人功能性角膜内皮细胞及其应用

技术特征：
1.一种方法，其是制造在向人的眼前房内注入时能引发人角膜功能的人功能性角膜内皮细胞的方法，所述方法包括：(b)使角膜内皮前体细胞在能将增殖应激等培养应激极小化的培养条件下增殖和/或分化
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成熟的工序。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人角膜功能包括角膜内皮细胞功能特性。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法还包括：(a)使来自人角膜内皮组织的细胞脱分化而得到所述角膜内皮前体细胞的工序。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其是制造在向人的眼前房内注入时能引发人角膜功能、特别是角膜内皮细胞功能特性的功能性人角膜内皮细胞的方法，所述方法使人角膜内皮前体细胞在细胞生长因子的存在下增殖和/或分化
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成熟，所述细胞生长因子的量低于发生转化的量。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述细胞生长因子包括上皮生长因子(egf)。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述转化包括内皮-间充质转化。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述增殖和/或分化
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成熟的工序在rock抑制剂的存在下进行。8.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞为在线粒体中线粒体依赖性氧化的磷酸化增加、在细胞质
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核内的乙酰coa的表达不增加、并且不引发表观遗传性多基因表达的细胞，所述表观遗传性多基因表达由通过乙酰coa进行的组蛋白乙酰化介导。9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞为在线粒体中表达选自柠檬酸合酶(cs)、乌头酸酶2(aco2)、异柠檬酸脱氢酶2(idh2)、苹果酸脱氢酶2(mdh2)、苹果酸酶3(me3)、acss1、乙酰coa乙酰转移酶1(acat1)、丙酮酸脱氢酶(pdh)、bcat2及支链酮酸脱氢酶2(bckdh2)中的1种或多种代谢相关酶的细胞。10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞不表达或几乎不表达atp柠檬酸裂解酶(acly)、乌头酸酶1(aco1)、异柠檬酸脱氢酶1(idh1)、苹果酸脱氢酶1(mdh1)、苹果酸酶1(me1)、acss2、乙酰coa乙酰转移酶2(acat2)和/或乳酸脱氢酶(ldh)。11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞被确认到表达与角膜内皮(细胞)功能特性相关联的离子通道和/或单羧酸转运体，所述角膜内皮(细胞)功能特性为角膜混浊、水肿的改善，其结果能持续地长期保持角膜内皮组织细胞密度，实现视力改善。12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞使钠/氢交换体1(nhe1)和/或水通道蛋白1(aqp-1)的表达亢进。13.根据权利要求9～10中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞使重碳酸脱水酶5b(ca5b)的表达亢进。14.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞具有不存在于细胞质、核中而细胞器选择性地定位于线粒体中的特
性，以使与tca循环等有关的代谢酶、乙酰辅酶a等代谢产物不会导致夹杂相转移细胞的生成。15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，所述人功能性角膜内皮细胞以如下细胞作为起源来制作，所述细胞选自来自角膜内皮组织的细胞、多能性干细胞、间质干细胞、从角膜内皮采集的角膜内皮前体细胞、从角膜内皮采集的细胞、以及利用直接编程法制作的角膜内皮前体细胞及角膜内皮样细胞。16.一种细胞，其是人功能性角膜内皮细胞，其被确认到表达与角膜内皮(细胞)功能特性相关联的功能性蛋白、或者其不引发或降低阻碍该角膜内皮(细胞)功能特性的蛋白，所述角膜内皮(细胞)功能特性为角膜混浊、水肿的改善，其结果能持续地长期保持角膜内皮组织细胞密度，实现视力改善。17.根据权利要求16所述的细胞，其中，所述细胞为在向人眼前房内注入时能引发人角膜内皮功能特性的人功能性角膜内皮细胞，其在线粒体中表达选自柠檬酸合酶(cs)、乌头酸酶2(aco2)、异柠檬酸脱氢酶2(idh2)、苹果酸脱氢酶2(mdh2)、苹果酸酶3(me3)、acss1、乙酰coa乙酰转移酶1(acat1)、丙酮酸脱氢酶(pdh)、bcat2及支链酮酸脱氢酶2(bckdh2)中的1种或多种代谢相关酶。18.根据权利要求16或17所述的细胞，其中，所述细胞为在向人眼前房内注入时能引发人角膜内皮功能特性的人功能性角膜内皮细胞，其包括选自如下特性中的至少一者：在线粒体中线粒体依赖性氧化的磷酸化增加或者在细胞质
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核内的乙酰coa的表达不增加、以及不引发由通过乙酰coa进行的组蛋白乙酰化介导的表观遗传性的多基因表达。19.根据权利要求16～18中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为人角膜内皮细胞，其不表达或实质上不表达atp柠檬酸裂解酶(acly)、乌头酸酶1(aco1)、异柠檬酸脱氢酶1(idh1)、苹果酸脱氢酶1(mdh1)、苹果酸酶1(me1)、acss2、乙酰coa乙酰转移酶2(acat2)和/或乳酸脱氢酶(ldh)。20.根据权利要求16～19中任一项所述的细胞，其中，在所述人功能性角膜内皮细胞中，钠/氢交换体1(nhe1)和/或水通道蛋白1(aqp-1)的表达亢进。21.根据权利要求16～20中任一项所述的细胞，其中，在所述人功能性角膜内皮细胞中，重碳酸脱水酶5b(ca5b)的表达亢进。22.根据权利要求16～21中任一项所述的细胞，其中，所述人功能性角膜内皮细胞包括选自如下的全部特性：(i)不存在于细胞质、核中而细胞器选择性地定位于线粒体中，以使与tca循环等有关的代谢酶、乙酰辅酶a等代谢产物不会导致夹杂相转移细胞的生成；(ii)线粒体中的线粒体依赖性氧化的磷酸化的增加；(iii)由通过乙酰coa进行的组蛋白乙酰化介导的表观遗传性的多基因表达的降低，包括无引发；(iv)钠/氢交换体1(nhe1)和/或水通道蛋白1(aqp-1)的表达的亢进；以及(v)重碳酸脱水酶5b(ca5b)的表达的亢进。23.根据权利要求16～22中任一项所述的细胞，其中，所述细胞不引起或实质上不引起内皮间质转化。24.一种细胞，其是在向人眼前房内注入时能引发人角膜内皮功能特性的人功能性角膜内皮细胞，所述细胞不引起或实质上不引起内皮间质转化。25.根据权利要求16～24中任一项所述的细胞，其中，所述人功能性角膜内皮细胞以如
下细胞作为起源来制作，所述细胞选自来自角膜内皮组织的细胞、多能性干细胞、间质干细胞、从角膜内皮采集的角膜内皮前体细胞、从角膜内皮采集的细胞、以及利用直接编程法制作的角膜内皮前体细胞及角膜内皮样细胞。26.一种细胞群，其包含通过权利要求1～15中任一项所述的方法制造的细胞和/或权利要求16～25中任一项所述的细胞。27.一种方法，其是在向人的眼前房内注入时能引发人角膜内皮功能特性的人功能性角膜内皮细胞的品质管理或工序管理的方法，所述方法包括确认如下内容的工序：在所述细胞的线粒体中，表达选自柠檬酸合酶(cs)、乌头酸酶2(aco2)、异柠檬酸脱氢酶2(idh2)、苹果酸脱氢酶2(mdh2)、苹果酸酶3(me3)、acss1、乙酰coa乙酰转移酶1(acat1)、丙酮酸脱氢酶(pdh)、bcat2及支链酮酸脱氢酶2(bckdh2)中的1种或多种代谢相关酶。28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述方法还包括确认如下内容的工序：在所述细胞中不引发细胞质
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核内的乙酰coa的表达及由通过乙酰coa进行的组蛋白乙酰化介导的表观遗传性的多基因表达。29.根据权利要求27或28中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括确认如下内容的工序：在所述细胞中，钠/氢交换体1(nhe1)和/或水通道蛋白1(aqp-1)的表达亢进。30.根据权利要求27～29中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括确认如下内容的工序：在所述细胞中，重碳酸脱水酶5b(ca5b)的表达亢进。31.一种方法，其是在向人的眼前房内注入时能引发人角膜内皮功能特性的人功能性角膜内皮细胞的品质管理或工序管理的方法、或者对混杂于人功能性角膜内皮细胞中的角膜内皮非功能性细胞进行检测的方法，所述方法包括确认以下(1)～(13)中的1个或多个项目的工序：(1)在移植日的基于相位差图像的外观检查中，无成纤维细胞、异物、变色或其他的异常；(2)移植日2周前和/或移植日的细胞数为1.5
×
106个细胞/450μl；(3)通过台盼蓝染色，细胞存活率为85％以上；(4)在细胞上清的基于elisa的纯度试验中，pdgf-bb为100pg/ml以上；(5)在移植日2周前和/或移植日所采集的细胞上清的基于facs的纯度试验中，cd166

＞99％、cd24

＜5％、cd26

＜5％、cd200

＜5％、cd44
high
＜5％、cd44
low
＞90％、cd105-～weak
＞90％、cd90

＜5％；(6)效应细胞(e-ratio)＞90％；(7)移植日2天前的泵功能(na /k atpase)：阳性；(8)移植日2天前的屏障功能(zo-1)：阳性；(9)在bsa阴性试验中不足125ng/μl；(10)移植日的ecd为1500个细胞/mm 2
以上；(11)mir184的表达；(12)乳酸产生；(13)细胞尺寸不足250μm。32.一种细胞群，其是在向人的眼前房内注入时能引发人角膜内皮功能特性的人功能性角膜内皮细胞的细胞群，所述细胞群满足以下(1)～(13)中的1个或多个项目：
(1)在移植日的基于相位差图像的外观检查中，无成纤维细胞、异物、变色或其他的异常；(2)移植日2周前和/或移植日的细胞数为1.5
×
106个细胞/450μl；(3)通过台盼蓝染色，细胞存活率为85％以上；(4)在细胞上清的基于elisa的纯度试验中，pdgf-bb为100pg/ml以上；(5)在移植日2周前和/或移植日所采集的细胞上清的基于facs的纯度试验中，cd166

＞99％、cd24

＜5％、cd26

＜5％、cd200

＜5％、cd44
high
＜5％、cd44
low
＞90％、cd105-～weak
＞90％、cd90

＜5％；(6)效应细胞(e-ratio)＞90％；(7)移植日2天前的泵功能(na /k atpase)：阳性；(8)移植日2天前的屏障功能(zo-1)：阳性；(9)在bsa阴性试验中不足125ng/μl；(10)移植日的ecd为1500个细胞/mm2以上；(11)mir184的表达；(12)乳酸产生；(13)细胞尺寸不足250μm。

技术总结
本发明提供一种用于特定培养人角膜内皮细胞的细胞性状的检定技术，所述培养人角膜内皮细胞在临床试验中已被确认到早期临床效果发生及长期稳定的临床效果。本发明提供一种制造人功能性角膜内皮细胞的方法，所述人功能性角膜内皮细胞在向人的眼前房内注入时能引发人角膜功能，该方法包括使角膜内皮前体细胞在能将增殖应激等培养应激极小化的培养条件下增殖和/或分化


技术研发人员：木下茂 羽室淳尔 外园千惠 上野盛夫 户田宗豊
受保护的技术使用者：京都府公立大学法人
技术研发日：2021.02.26
技术公布日：2022/12/2