
[1216]
取一只6-8周健康成年的sprague dawley大鼠，尾静脉推注adc4约1min
±
10s，给药体积为5ml/kg，给药浓度为20mg/kg，分别在给药结束后0.083h、1h、2h、8h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h采集血液，于30-120分钟之内离心分离血清。通过常规的elisa方法检测血样中总抗体(tab)和adc的浓度。
[1217]
总抗体的检测方法简述如下，4℃包被trop2-his过夜，浓度0.75μg/ml，37℃5％的脱脂奶粉封闭2h，加入标曲和质控点孵育2h，标曲检测范围为64ng/ml-0.5ng/ml,64ng/ml起始，2倍梯度稀释，质控浓度点设置为60ng/ml，6ng/ml，0.6ng/ml，质控点回收率需要在80％-120％之间，随后加入1:8000稀释加入山羊中生产的抗人κ轻链过氧化物酶抗体，(厂家：sigma，货号：a7164-1ml)二抗，孵育1h，pbst洗8遍后，加入tmb显色，0.1m硫酸终止，od450酶标仪读板，使用酶标检测仪分析软件softmax pro，计算不同时间点血样浓度。
[1218]
adc的检测方法简述如下，4℃包被trop2-his过夜，浓度0.75μg/ml，37℃5％的脱脂奶粉封闭2h，加入标曲和质控点孵育2h，标曲检测范围为64ng/ml-0.5ng/ml,64ng/ml起始，2倍梯度稀释，质控浓度点设置为60ng/ml，6ng/ml，0.6ng/ml，质控点回收率需要在80％-120％之间，随后加入兔多抗小分子的(金斯瑞免疫获得)二抗(1:5000稀释)，孵育1h，1:8000稀释加入fc片段特异的过氧化物酶亲和纯山羊抗兔igg(jackson immunono research，111-035-008)，孵育1h，pbst洗8遍，加入100μl的单组分tmb显色液(湖州英创，tmb-s-001)显色，0.1m硫酸终止，od450酶标仪读板，使用酶标检测仪分析软件softmax pro，计算不同时间点血样浓度，使用elisa绘制出血液中药物浓度变化曲线，见图8，adc浓度与总抗体浓度基本重合，脱落极低，在血液中很稳定。
[1219]
实施例10
[1220]
adc4在capan-1体内药效
[1221]
本试验评价adc4在人源胰腺癌capan-1细胞株皮下异种移植雌性balb/c裸鼠动物模型中的药效学研究。每组10只小鼠，试验设计方案如下，试验药物为adc4，对照药物为adc6和adc7。
[1222]
表10人源胰腺癌capan-1皮下异种移植模型中的给药途径、剂量及方案
[1223][1224]
注：1.分组当天定义为第0天，给药从第0天开始。
[1225]
所有药物均用pbs稀释配置至给定浓度后给药，试验动物为7-9周balb/c nude雌性小鼠(北京安凯毅博生物技术有限公司)。
[1226]
capan-1细胞培养在含20％胎牛血清的imdm培养液中。收集指数生长期的capan-1细胞，pbs重悬至适合浓度用于裸鼠皮下肿瘤接种。实验小鼠于右前肩胛处皮下接种5
×
106capan-1细胞，细胞重悬在与基质胶1:1混合的pbs中(0.1ml/只)，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均体积159.77mm3时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药。分组当天设定为第0天，给药开始于第0天。
[1227]
肿瘤接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低(体重每周测量2次)情况，眼睛、被毛及其它异常情况。实验过程中观察到的临床症状均记录在原始数据中。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2
×
(a
×
b2)(其中a表示长径，b表示短径)。实验中使用studydirector
tm
(版本号3.1.399.19，studylog system,inc.,s.san francisco,ca,usa)软件收集数据。
[1228]
表11.capan-1异种移植模型中各组药效分析表
[1229][1230]
注：a.数据以“平均值
±
标准误差”表示；
[1231]
b.tgi％＝[1-(ti-t0)/(ci-c0)]
×
100其中t0及c0分别是给药组及溶媒对照组分组当天(第0天)的平均肿瘤体积，ti及ci分别是给药组及溶媒对照组第25天时的平均肿瘤体积；
[1232]
c.*p《0.05，**p《0.01及***p《0.001与溶媒对照组肿瘤体积相比。
[1233]
如图9所示，在5mg/kg给药量时，adc4的药效显著强于对照药物adc7,并强于adc6，adc7在5mg/kg浓度时，对该模型基本无抑制肿瘤生长的作用，adc4单次给药后在第25天对肿瘤的tgi高达114％。
[1234]
实施例11
[1235]
药物adc1，adc2，adc3在人卵巢癌sk-ov-3细胞株皮下异种移植雌性balb/c裸小鼠动物模型中的药效学研究
[1236]
测试药物：adc1(5mg/kg)
[1237]
adc2(5mg/kg)
[1238]
adc3(5mg/kg)
[1239]
配置方法：均用pbs稀释
[1240]
试验动物：balb/c nude，每组6只(江苏集萃药康生物技术有限公司)。
[1241]
试验方法：sk-ov-3细胞培养在含10％胎牛血清的mccoy's 5a培养液中。收集指数生长期的sk-ov-3细胞，pbs重悬至适合浓度用于小鼠皮下肿瘤接种。实验小鼠于右侧背部皮下前肩胛骨处接种1
×
107sk-ov-3细胞，细胞重悬在1：1的pbs与基质胶中(0.1ml/只)定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均体积129.98mm3时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药。分组当天设定为第0天，给药开始于第0天。采用静脉注射给药，单次给药，每周测量2次瘤体积和体重，记录数据。
[1242]
试验结果：肿瘤体积变化见表12和图10，试验结果显示，adc1和adc2单次给药药效显著强于对照药物adc3。实验期间各组小鼠无明显异常或体重降低。
[1243]
表12
[1244][1245]
注：a.数据以“平均值
±
标准误差”表示；
[1246]
b.tgi％＝[1-(ti-t0)/(ci-c0)]
×
100其中t0及c0分别是给药组及溶媒对照组分组当天(第0天)的平均肿瘤体积，ti及ci分别是给药组及溶媒对照组第28天时的平均肿瘤体积；
[1247]
c.*p《0.05，**p《0.01及***p《0.001与溶媒对照组肿瘤体积相比。
[1248]
实施例12
[1249]
adc4和adc6在人三阴性乳腺癌mx-1细胞株皮下异种移植雌性balb/c裸小鼠动物模型中的药效学
[1250]
测试药物：adc4(2.5mg/kg和5mg/kg)
[1251]
adc6(2.5mg/kg和5mg/kg)
[1252]
配置方法：均用pbs稀释
[1253]
试验动物：balb/c nude，每组6只(北京安凯毅博生物技术有限公司)。
[1254]
试验方法：mx-1细胞培养在含10％胎牛血清的rpm1640培养液中。收集指数生长期的mx-1细胞，pbs重悬至适合浓度用于裸鼠皮下肿瘤接种。实验小鼠于右侧背部皮下接种5
×
106mx-1细胞，细胞重悬在pbs中(0.1ml/只)，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均体积149.03mm3时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药。分组当天设定为第0天，给药开始于第0天。
[1255]
肿瘤接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响。
[1256]
试验结果：肿瘤体积变化见表13和图11，试验结果显示，adc4和adc6单次给药药效接近，5mg/kg的给药浓度tgi分别为109.48％和108.84％。实验期间各组小鼠无明显异常或体重降低。
[1257]
表13
[1258][1259]
注：a.数据以“平均值
±
标准误差”表示；
[1260]
b.tgi％＝[1-(ti-t0)/(ci-c0)]
×
100其中t0及c0分别是给药组及溶媒对照组分组当天(第0天)的平均肿瘤体积，ti及ci分别是给药组及溶媒对照组第21天时的平均肿瘤体积；
[1261]
c.*p《0.05，**p《0.01及***p《0.001与溶媒对照组肿瘤体积相比。
[1262]
实施例13
[1263]
adc9、adc11、adc12和adc13在胃癌ga0006异种移植雌性balb/c裸小鼠动物模型中的抗肿瘤作用
[1264]
将直径为2-3mm的瘤块接种于balb/c裸小鼠右前肩胛处皮下。当荷瘤鼠平均肿瘤体积到达约139.15mm3时，将小鼠随机分组。分组当天设定为第0天，给药开始于第0天，单次给药。监测小鼠的体重和肿瘤的生长情况。ga0006异种移植模型各治疗组和对照组肿瘤生长情况见图12。
[1265]
肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2
×
(a
×
b2)(其中a表示长径，b表示短径)。tgi
tv
％＝[1-(ti-t0)/(ci-c0)]
×
100其中t0及c0分别是给药组及溶媒对照组分组当天(第0天)的平均肿瘤体积，ti及ci分别是给药组及溶媒对照组第14天时的平均肿瘤体积。
ns
p》0.05,*p《0.05，**p《0.01及***p《0.001与溶媒对照组肿瘤体积相比。
[1266]
该模型的对照组(第1组)在给药14天后平均瘤体积达到628.62mm3。
[1267]
10mg/kg和5mg/kg adc11(即第2组和第3组)给药14天后，平均肿瘤体积分别为78.17mm3和91.47mm3，相对肿瘤抑制率分别tgi为112.45％(p＝3.43e-09***)和109.75％(p＝6.53e-08***)。
[1268]
10mg/kg和5mg/kg adc13(即第4组和第5组)给药14天后，平均肿瘤体积分别为25.77mm3和78.07mm3，相对肿瘤抑制率分别tgi为123.17％(p＝7.58e-12***)和112.48％(p＝1.23e-08***)。
[1269]
10mg/kg和5mg/kg adc12(即第6组和第7组)给药14天后，平均肿瘤体积分别为185.69mm3和284.02mm3，相对肿瘤抑制率分别tgi为90.50％(p＝5.92e-04***)和70.40％(p＝3.51e-01
ns
)。
[1270]
5mg/kg adc9(即第8组)给药14天后，平均肿瘤体积为296.86mm3，相对肿瘤抑制率tgi为67.79％(p＝3.51e-0
ns
)。
[1271]
与瘤体积数据趋势一致，以肿瘤重量变化为指标，各治疗组同样展示了不同程度的抗肿瘤药效，见图13。
[1272]
实施例14
[1273]
adc14的体内肿瘤抑制活性
[1274]
adc14在人源肝癌hep 3b细胞株皮下异种移植balb/c裸鼠模型中的药效学评价。每组的动物数及详细的给药途径、剂量和方案见表14。
[1275]
表14人源肝癌hep 3b细胞株皮下异种移植balb/c裸鼠模型中的给药途径、剂量及方案
[1276][1277]
注：分组当天定义为第0天；分组当天给药；i.v.：静脉注射
[1278]
hep 3b细胞培养在含10％fbs和1％neaa(gibco,货号11140050)的mem培养基(hyclone,货号sh30024.01)中。收集指数生长期的hep 3b细胞，细胞重悬在与基质胶1:1混合的pbs中。选用6-8周雄性balb/c nude小鼠，每组10只。实验小鼠于右前肩胛处皮下接种5
×
106个hep 3b细胞(0.1ml/只)，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均体积150mm3(100-200mm3)时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药。分组当天设定为day 0，给药开始于day 0。
[1279]
肿瘤细胞接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。开始给药后，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2
×
(a
×
b2)(其中a表示肿瘤长径，b表示肿瘤短径)。接种后day 25计算相对肿瘤抑制率(tgi％)，计算公式如下：tgi％＝(1-给药组平均相对肿瘤体积/溶媒对照组平均相对肿瘤体积)
×
100％。
[1280]
表15 day 25的肿瘤体积和肿瘤抑制率
[1281][1282][1283]
肿瘤抑制结果如表15和图14所示，adc14对hep 3b肿瘤有着剂量依赖的非常强的生长抑制作用；相同小分子量的情况下，adc14对肿瘤生长抑制作用显著强于adc15(第5组对比第3组)。
[1284]
实施例15
[1285]
1、试验药物在卵巢癌ov3756皮下异种移植balb/c nude雌性小鼠模型中的药效学评价。分组及给药方案见表16。
[1286]
表16分组及给药方案
[1287][1288]
从卵巢癌异种移植模型ov3756荷瘤小鼠收取肿瘤组织，切成直径为2-3mm的瘤块接种于6-7周龄雌性balb/c nude小鼠右前肩胛处皮下。
[1289]
当荷瘤鼠平均肿瘤体积到达约137.55mm3时，将小鼠随机分组给药。分组当天设定为第0天，给药开始于第0天。
[1290]
肿瘤接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低(体重每周测量2次)情况，眼睛、被毛及其它异常情况。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2
×
(a
×
b2)(其中a表示长径，b表示短径)。
[1291]
表17 ov3756异种移植模型中各组药效分析表
[1292][1293]
注：a.数据以“平均值
±
标准误差”表示；
[1294]
b.tgi％＝[1-(ti-t0)/(ci-c0)]x100其中t1及c1分别是给药组及溶媒对照组分组当天(day 0)平均肿瘤体积，ti及ci分别是给药组及溶媒对照组day 25时的平均肿瘤体积；
[1295]
c.*p《0.05，**p《0.01及***p《0.001与溶媒对照组肿瘤体积相比。
[1296]
ov3756异种移植模型各治疗组和对照组肿瘤生长情况见表17和图15。从表17和图15可以看出，adc16和adc17可显著抑制ov3756异种移植模型肿瘤生长。
[1297]
2、实验药物在balb/c裸鼠jeg-3皮下模型体内抗肿瘤疗效研究，目的是考察adc16在jeg-3模型的体内药效。分组及给药方案见表18。
[1298]
表18分组及给药方案
[1299][1300]
选用6-8周雌性balb/c nude小鼠，将1
×
106个jeg-3细胞悬浮于含50％基质胶的100μl emem培养基中，于小鼠右侧皮下接种。当平均肿瘤体积达到约118mm3时，根据动物体重和肿瘤体积随机分组给药，每组8只。
[1301]
开始给药后，每周测量两次肿瘤体积。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝0.5a
×
b2(其中a表示肿瘤长径，b表示肿瘤短径)。
[1302]
结果如图16所示，与对照组相比，用adc16治疗具有显著肿瘤抑制作用，且呈剂量依赖性(p《0.001)。至给药后第8天，tgi分别为98.98％(2.5mg/kg)和100.00％(5mg/kg)。值得注意的是，adc16使肿瘤完全消退并维持到实验结束。
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