一种定量检测D-二聚体的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法与流程

一种定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及医学体外诊断技术领域，尤其涉及一种定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.d-二聚体是纤维蛋白单体经活化因子
ⅹⅲ
交联后，经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，能够反映体内的凝血功能和纤溶活性，是机体高凝状态、血栓形成、继发性纤溶亢进的指标。在深静脉血栓、肺栓塞、弥散性血管内凝血、重症肝炎等疾病中水平升高，以及溶栓治疗后均可见d-二聚体水平升高，可作为溶栓治疗的有效观察指标。
3.1975年，gaffney等首先提出d-二聚体的检测可作为监测凝血性疾病的有用的工具。目前对d-二聚体的检测实质上是对包含有d-二聚体的纤维蛋白片段的测定。发生凝血时，凝血酶可作用于纤维蛋白，将其转变为交联纤维蛋白，同时纤溶系统被激活，降解交联纤维蛋白形成各种纤维蛋白降解产物(fdp)碎片。在γ链的作用下，可将两个含d片断的纤维蛋白碎片连接起来，形成d-二聚体。人体内d-二聚体水平的升高可预示其体内存在继发性纤溶亢进。
4.现有技术中，d-二聚体测定试剂盒的灵敏度低，线性范围较窄，低浓度样本检测不出浓度，高浓度样本需要稀释重测，增加了测试成本，对客户端的使用产生了一定的影响。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中的上述问题，提供一种定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法。
6.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒，包括试纸条和壳体；试纸条包括pvc底板，在pvc底板的板面上沿其长度方向顺次设有样本垫、过滤膜、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；硝酸纤维膜上由标记垫向吸水垫一侧依次设有第一定量带、第二定量带、质控带，且第一定量带、第二定量带和质控带沿硝酸纤维素膜的长度方向等距布置；壳体上依次设有加样口、观察窗和条形码；pvc底板和硝酸纤维素膜具有低荧光特性；标记垫含有d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物；第一定量带和第二定量带均包被d-二聚体检测抗体；质控带包被鸡igy抗体；荧光微球的发射波长为400～500nm，且其粒径为50～150nm。
7.一种上述定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
8.s1、将荧光微球活化；
9.s2、将活化的荧光微球分别与抗体a和抗体b进行偶联，加入封闭液反应，加入储存液避光保存，得到抗体a标记的荧光微球标记物和抗体b标记的荧光微球标记物；抗体a为d-二聚体捕获抗体，抗体b为山羊抗鸡单克隆抗体；
10.s3、用稀释液将s1步骤所得的抗体a标记的荧光微球标记物和抗体b标记的荧光微球标记物分别稀释，再混合，将其均匀喷涂于标记垫上，干燥保存；
11.s4、稀释抗体c和抗体d，将稀释后的抗体c喷涂在硝酸纤维素膜上制成第一定量带和第二定量带，稀释后的抗体d喷涂在硝酸纤维素膜上制成质控带，将硝酸纤维素膜恒温干燥并装袋；抗体c为d-二聚体检测抗体，抗体d为鸡igy抗体；
12.s5、在pvc底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、标记垫、过滤膜、样本垫和吸水垫，样本垫、过滤膜、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿pvc底板长度方向的首尾之间至少部分互相搭接，然后切割成试纸条并组装在壳体中，将其干燥后密封；
13.优选地，步骤s1包括以下子步骤：
14.s1.1、将荧光微球超声重悬，加入mes活化缓冲液中，离心并弃去上清液，得到第一荧光微球；荧光微球和mes活化缓冲液的体积比为1:(7～11)；
15.s1.2、将s1.1步骤所得的第一荧光微球用mes活化缓冲液洗涤2～4次，得到第二荧光微球；第一荧光微球和mes活化缓冲液的体积比为1:(8～12)；
16.s1.3、在s1.2步骤所得的第二荧光微球中加入mes活化缓冲液、edc溶液和nhs溶液，mes活化缓冲液：edc溶液：nhs溶液的体积比为(37～39):1:1，震荡并弃去上清液，得到第三荧光微球；
17.s1.4、将s1.3步骤所得的第三荧光微球用tris-hcl缓冲液洗涤2～4次，超声重悬至200～300μl；第三荧光微球和tris-hcl缓冲液的体积比为1:(8～12)。
18.优选地，mes活化缓冲液以其总体积为1l计，包括以下组分：30～50mmol2-(n-吗啡啉)乙磺酸、50～70mmol三羟甲基氨基甲烷、0.3～0.5ml proclin-300或叠氮化钠；且mes活化缓冲液的ph值为6.0～6.2。
19.优选地，edc溶液以总体积为1l计，包括以下组分：15～25g edc和1l水；nhs溶液以总体积为1l计，包括以下组分：15～25g nhs和1l水。
20.优选地，步骤s1.1中离心的温度为2～6℃，转速为12000～16000rpm，时间为10～20min；步骤s1.3中震荡的转速为200～300rpm，时间为25～35min；步骤s1.1和s1.4中，超声重悬的功率为80～120w，超声时间为20～30s；步骤s1.2和s1.4中，洗涤操作为：以12000～16000rpm的转速离心10～20min，并弃去上清液。
21.优选地，步骤s2包括以下子步骤：
22.s2.1、在活化的荧光微球中分别加入抗体a和抗体b，补充tris-hcl缓冲液，第一次震荡，第一次离心并弃去上清液，得到荧光微球-抗体偶联物；抗体与荧光微球的质量比为1:(180～220)；
23.s2.2、分别在s2.1步骤得到的荧光微球-抗体偶联物加入封闭液，第二次震荡，第二次离心并弃去上清液，加入储存液保存，得到抗体a标记的荧光微球标记物和抗体b标记的荧光微球标记物。
24.优选地，tris-hcl缓冲液以其总体积为1l计，包括以下组分：50～70mmol三羟甲基氨基甲烷、20～30mmol hcl、0.3～0.5ml proclin-300或叠氮化钠；且tris-hcl缓冲液的ph值为8.0～8.2。
25.优选地，封闭液以其总体积为1l计，包括以下组分：50～70mmol三羟甲基氨基甲烷、20～30mmol hcl、80～100g bsa或酪蛋白、0.3～0.5ml proclin-300或叠氮化钠和0.5～1g海藻糖；且封闭液的ph值为8.0～8.2。
26.优选地，储存液以其总体积为1l计，包括以下组分：50～70mmol三羟甲基氨基甲
烷、20～30mmol hcl、10～30g bsa或酪蛋白、0.3～0.5ml proclin-300或叠氮化钠、10～20g聚乙二醇6000或聚乙二醇8000、1～3ml表面活性剂和0.5～1g海藻糖；且储存液的ph值为8.0～8.2。
27.优选地，表面活性剂为吐温20、吐温60或吐温80。
28.优选地，第一次震荡的转速为200～300rpm，时间为2～4h；第二次震荡的转速为200～300rpm，时间为0.5～1.5h；第一次和第二次离心的温度为2～6℃，转速为12000～16000rpm，时间为10～20min；保存温度为2～6℃。
29.优选地，步骤s3包括以下子步骤：
30.s3.1、用稀释液分别将抗体a标记的荧光微球标记物和抗体b标记的荧光微球标记物稀释；抗体a标记的荧光微球标记物和稀释液的体积比为1:(7～11)，抗体b标记的荧光微球标记物和稀释液的体积比为1:(27～31)；
31.s3.2、将稀释后的抗体a标记的荧光微球标记物和抗体b标记的荧光微球标记物按体积比为(8～12):1混合，喷涂在标记垫上，将其在40～50℃下干燥36～60h。
32.优选地，稀释液以其总体积为1l计，包括以下组分：50～70mmol三羟甲基氨基甲烷、20～30mmol hcl、0.3～0.5ml proclin-300或叠氮化钠、40～60g蔗糖、4～6g bsa和4～6g吐温20，且稀释液的ph值为8.0～8.2。
33.优选地，在步骤s4中，用pbs缓冲液将抗体c和抗体d稀释至0.5～1.0g/l。
34.优选地，pbs缓冲液以总体积为1l计，包括以下组分：14～18g氯化钠、0.2～0.6g氯化钾、2～3g磷酸氢二钠、0.3～0.7g磷酸二氢钾，5～15g海藻糖，其余为水；且pbs缓冲液的ph值为7.2～7.6。
35.优选地，在步骤s4中，恒温干燥的温度为35～39℃，时间为12～24h。
36.本发明的有益效果：
37.本发明的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒通过采用两条定量带的检测方式，提高了试剂盒线性范围，方便客户端的使用，减少稀释重测的概率，间接降低成本；本发明通过采用更小粒径的荧光微球和弱荧光底板及硝酸纤维素膜，以达到提高灵敏度的目的，使得低浓度样本的准确性得到保障。
38.本发明的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒的制备方法生产成本低，可用于工业化生产，且成品质量有保障。
附图说明
39.图1是本发明实施例1试纸条的侧面结构示意图；
40.图2是本发明实施例1壳体的结构示意图；
41.图3是本发明实施例2-1线性范围内测试结果的线性；
42.图4是本发明实施例2-1与参比试剂盒的临床相关性。
具体实施方式
43.为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
44.实施例1，如图1和图2所示，一种定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒，包括
试纸条和壳体；试纸条包括pvc底板11，在pvc底板11的板面上沿其长度方向顺次设有样本垫12、过滤膜13、标记垫14、硝酸纤维素膜15和吸水垫16；硝酸纤维素膜15上由标记垫14向吸水垫16一侧依次设有第一定量带151、第二定量带152、质控带153，且第一定量带151、第二定量带152和质控带153沿硝酸纤维素膜15的长度方向等距布置。
45.pvc底板11和硝酸纤维素膜15具有低荧光特性；优选不含荧光剂；荧光微球的发射波长为400～500nm，且其粒径为50～150nm。荧光噪声在400-500nm时很弱，以减少荧光微球信号获取的影响，从而保证获得高的荧光信背比，进而达到提高灵敏度的目的。
46.标记垫14含有d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物；第一定量带151和第二定量带152均包被d-二聚体检测抗体，其与标记垫上的d-二聚体捕获抗体的抗原决定簇不同；质控带153包被鸡igy抗体。
47.由于增加了定量带的条数，与第一条定量带151的d-二聚体检测抗体结合后剩余的d-二聚体捕获抗体可以和第二条定量带152结合，因此可以扩大检测范围，提高检测上限，避免hook效应出现检测结果呈假阴性的情况。
48.上述试纸条置于封闭的壳体内，壳体上依次设有加样口21、观察窗22和条形码23。加样口21和观察窗22的具体结构不作限定，根据实际使用情况确定。加样口21对应设置在所述样本垫12上方，通过加样口21加入样品。观察窗22对应设置在硝酸纤维素膜15上方，用于观察第一定量带151、第二定量带152和质控带153的显色情况。条形码23包括产品标准曲线及批号信息，通过荧光定量仪读取。
49.本发明的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒需配套荧光定量仪测试使用，具体地，在加样口加样发生免疫反应后，采用荧光定量仪检测定量带和质控带的荧光信号强度，并以质控带校正定量带的荧光信号强度，进而依据荧光定量仪获取的标准曲线获得样本中d-二聚体浓度，实现d-二聚体的定量检测。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(f)的关系曲线，关系式为f＝f(c)。校正荧光信号强度为f＝αf
定量带
/f
质控带
，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。
50.本发明的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒通过采用两条定量带的检测方式，提高了试剂盒线性范围，方便客户端的使用，减少稀释重测的概率，间接降低成本；还通过采用更小粒径的荧光微球和弱荧光底板及硝酸纤维素膜，以达到提高灵敏度的目的，使得低浓度样本的准确性得到保障。
51.上述定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
52.s1、将荧光微球活化：
53.s1.1、将荧光微球超声重悬，加入mes活化缓冲液中，在2～6℃下，以12000～16000rpm的转速离心10～20min，并弃去上清液，得到第一荧光微球；荧光微球和mes活化缓冲液的体积比为1:(7～11)；超声重悬的功率为80～120w，超声时间为20～30s；
54.s1.2、将s1.1步骤所得的第一荧光微球用mes活化缓冲液洗涤2～4次，具体操作为：以12000～16000rpm的转速离心10～20min，并弃去上清液，得到第二荧光微球；第一荧光微球和mes活化缓冲液的体积比为1:(8～12)；
55.s1.3、在s1.2步骤所得的第二荧光微球中加入mes活化缓冲液、edc溶液和nhs溶液，mes活化缓冲液：edc溶液：nhs溶液的体积比为(37～39):1:1，以200～300rpm的转速震荡25～35min，弃去上清液，得到第三荧光微球；
56.其中，mes活化缓冲液以其总体积为1l计，包括以下组分：30～50mmol2-(n-吗啡啉)乙磺酸、50～70mmol三羟甲基氨基甲烷、0.3～0.5ml proclin-300或叠氮化钠；且mes活化缓冲液的ph值为6.0～6.2。
57.edc溶液以总体积为1l计，包括以下组分：15～25g edc和1l水；nhs溶液以总体积为1l计，包括以下组分：15～25g nhs和1l水。
58.s1.4、将s1.3步骤所得的第三荧光微球用tris-hcl缓冲液洗涤2～4次，具体操作为：以12000～16000rpm的转速离心10～20min，并弃去上清液，超声重悬至200～300μl，得到活化的荧光微球；第三荧光微球和tris-hcl缓冲液的体积比为1:(8～12)；超声重悬的功率为80～120w，超声时间为20～30s。
59.s2、荧光微球标记物制备：
60.s2.1、在活化的荧光微球中分别加入d-二聚体捕获抗体或山羊抗鸡单克隆抗体，补充tris-hcl缓冲液，以200～300rpm的转速进行第一次震荡，时间为2～4h，随后在2～6℃下，以12000～16000rpm的转速进行第二次离心，时间为10～20min，弃去上清液，得到荧光微球-抗体偶联物；抗体与荧光微球的质量比为1:(180～220)；
61.其中，tris-hcl缓冲液以其总体积为1l计，包括以下组分：50～70mmol三羟甲基氨基甲烷、20～30mmol hcl、0.3～0.5ml proclin-300或叠氮化钠；且tris-hcl缓冲液的ph值为8.0～8.2。
62.s2.2、分别在s2.1步骤得到的荧光微球-抗体偶联物加入封闭液，以200～300rpm的转速进行第二次震荡，时间为0.5～1.5h，随后在2～6℃下，以12000～16000rpm的转速进行第二次离心，时间为10～20min，弃去上清液，加入储存液在2～6℃下保存，得到d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物。
63.其中，封闭液以其总体积为1l计，包括以下组分：50～70mmol三羟甲基氨基甲烷、20～30mmol hcl、80～100g bsa或酪蛋白、0.3～0.5ml proclin-300或叠氮化钠和0.5～1g海藻糖；且封闭液的ph值为8.0～8.2。
64.储存液以其总体积为1l计，包括以下组分：50～70mmol三羟甲基氨基甲烷、20～30mmol hcl、10～30g bsa或酪蛋白、0.3～0.5ml proclin-300或叠氮化钠、10～20g聚乙二醇6000或聚乙二醇8000、1～3ml表面活性剂和0.5～1g海藻糖；且储存液的ph值为8.0～8.2。
65.表面活性剂为吐温20、吐温60或吐温80。
66.s3、喷涂标记垫：
67.s3.1、用稀释液分别将d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物稀释；d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和稀释液的体积比为1:(7～11)，山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物和稀释液的体积比为1:(27～31)；
68.其中，稀释液以其总体积为1l计，包括以下组分：50～70mmol三羟甲基氨基甲烷、20～30mmol hcl、0.3～0.5ml proclin-300或叠氮化钠、40～60g蔗糖、4～6g bsa和4～6g吐温20，且稀释液的ph值为8.0～8.2。
69.s3.2、将稀释后的d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物按体积比为(8～12):1混合，喷涂在标记垫上，将其在40～50℃下
干燥36～60h。
70.s4、喷涂硝酸纤维素膜：
71.用pbs缓冲液将d-二聚体检测抗体和鸡igy抗体稀释至0.5～1.0g/l，将稀释后的d-二聚体检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上制成第一定量带和第二定量带，稀释后的鸡igy抗体喷涂在硝酸纤维素膜上制成质控带，将硝酸纤维素膜在35～39℃下恒温干燥12～24h，并装袋；
72.其中，pbs缓冲液以总体积为1l计，包括以下组分：14～18g氯化钠、0.2～0.6g氯化钾、2～3g磷酸氢二钠、0.3～0.7g磷酸二氢钾，5～15g海藻糖，其余为水；且pbs缓冲液的ph值为7.2～7.6。
73.s5、组装试纸条：
74.在pvc底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、标记垫、过滤膜、样本垫和吸水垫，样本垫、过滤膜、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿pvc底板长度方向的首尾之间至少部分互相搭接，然后切割成试纸条并组装在壳体中，将其干燥后密封；
75.具体地，在pvc底板上依次交错粘贴硝酸纤维素膜、标记垫、过滤膜、样本垫和吸水垫，膜与膜之间互相搭接并紧密相连，且硝酸纤维素膜分别与标记垫和吸水垫搭接的长度相等(均为2～3mm)，制成荧光免疫层析试纸条，按照具体生产要求用切条机将其纵向切割成合适宽度(4～5mm)的试纸条，并将试纸条组装在壳体中制成检测板，经过压壳机固定，每个检测板干燥后装进铝箔袋封口，并包装成荧光免疫层析试剂盒，常温避光保存。
76.本发明的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒的制备方法生产成本低，可用于工业化生产，且成品质量有保障。
77.以下通过具体实施方式进行说明：
78.实施例2-1，一种定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒，pvc底板11和硝酸纤维素膜15具有低荧光特性；标记垫14含有d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物；第一定量带151和第二定量带152均包被d-二聚体检测抗体；质控带153包被鸡igy抗体；荧光微球的发射波长为450nm，且其粒径为100nm。
79.上述试剂盒通过以下制备方法进行制备：
80.s1、将荧光微球活化：
81.s1.1、将荧光微球以100w的功率超声震荡25s，取0.1ml超声重悬后的荧光微球，加入0.9ml mes活化缓冲液，在4℃下，以14000rpm的转速离心15min，并弃去上清液，得到第一荧光微球；
82.s1.2、在s1.1步骤所得的第一荧光微球中加入1ml mes活化缓冲液，以14000rpm的转速离心15min，并弃去上清液，重复洗涤3次，得到第二荧光微球；
83.s1.3、在s1.2步骤所得的第二荧光微球中加入950μl mes活化缓冲液、25μl edc溶液和25μl nhs溶液，以250rpm的转速震荡30min，弃去上清液，得到第三荧光微球；
84.其中，mes活化缓冲液以其总体积为1l计，包括以下组分：40mmol 2-(n-吗啡啉)乙磺酸、60mmol三羟甲基氨基甲烷、0.4ml proclin-300；且mes活化缓冲液的ph值为6.1。
85.mes活化缓冲液的制备如下：先配制40mmol/l 2-(n-吗啡啉)乙磺酸和60mmol/l三羟甲基氨基甲烷，加入0.4ml proclin-300，并调ph值为6.1。
86.edc溶液以总体积为1l计，包括以下组分：20g edc和1l水；nhs溶液以总体积为1l
计，包括以下组分：20g nhs和1l水。
87.s1.4、在s1.3步骤所得的第三荧光微球中加入1ml tris-hcl缓冲液，以14000rpm的转速离心15min，并弃去上清液，重复洗涤3次，以100w的功率超声震荡25s，超声重悬至250μl，得到活化的荧光微球。
88.s2、荧光微球标记物制备：
89.s2.1、在250μl活化的荧光微球中分别加入1.25μl d-二聚体捕获抗体或山羊抗鸡单克隆抗体，补充tris-hcl缓冲液至1ml，以250rpm的转速进行第一次震荡，时间为3h，随后在4℃下，以14000rpm的转速进行第二次离心，时间为15min，弃去上清液，得到荧光微球-抗体偶联物；
90.tris-hcl缓冲液以其总体积为1l计，包括以下组分：60mmol三羟甲基氨基甲烷、25mmol hcl、0.4mlproclin-300；且tris-hcl缓冲液的ph值为8.1。
91.tris-hcl缓冲液的制备如下：先配制60mmol/l三羟甲基氨基甲烷和25mmol/l hcl，加入0.4ml proclin-300，并调ph值为8.1。以下实施例的制备与此相同。
92.s2.2、分别在s2.1步骤得到的荧光微球-抗体偶联物加入1ml封闭液，以250rpm的转速进行第二次震荡，时间为1h，随后在4℃下，以14000rpm的转速进行第二次离心，时间为15min，弃去上清液，加入1ml储存液在4℃下保存，得到d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物。
93.其中，封闭液以其总体积为1l计，包括以下组分：60mmol三羟甲基氨基甲烷、25mmol hcl、90g bsa、0.4ml proclin-300和0.8g海藻糖；且封闭液的ph值为8.1。
94.封闭液的制备如下：先配制60mmol/l三羟甲基氨基甲烷和25mmol/lhcl，加入90g bsa、0.4ml proclin-300和0.8g海藻糖，再调ph值为8.1。以下实施例与此相同。
95.储存液以其总体积为1l计，包括以下组分：60mmol三羟甲基氨基甲烷、25mmol hcl、20g bsa、0.4ml proclin-300、15g聚乙二醇6000、2ml吐温20和0.8g海藻糖；且储存液的ph值为8.1。
96.储存液的制备如下：先配制60mmol/l三羟甲基氨基甲烷和25mmol/lhcl、加入20g bsa、0.4ml proclin-300、15g聚乙二醇6000、2ml吐温20和0.8g海藻糖，并调ph值为8.1。以下实施例与此相同。
97.s3、喷涂标记垫：
98.s3.1、将d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和稀释液按体积比为1:9混合稀释，将山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物和稀释液按体积比为1:29混合稀释；
99.其中，稀释液以其总体积为1l计，包括以下组分：60mmol三羟甲基氨基甲烷、25mmol hcl、0.4ml proclin-300、50g蔗糖、5g bsa和5g吐温20，且稀释液的ph值为8.1。
100.稀释液的制备如下：配制60mmol/l三羟甲基氨基甲烷和25mmol/l hcl，加入0.4ml proclin-300、50g蔗糖、5g bsa和5g吐温20，并调ph值为8.1。以下实施例的制备与此相同。
101.s3.2、将稀释后的d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物按体积比为10:1混合，喷涂在标记垫上，将其在45℃下干燥48h。
102.s4、喷涂硝酸纤维素膜：
103.用pbs缓冲液将d-二聚体检测抗体和鸡igy抗体稀释至0.8g/l，将稀释后的d-二聚体检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上制成第一定量带和第二定量带，稀释后的鸡igy抗体喷
涂在硝酸纤维素膜上制成质控带，将其在37℃下恒温干燥18h，并装袋；
104.其中，pbs缓冲液以总体积为1l计，包括以下组分：16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.5g磷酸氢二钠、0.5g磷酸二氢钾，10g海藻糖，其余为水；且pbs缓冲液的ph值为7.4。
105.pbs缓冲液的制备如下：在1l水中加入16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.5g磷酸氢二钠、0.5g磷酸二氢钾和10g海藻糖，并调ph值为7.4。以下实施例与此相同。
106.s5、组装试纸条：
107.在pvc底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、标记垫、过滤膜、样本垫和吸水垫，样本垫、过滤膜、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿pvc底板长度方向的首尾之间至少部分互相搭接，然后切割成试纸条并组装在壳体中，将其干燥后密封。
108.具体地，在pvc底板上依次交错粘贴硝酸纤维素膜、标记垫、过滤膜、样本垫和吸水垫，膜与膜之间互相搭接并紧密相连，且硝酸纤维素膜分别与标记垫和吸水垫搭接的长度均为2mm，制成荧光免疫层析试纸条，利用切条机将其纵向切割成4mm的试纸条，并将试纸条组装在壳体中制成检测板，经过压壳机固定，每个检测板干燥后装进铝箔袋封口，并包装成荧光免疫层析试剂盒，常温避光保存。
109.实施例2-2，一种定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒，pvc底板11和硝酸纤维素膜15具有低荧光特性；标记垫14含有d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物；第一定量带151和第二定量带152均包被d-二聚体检测抗体；质控带153包被鸡igy抗体；荧光微球的发射波长为400nm，且其粒径为50nm。
110.上述试剂盒通过以下制备方法进行制备：
111.s1、将荧光微球活化：
112.s1.1、将荧光微球以80w的功率超声震荡30s，取0.1ml超声重悬后的荧光微球，加入0.7ml mes活化缓冲液，在2℃下，以12000rpm的转速离心20min，并弃去上清液，得到第一荧光微球；
113.s1.2、在s1.1步骤所得的第一荧光微球中加入0.8ml mes活化缓冲液，以14000rpm的转速离心15min，并弃去上清液，重复洗涤3次，得到第二荧光微球；
114.s1.3、在s1.2步骤所得的第二荧光微球中加入925μl mes活化缓冲液、25μl edc溶液和25μl nhs溶液，以200rpm的转速震荡35min，弃去上清液，得到第三荧光微球；
115.其中，mes活化缓冲液以其总体积为1l计，包括以下组分：30mmol 2-(n-吗啡啉)乙磺酸、50mmol三羟甲基氨基甲烷、0.3ml proclin-300；且mes活化缓冲液的ph值为6.0。
116.edc溶液以总体积为1l计，包括以下组分：15g edc和1l水；nhs溶液以总体积为1l计，包括以下组分：15g nhs和1l水。
117.s1.4、在s1.3步骤所得的第三荧光微球中加入0.8ml tris-hcl缓冲液，以12000rpm的转速离心20min，并弃去上清液，重复洗涤2次，以80w的功率超声震荡30s，超声重悬至200μl，得到活化的荧光微球。
118.s2、荧光微球标记物制备：
119.s2.1、在225μl活化的荧光微球中分别加入1.25μl d-二聚体捕获抗体或山羊抗鸡单克隆抗体，补充tris-hcl缓冲液至0.8ml，以200rpm的转速进行第一次震荡，时间为4h，随后在2℃下，以12000rpm的转速进行第二次离心，时间为20min，弃去上清液，得到荧光微球-抗体偶联物；
120.tris-hcl缓冲液以其总体积为1l计，包括以下组分：50mmol三羟甲基氨基甲烷、20mmol hcl、0.3mlproclin-300；且tris-hcl缓冲液的ph值为8.0。
121.s2.2、分别在s2.1步骤得到的荧光微球-抗体偶联物加入0.8ml封闭液，以200rpm的转速进行第二次震荡，时间为4h，随后在2℃下，以12000rpm的转速进行第二次离心，时间为20min，弃去上清液，加入0.8ml储存液在2℃下保存，得到d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物。
122.其中，封闭液以其总体积为1l计，包括以下组分：50mmol三羟甲基氨基甲烷、20mmol hcl、80g酪蛋白、0.3ml叠氮化钠和0.5g海藻糖；且封闭液的ph值为8.0。
123.储存液以其总体积为1l计，包括以下组分：50mmol三羟甲基氨基甲烷、20mmol hcl、10g酪蛋白、0.3ml叠氮化钠、10g聚乙二醇8000、1ml吐温60和0.5g海藻糖；且储存液的ph值为8.0。
124.s3、喷涂标记垫：
125.s3.1、将d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和稀释液按体积比为1:7混合稀释，将山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物和稀释液按体积比为1:27混合稀释；
126.其中，稀释液以其总体积为1l计，包括以下组分：50mmol三羟甲基氨基甲烷、20mmol hcl、0.3ml叠氮化钠、40g蔗糖、4g酪蛋白和4g吐温60，且稀释液的ph值为8.0。
127.s3.2、将稀释后的d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物按体积比为8:1混合，喷涂在标记垫上，将其在40℃下干燥60h。
128.s4、喷涂硝酸纤维素膜：
129.用pbs缓冲液将d-二聚体检测抗体和鸡igy抗体稀释至0.5g/l，将稀释后的d-二聚体检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上制成第一定量带和第二定量带，稀释后的鸡igy抗体喷涂在硝酸纤维素膜上制成质控带，将其在35℃下恒温干燥24h，并装袋；
130.其中，pbs缓冲液以总体积为1l计，包括以下组分：14g氯化钠、0.2g氯化钾、2g磷酸氢二钠、0.3g磷酸二氢钾，5g海藻糖，其余为水；且pbs缓冲液的ph值为7.2。
131.s5、组装试纸条：
132.在pvc底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、标记垫、过滤膜、样本垫和吸水垫，样本垫、过滤膜、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿pvc底板长度方向的首尾之间至少部分互相搭接，然后切割成试纸条并组装在壳体中，将其干燥后密封。
133.具体地，在pvc底板上依次交错粘贴硝酸纤维素膜、标记垫、过滤膜、样本垫和吸水垫，膜与膜之间互相搭接并紧密相连，且硝酸纤维素膜分别与标记垫和吸水垫搭接的长度均为2.5mm，制成荧光免疫层析试纸条，利用切条机将其纵向切割成4.5mm的试纸条，并将试纸条组装在壳体中制成检测板，经过压壳机固定，每个检测板干燥后装进铝箔袋封口，并包装成荧光免疫层析试剂盒，常温避光保存。
134.实施例2-3，一种定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒，pvc底板11和硝酸纤维素膜15具有低荧光特性；标记垫14含有d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物；第一定量带151和第二定量带152均包被d-二聚体检测抗体；质控带153包被鸡igy抗体；荧光微球的发射波长为500nm，且其粒径为150nm。
135.上述试剂盒通过以下制备方法进行制备：
136.s1、将荧光微球活化：
137.s1.1、将荧光微球以120w的功率超声震荡20s，取0.1ml超声重悬后的荧光微球，加入1.1ml mes活化缓冲液，在6℃下，以16000rpm的转速离心10min，并弃去上清液，得到第一荧光微球；
138.s1.2、在s1.1步骤所得的第一荧光微球中加入1.2ml mes活化缓冲液，以16000rpm的转速离心10min，并弃去上清液，重复洗涤3次，得到第二荧光微球；
139.s1.3、在s1.2步骤所得的第二荧光微球中加入975μl mes活化缓冲液、25μl edc溶液和25μl nhs溶液，以300rpm的转速震荡25min，弃去上清液，得到第三荧光微球；
140.其中，mes活化缓冲液以其总体积为1l计，包括以下组分：50mmol 2-(n-吗啡啉)乙磺酸、70mmol三羟甲基氨基甲烷、0.5ml proclin-300；且mes活化缓冲液的ph值为6.2。
141.edc溶液以总体积为1l计，包括以下组分：25g edc和1l水；nhs溶液以总体积为1l计，包括以下组分：25g nhs和1l水。
142.s1.4、在s1.3步骤所得的第三荧光微球中加入1.2ml tris-hcl缓冲液，以16000rpm的转速离心10min，并弃去上清液，重复洗涤4次，以120w的功率超声震荡20s，超声重悬至300μl，得到活化的荧光微球。
143.s2、荧光微球标记物制备：
144.s2.1、在275μl活化的荧光微球中分别加入1.25μl d-二聚体捕获抗体或山羊抗鸡单克隆抗体，补充tris-hcl缓冲液至1.2ml，以300rpm的转速进行第一次震荡，时间为2h，随后在6℃下，以16000rpm的转速进行第二次离心，时间为10min，弃去上清液，得到荧光微球-抗体偶联物；
145.tris-hcl缓冲液以其总体积为1l计，包括以下组分：70mmol三羟甲基氨基甲烷、30mmol hcl、0.5mlproclin-300；且tris-hcl缓冲液的ph值为8.2。
146.s2.2、分别在s2.1步骤得到的荧光微球-抗体偶联物加入1.2ml封闭液，以300rpm的转速进行第二次震荡，时间为2h，随后在6℃下，以16000rpm的转速进行第二次离心，时间为10min，弃去上清液，加入1.2ml储存液在6℃下保存，得到d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物。
147.其中，封闭液以其总体积为1l计，包括以下组分：70mmol三羟甲基氨基甲烷、30mmol hcl、100g bsa、0.5ml proclin-300和1g海藻糖；且封闭液的ph值为8.2。
148.储存液以其总体积为1l计，包括以下组分：70mmol三羟甲基氨基甲烷、30mmol hcl、30g bsa、0.5ml proclin-300、30g聚乙二醇6000、3ml吐温80和1g海藻糖；且储存液的ph值为8.2。
149.s3、喷涂标记垫：
150.s3.1、将d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和稀释液按体积比为1:11混合稀释，将山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物和稀释液按体积比为1:31混合稀释；
151.其中，稀释液以其总体积为1l计，包括以下组分：70mmol三羟甲基氨基甲烷、30mmol hcl、0.5ml proclin-300、60g蔗糖、6g bsa和6g吐温80，且稀释液的ph值为8.2。
152.s3.2、将稀释后的d-二聚体捕获抗体标记的荧光微球标记物和山羊抗鸡单克隆抗体标记的荧光微球标记物按体积比为12:1混合，喷涂在标记垫上，将其在50℃下干燥36h。
153.s4、喷涂硝酸纤维素膜：
154.用pbs缓冲液将d-二聚体检测抗体和鸡igy抗体稀释至1.0g/l，将稀释后的d-二聚
体检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜上制成第一定量带和第二定量带，稀释后的鸡igy抗体喷涂在硝酸纤维素膜上制成质控带，将其在39℃下恒温干燥12h，并装袋；
155.其中，pbs缓冲液以总体积为1l计，包括以下组分：18g氯化钠、0.6g氯化钾、3g磷酸氢二钠、0.7g磷酸二氢钾，15g海藻糖，其余为水；且pbs缓冲液的ph值为7.6。
156.s5、组装试纸条：
157.在pvc底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、标记垫、过滤膜、样本垫和吸水垫，样本垫、过滤膜、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿pvc底板长度方向的首尾之间至少部分互相搭接，然后切割成试纸条并组装在壳体中，将其干燥后密封。
158.在pvc底板上依次交错粘贴硝酸纤维素膜、标记垫、过滤膜、样本垫和吸水垫，膜与膜之间互相搭接并紧密相连，且硝酸纤维素膜分别与标记垫和吸水垫搭接的长度均为3mm，制成荧光免疫层析试纸条，利用切条机将其纵向切割成5mm的试纸条，并将试纸条组装在壳体中制成检测板，经过压壳机固定，每个检测板干燥后装进铝箔袋封口，并包装成荧光免疫层析试剂盒，常温避光保存。
159.性能试验：
160.用实施例2-1的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒配套荧光定量仪，分别对空白限、线性、重复性、准确度和临床相关性进行测试。
161.1.空白限
162.用试剂盒测试5％bsa溶液，重复测试20次，计算20次测试结果的平均值和标准差sd，空白限应不大于0.1mg/l。测试结果如表1所示。
163.表1空白限测试结果
164.[0165][0166]
由测试结果可知，本发明的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析的试剂盒空白限不大于0.1mg/l，符合要求。
[0167]
2.线性
[0168]
用接近d-二聚体线性范围(0.1～30mg/l)上限的高浓度样品和缓冲液稀释成至少5个稀释浓度(xi)；每个稀释浓度测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数(r)，所得结果应≥0.99。
[0169]
测试结果如表2和附图3所示。
[0170][0171]
表2线性测试结果
[0172][0173][0174]
由测试结果可知，本发明实施例2-1制备的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试
剂盒线性相关系数r＝0.9988＞0.99，满足要求。因此，本发明试剂盒的线性范围较广，且线性范围内测试结果的线性相关性较好。
[0175]
3.重复性
[0176]
在重复性条件下，用高值异常样本、正常值样本分别重复测试10次，并分别计算测量值的平均值和标准差(sd)。按公式(2)计算变异系数(cv)，所得结果应符合cv≤15％。测试结果如表3所示。
[0177][0178]
式中：cv—变异系数；
[0179]
sd—标准差；
[0180]
—测量值的平均值。
[0181]
表3重复性测试结果
[0182][0183][0184]
由测试结果可知，本发明制备的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒检测正常值与高值样本的重复性均≤15％，符合要求。
[0185]
4.准确度
[0186]
用定值的企业参考品(低、中、高三个浓度水平)分别对两种试剂进行测试(第一种
为普通粒径微球和普通荧光底板制作的试纸条，第二种为本发明的采用小粒径荧光微球和弱荧光底板制作的试纸条)，每个浓度水平重复检测3次，计算均值m，按公式(3)计算相对偏差(b)。低浓度水平测试结果的相对偏差应在
±
15％范围内，中、高浓度水平测试结果的相对偏差应在
±
10％范围内，三个浓度水平测试结果均合格则准确度符合企业规定要求。测试结果如表4所示。
[0187][0188]
式中：m—3次测试结果均值；
[0189]
t—企业参考品理论浓度值。
[0190]
表4准确度测试结果
[0191][0192][0193]
由测试结果可知，本发明实施例2-1的试剂盒的低浓度测试结果相对偏差在
±
15％范围内，中、高浓度测试结果相对偏差在
±
10％范围内，符合要求。而市售同类试剂盒，即采用普通粒径荧光微球及普通pvc底板制作的试剂盒，其低浓度测试结果相对偏差超过
±
15％，中、高浓度测试结果相对偏差在
±
10％范围内。因此，本发明制备的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒有更高的灵敏度，使得低值样本的准确度得到保障。
[0194]
5.临床相关性测试
[0195]
采用参比试剂盒和实施例2-1的d-二聚体测定试剂盒同时测试一组覆盖线性范围的临床样本(40例)，以参比试剂盒的实测值为x轴，实施例2-1试剂盒的实测值为y轴，做线性回归分析。测试结果应符合要求：线性回归方程应符合斜率k在0.9～1.1之间且相关系数r≥0.975。测试结果如表5和附图4所示。
[0196]
表5临床相关性测试结果
[0197]
[0198][0199]
由测试结果及附图可知，本发明实施例2-1制备的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒与万孚d-二聚体测定试剂盒的临床样本线性回归方程的斜率k在0.9～1.1范围内，相关系数r≥0.975，符合要求。
[0200]
以上测试结果及附图表明，本发明的定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒，空白限、线性、重复性、准确度和临床相关性的测试结果均符合接受标准。因此，本发明的线性范围广，准确度高，重复性好，临床相关性好。
[0201]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。