高暴露优势海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂的制备方法

1.本发明涉及牙科修复材料技术领域，更具体的是涉及基于高暴露优势晶面海胆状氧化锌无机抗菌剂改性牙科复合树脂技术领域。


背景技术：

2.常用的口腔修复材料可以分为金属、牙科用复合树脂、陶瓷材料三大类。牙科用复合树脂是树脂与无机填料制成的，其不仅在强度、硬度、耐磨性、抛旋光性、颜色等方面都与真牙相近，且可被赋予氟释放功能，光致变色诊断功能，类似真牙的光透及散射性能等多种功能，日益广泛地应用于牙齿的修补和重造。
3.龋齿，俗称蛀牙，是一种由口腔内细菌和微生物分解食物残渣，从而产生酸性物质腐蚀健康牙齿所引发的慢性疾病，实质是生物膜介导和糖共同驱动的过程。变异链球菌是其主要致病菌。龋齿的形成过程主要包括无机质的脱矿和有机质的分解，病理上表现为肉眼可见牙齿色泽的逐渐变化到牙齿硬组织的进行性病损。
4.申请号cn201510373172.8公开了低聚合收缩率的牙科复合树脂材料的制备方法，属于牙齿修复材料的技术领域。材料成分为丙烯酸酯类单体、填料、引发剂；方法分制备复合填料和制得复合树脂材料两步；第一步是将纳米硅粉加入分散介质中预分散，加入其他填料；与部分丙烯酸酯类单体-引发剂混合物混合，蒸出分散介质，光照固化，粉碎得到复合填料；第二步是将复合填料加入分散介质中预分散；加入剩余的丙烯酸酯类单体-引发剂混合物搅拌、混合、蒸出分散介质，得到牙科复合树脂材料；丙烯酸酯类单体-引发剂混合物在两步中用量质量比为65～85∶15～35。分两步的预包覆法能明显降低牙科复合树脂材料的聚合收缩率；对填料及复合填料的预分散使其在单体中分散均匀。
5.上述专利存在的问题是该牙科复合树脂材料不具备抗菌性，存在继发龋的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于：为了解决上述牙科复合树脂材料不具备抗菌性，存在继发龋的技术问题，本发明提供高暴露优势晶面海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂的制备方法。
7.本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：
8.高暴露优势晶面海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂的制备方法，包括如下步骤：
9.步骤1、分别将zn(no3)2·
6h2o和nh3·
h2o分别溶于去离子水，分别形成硝酸锌溶液和氨水溶液；
10.步骤2、将氨水溶液滴加至连续搅拌(搅拌转速600-800r/min)的硝酸锌溶液中，后在90-95℃下反应18-20h，反应结束后，冷却至室温，得到初产物；
11.步骤3、将初产物先用水离心、洗涤一次，再用乙醇离心、洗涤两次(清洗初产物中残留的杂质)，于烘箱中60-80℃干燥6-8h，得到高暴露优势晶面海胆状氧化锌；
12.步骤4、将步骤3得到的高暴露优势晶面海胆状氧化锌和树脂基质经超声分散后磁力搅拌，重复三次，得半成品牙科复合流体树脂，经固化得到高暴露优势晶面海胆状氧化锌
抗菌型牙科复合树脂成品。
13.本发明通过控制反应物比例及温度制得了具有高暴露优势晶面多针刺海胆状结构的氧化锌，进而构筑了兼具优异抗菌活性和生物相容性的新型牙科复合树脂。本发明先合成了一种高暴露优势晶面海胆状氧化锌，将其作为添加物加入到树脂基质中进行光固化反应，最终制备成牙科复合树脂。
14.优选的，步骤1中，将7.44g-8.92g zn(no3)2·
6h2o溶于50ml去离子水中形成硝酸锌溶液，将8.75g-10.5g nh3·
h2o溶于200ml去离子水中形成氨水溶液(配置0.5-0.6mol/l的硝酸锌溶液和1.25-1.5mol/l的nh3·
h2o溶液)。
15.优选的，步骤2中以8-12ml/min的速度将氨水溶液滴加到连续搅拌的硝酸锌溶液中。
16.优选的，步骤3中，离心转速为2500-3500r/min，离心时间2-3min。
17.优选的，步骤4中将步骤3得到的高暴露优势晶面海胆状氧化锌和树脂基质经30-35khz超声分散3-5min后磁力搅拌3-5min，搅拌速率为800-1000rpm。
18.优选的，步骤4中半成品牙科复合流体树脂经可见光固化得到高暴露优势晶面海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂成品。
19.优选的，步骤4中高暴露优势晶面海胆状氧化锌占牙科复合树脂成品的质量百分为2.5-7.5％。
20.优选的，树脂基质包括树脂单体和光引发剂体系，光引发剂体系占树脂基质的质量比为1-2％；树脂单体占树脂基质的质量比为98-99％。
21.更为优选的，树脂单体包括双酚a双甲基丙烯酸缩水甘油酯和双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯，双酚a双甲基丙烯酸缩水甘油酯和双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯的质量比为1:1-7:3。
22.更为优选的，光引发剂体系包括主引发剂和共引发剂，主引发剂和共引发剂的质量比为1:1-1:2，主引发剂为樟脑醌，共引发剂为甲基丙烯酸二甲氨乙酯。
23.更为优选的，光引发剂体系占树脂基质的质量比为1％。
24.本发明的有益效果如下：
25.1、本发明制备的高暴露优势晶面海胆状氧化锌，制备方法简单，反应条件较温和，可稳定制备，且与树脂基质混合效果较好，可应用于牙科复合修复树脂领域；
26.2、本发明中的海胆状氧化锌主要暴露晶面族为侧面侧面与锥面与常见的六棱柱状zno(暴露晶面族为侧面和顶面{0001})相比，其拥有更高活性的暴露晶面其表面易形成氧空位，在光照下能有效增强光生电子和空穴的分离程度，故海胆状氧化锌具有更高的催化活性，在相同条件下能够产生更多的h2o2，h2o2产生量的增加有助于提高zno样品的抗菌活性，同时，zno在与水接触时，锌离子逐渐游离出来，由于锌离子的氧化还原性，当它和细菌细胞膜相结合时，也可抑制微生物的生长和繁殖从而导致其死亡，所以海胆状氧化锌能得到优良的抗菌效果；
27.3、本发明海胆状氧化锌与传统树脂形成牙科复合树脂，海胆状氧化锌聚集且尖锐的纳米尖端有益于在表面形成更多的光催化活性位点，得到优良光催化抗菌活性，且其锌离子的释放速度与水接触面积有关，与树脂形成复合材料后，与水的接触面积有限，故能够
缓慢释放锌离子，微量的锌是人体所必需的微量元素，故其有良好的生物相容性。而弥散分布在树脂基体中的氧化锌纳米粒子，易形成应力集中效应，且阻碍树脂基体内的银纹与裂缝的扩展，对复合树脂有增强增韧作用，从而获得优良的力学性能；
28.4、本技术制备的高暴露优势晶面海胆状氧化锌牙科复合树脂抑菌率(变异链球菌抑制率)为81.80％，78.39％和74.13％。
附图说明
29.图1为实施例1中的高暴露优势晶面海胆状氧化锌的红外测试谱图；
30.图2为实施例1中高暴露优势晶面海胆状氧化锌的扫描电镜图；
31.图3为实施例1中高暴露优势晶面海胆状氧化锌的抑菌活性物质过氧化氢释放测定图；
32.图4为实施例1-3中高暴露优势晶面海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂的锌释放测试图；
33.图5为实施例1-3中高暴露优势晶面海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂的细胞毒性测试图；
34.图6为实施例1-3中高暴露优势晶面海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂的压缩强度测试图；
35.图7为空白树脂表面扫面电镜图；
36.图8为实施例1牙科复合树脂表面变异链球菌生物膜扫面电镜图；
37.图9为实施例2牙科复合树脂表面变异链球菌生物膜扫面电镜图；
38.图10为实施例3牙科复合树脂表面变异链球菌生物膜扫面电镜图；
39.图11实施例1-3制备的高暴露优势晶面海胆状氧化锌使用固体琼脂稀释法检测zno在无光照下对变异链球菌最小抑菌浓度的结果图；
40.图12实施例2制备的牙科复合树脂表面能谱分析(eds)图。
具体实施方式
41.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
42.因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
43.实施例1
44.如图1到6，图7和8所示，本实施例提供高暴露优势晶面海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂的制备方法，包括如下步骤：
45.(1)用分析天平称取8.92g zn(no3)2·
6h2o溶解在50ml去离子水中。然后，称取10.5g nh3·
h2o溶解在200ml去离子水中。以10ml/min的速度将氨水溶液滴加到连续搅拌(搅拌转速600r/min)的硝酸锌溶液中，混合物在90℃下反应20h。
46.(2)将初产物先用水离心、洗涤一次，再用乙醇离心、洗涤两次，清洗初产物中残留的杂质，再将初产物转移至烘箱中60℃干燥8h，得到高暴露优势晶面海胆状氧化锌，其中离
心机转速为3500r/min,离心时间2min，所得样品记为高暴露优势晶面海胆状氧化锌。
47.(3)制备树脂基质，双酚a双甲基丙烯酸缩水甘油酯bis-gma，双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯tegdma按照质量比为7:1进行混合，加入质量比为1:2的樟脑醌(cq)和甲基丙烯酸二甲氨乙酯(dmaema),光引发剂体系占树脂基质的质量比为2％，树脂单体占树脂基质的质量比为98％。
48.(4)将步骤(2)得到的高暴露优势晶面海胆状氧化锌按占复合树脂总质量的2.5％加入步骤(3)得到的树脂基质中,其中，树脂基质占复合树脂总质量的97.5％，通过超声及磁力搅拌分散，30-35khz超声分散3min后磁力搅拌5min，重复三次，即可得到未固化的牙科复合流体树脂，最后进行光固化(波长为430-490nm)，得到未添加其他无机填料的牙科复合树脂。
49.本实施例中，制得高暴露优势晶面海胆状氧化锌的红外测试谱图如图1所示，由图1的xrd图谱可知：存在明显的(0002)，和晶面衍射峰，分别位于2θ＝31.8，34.3，36.5，57.2，63.2
°
左右，且样品的xrd所有衍射峰均与纤锌矿结构zno的标准图谱吻合(jcpds no.36-1451)，没有其他杂质峰，且衍射峰峰型尖锐，可知制备得到的是比较纯净的六方纤锌矿结构zno。一般来说，zno的优势生长方向为极性晶面的[0001]方向。zno朝此方向生长的速率最快，则此极性面暴露的比例越少，非极性面暴露的比例越多。同时，nh
4
倾向于附着在一些非极性表面，相对促进极性晶面的生长。因此海胆状zno侧面的和为主要暴露晶面。制得高暴露优势晶面海胆状氧化锌的扫描电镜图如图2所示，确定其形貌特征为多刺海胆状，它是由纳米针聚集向外散发而成，在晶体生长过程中，体系中的相关离子过量，zno沿c轴[0001]方向明显的择优取向生长，其成核生长的速度小于晶体表面活性位点引发的聚集生长速度，所以晶体呈现针状聚集海胆状结构。聚集体尺寸大小为4～6μm。其针状体表面光滑，直径为10～30nm，长度为2～3μm；制得高暴露优势晶面海胆状氧化锌的抑菌活性物质过氧化氢释放测定如图3所示，确定其可释放有效的抗菌活性物质；
[0050]
h2o2检测具体的实验：
[0051]
操作是将一定量的zno加入到盛有100ml去离子水的250ml烧杯中，在无光条件下配制成0.5g/l的悬浮液，并对悬浮液进行10min搅拌处理，然后置于磁力搅拌器上持续搅拌。取不同反应时间下的zno悬浮液，分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0h，采用0.22μm孔径的有机滤膜对反应后的悬浮液进行过滤，所得滤液依次按照如下步骤实验：
[0052]
(1)取同一滤液2份(各5ml)加入到2个10ml容量瓶中编号为a和b，b瓶放置于(37
±
1)℃水浴中预热5min，加入0.1ml浓度为1.0g/l过氧化氢酶溶液，充分混合均匀，继续放置(37
±
1)℃水浴中5min，并摇动数次。在a和b两瓶中依次加入0.5ml浓度为200g/l的nacl水溶液和1.0ml体积分数为10％的hcl溶液(取10ml体积分数为36-38％的浓盐酸加入90ml去离子水中)，酸化处理1-2min后加入0.3ml浓度为10g/l的ki水溶液和0.2ml浓度为10g/l的淀粉溶液(称取1.0g可溶性淀粉，放入盛有100ml沸腾蒸馏水的烧杯中，搅拌直至溶液澄清透明后，自然冷却)，最后加水定容至10ml，摇匀后放置20min。采用酶标仪对上述所得的溶液在580nm内的吸光度进行了检测，用于本体系中活性物质h2o2产生量的分析。
[0053]
于树脂块表面培养变异链球菌生物膜48小时候漂洗固定扫面电镜下观测，图7为
空白树脂表面，图8为实施例1制备的牙科复合树脂表面，可知，本技术实施例1树脂块表面的细菌数更少。
[0054]
实施例2
[0055]
如图4到6，7，9和12所示，本实施例提供高暴露优势晶面海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂的制备方法，包括如下步骤：
[0056]
(1)用分析天平称取8.92g zn(no3)2·
6h2o溶解在50ml去离子水中。然后，称取10.5g nh3·
h2o溶解在200ml去离子水中。以10ml/min的速度将氨水溶液滴加到连续搅拌(搅拌转速700r/min)的硝酸锌溶液中，混合物在90℃下反应20h。
[0057]
(2)将初产物先用水离心、洗涤一次，再用乙醇离心、洗涤两次，清洗初产物中残留的杂质，再将初产物转移至烘箱中60℃干燥8h，得到高暴露优势晶面海胆状氧化锌，其中离心机转速为3500r/min,离心时间2min，所得样品记为高暴露优势晶面海胆状氧化锌。
[0058]
(3)制备树脂基质，双酚a-双甲基丙烯酸缩水甘油bis-gma，双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯tegdma按照质量比为2：1进行混合，加入质量比为1：1.5的樟脑醌(cq)和甲基丙烯酸二甲氨乙酯(dmaema),光引发剂体系占树脂基质总质量的1.5％，树脂单体占树脂基质的质量比为98.5％。
[0059]
(4)将步骤(2)得到的高暴露优势晶面海胆状氧化锌按占复合树脂总质量的5％加入步骤(3)得到的树脂基质中，其中，树脂基质占复合树脂总质量的95％，通过超声及磁力搅拌分散，30-35khz超声分散5min后磁力搅拌3min，重复三次，即可得到未固化的牙科复合流体树脂，最后进行光固化(波长为430-490nm)，得到未添加其他无机填料的牙科复合树脂。
[0060]
于树脂块表面培养变异链球菌生物膜48小时候漂洗固定扫面电镜下观测，图7为空白树脂表面，图9为实施例2制备的牙科复合树脂表面，可知，本技术实施例2树脂块表面的细菌数更少。
[0061]
由图12表面锌元素测定(荧光点代表zn元素)可知，氧化锌均匀分散于本实施制备的牙科复合树脂内。
[0062]
实施例3
[0063]
如图4到6,7和10所示，本实施例提供高暴露优势晶面海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂的制备方法，包括如下步骤：
[0064]
(1)用分析天平称取8.92g zn(no3)2·
6h2o溶解在50ml去离子水中。然后，称取10.5g nh3·
h2o溶解在200ml去离子水中。以10ml/min的速度将氨水溶液滴加到连续搅拌(搅拌转速800r/min)的硝酸锌溶液中，混合物在90℃下反应20h。
[0065]
(2)将初产物先用水离心、洗涤一次，再用乙醇离心、洗涤两次，清洗初产物中残留的杂质，再将初产物转移至烘箱中60℃干燥8h，得到高暴露优势晶面海胆状氧化锌，其中离心机转速为3500r/min,离心时间2min，所得样品记为高暴露优势晶面海胆状氧化锌。
[0066]
(3)制备树脂基质，双酚a-双甲基丙烯酸缩水甘油bis-gma，双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯tegdma按照质量比为1：1进行混合，加入质量比为1：1的樟脑醌(cq)和甲基丙烯酸二甲氨乙酯(dmaema),光引发剂体系占树脂基质总质量的1％，树脂单体占树脂基质的质量比为99％。
[0067]
(4)将步骤(2)得到的高暴露优势晶面海胆状氧化锌按占复合树脂总质量的7.5％
加入步骤(3)得到的树脂基质中，其中，树脂基质占复合树脂总质量的92.5％，通过超声及磁力搅拌分散，30-35khz超声分散5min后磁力搅拌5min，重复三次，即可得到未固化的牙科复合流体树脂，最后进行光固化(波长为430-490nm)，得到未添加其他无机填料的牙科复合树脂。
[0068]
于树脂块表面培养变异链球菌生物膜48小时候漂洗固定扫面电镜下观测，图7为空白树脂表面，图10为实施例3制备的牙科复合树脂表面，可知，本技术实施例3树脂块表面的细菌数更少。
[0069]
实施例1-3，所得的基于高暴露优势晶面海胆状氧化锌改性抗菌型牙科复合树脂(未添加其他无机填料)，抗菌活性物质锌离子的释放如图4所示，表明其可持续稳定释放锌离子(锌离子试剂盒检测，检测出各实施例浸泡液中锌离子浓度，减去空白树脂浸提液中锌离子浓度代表各实施例锌离子的释放量)；所得的基于高暴露优势晶面海胆状氧化锌改性抗菌型牙科复合树脂(未添加其他无机填料)。为了评估改性复合树脂的细胞毒性，从拔除的第三磨牙中收集人牙髓细胞(经伦理委员会批准)用于细胞毒性评估。
[0070]
待测样品灭菌后，浸入带有细胞生长培养基中，在37℃下培养24小时制备浸提液。在96孔培养皿中，每孔共接种5000个细胞，并在37℃的5％co2湿润孵箱中浸泡24小时。然后，用100ul每个样本的提取物代替培养基，未添加氧化锌的树脂为空白对照，更换正常细胞培养液的组作为阴性对照。培养24小时后，将细胞与10ul cck-8溶液再培养1小时。荧光强度由波长为450nm的微孔板阅读器测量，吸光度值被视为细胞活力的指标。
[0071]
经cck-8法测定细胞毒性如图5所示，表明其具有良好的细胞相容性(由美国药典对细胞活力的分级可知，当细胞相对增值率≥75％时，细胞毒性为1级，无细胞毒性。)。根据iso 9917的抗压强度测试，将直径为4mm、高度为6mm的不锈钢圆柱形模具放置在玻璃载玻片上，然后用树脂复合材料过度填充。在完全填充模具后，在顶部按压另一个玻片，整个材料从两端固化40秒。圆柱形树脂试样的侧面再固化40秒，以获得更高的聚合度。每组制备6个复合树脂试样，并将其储存在37℃的水中试验前24小时。然后用万能试验机以0.5mm/min的十字头速度测定抗压强度。将试样平端放置在试验机的板之间，以便沿试样的长轴施加逐渐增加的压缩载荷。经过万能试验机测试后可得到材料的力学性能如图6所示，相比较未改性的树脂，实施例的力学性能优良。
[0072]
如图11所示，实施例1-3制备的高暴露优势晶面海胆状氧化锌，使用固体琼脂稀释法检测zno在无光照下对变异链球菌最小抑菌浓度(mic)，使用双倍浓度琼脂细菌培养基与等体积均匀分散的zno悬液混合，以制备一定浓度的zno-固体琼脂细菌培养基，后将一定量的菌悬液均匀涂布于固体培养基上，培养18-24h后，对菌落进行计数，根据菌落计数结果，无菌落生长的最小抑菌液浓度为该样品对受试菌种的mic值(单一菌落生长可忽略不计)。得出海胆状氧化锌对变异链球菌的mic值为1.5mg/ml。
[0073]
实施例4
[0074]
如4和5，高暴露海胆状氧化锌的制备方法，包括如下步骤：
[0075]
(1)用分析天平称取7.44g zn(no3)2·
6h2o溶解在50ml去离子水中。然后，称取8.75g nh3·
h2o溶解在200ml去离子水中。以12ml/min的速度将氨水溶液滴加到连续搅拌(搅拌转速700r/min)的硝酸锌溶液中，混合物在95℃下反应18h，其中磁力搅拌的转速为800r/min。
[0076]
(2)将初产物与溶剂混合混匀后离心，倒出滤液，反复几次洗涤，分别用水和乙醇两种溶剂，先用水离心、洗涤一次，再用乙醇离心、洗涤两次，清洗初产物中残留的杂质，再将初产物转移至烘箱中80℃干燥6h，得到高暴露优势晶面海胆状氧化锌，其中离心机转速为2500r/min,离心时间3min，所得样品记为高暴露优势晶面海胆状氧化锌。
[0077]
实施例5
[0078]
高暴露海胆状氧化锌的制备方法，包括如下步骤：
[0079]
(1)用分析天平称取8.18g zn(no3)2·
6h2o溶解在50ml去离子水中。然后，称取9.65g nh3·
h2o溶解在200ml去离子水中。以8ml/min的速度将氨水溶液滴加到连续搅拌(搅拌转速750r/min)的硝酸锌溶液中，混合物在90℃下反应19h，其中磁力搅拌的转速为600r/min。
[0080]
(2)将初产物与溶剂混合混匀后离心，倒出滤液，反复几次洗涤，分别用水和乙醇两种溶剂，先用水离心、洗涤一次，再用乙醇离心、洗涤两次，清洗初产物中残留的杂质，再将初产物转移至烘箱中70℃干燥7h，得到高暴露优势晶面海胆状氧化锌，其中离心机转速为3000r/min,离心时间3min，所得样品记为高暴露优势晶面海胆状氧化锌。
[0081]
表1，实施例1至3制备的高暴露优势晶面海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂的抗菌活性测试结果如表1所示。
[0082]
表1实施例1至3高暴露优势晶面海胆状氧化锌抗菌型牙科复合树脂的抑菌率
[0083]
组别抑菌率对照组0实施例181.80％实施例278.39％实施例374.13％
[0084]
表1中的抑菌率是对变异链球菌抑菌率。
[0085]
由表1知，向树脂中引入高暴露优势晶面海胆状氧化锌，就可以达到有效抑制变异链球菌的生长，抗菌性分别达到81.80％、78.39％和74.13％。
[0086]
本技术的技术方案中，对照组(空白对照)为制备的树脂基质。