咪唑二肽的精制方法与流程

1.本发明涉及咪唑二肽的精制方法。


背景技术：

2.咪唑二肽是具有咪唑基的组氨酸或组氨酸衍生物与氨基酸结合而成的二肽，具体例可以列举出：鹅肌肽(β-丙氨酰-1-甲基组氨酸)、肌肽(β-丙氨酰组氨酸)、鲸肌肽(β-丙氨酰-3-甲基组氨酸)、高肌肽(γ-氨基丁酰基-l-组氨酸)等。已知咪唑二肽具有抗疲劳作用、抗氧化作用、抑制血糖上升作用、改善认知功能作用等生理作用，作为功能性成分而备受关注。
3.作为咪唑二肽的制造方法，已知有以l-组氨酸以及3-甲基-l-组氨酸等为起始原料，进行化学、酶法或微生物学合成的方法。例如，下述专利文献1(该文献的全部记载在此作为公开被引用。)中，记载了使用具有咪唑二肽合成活性的微生物制造咪唑二肽的方法。但是，专利文献1中记载的方法使用3-甲基-l-组氨酸以及1-甲基-l-组氨酸作为起始原料，从它们的稳定供给的观点来看，需要以工业规模大量地制造咪唑二肽时仍然存在问题。
4.与此相对，作为以工业规模大量地制造咪唑二肽的方法，有从含有咪唑二肽的金枪鱼、鲣鱼、鲑鱼等鱼类、牛、猪、鲸等哺乳类、鸡等鸟类等动物的提取物中获取的方法。
5.作为从动物性提取物中制造咪唑二肽的方法，有利用离子交换处理的方法。例如，下述专利文献2(该文献的全部记载在此作为公开被引用。)中，记载了以下方法：将对鱼贝类提取物进行脱盐处理所得到的脱盐处理液通入h型弱酸性阳离子交换树脂中，吸附咪唑二肽，然后水洗后用盐酸和/或盐水溶出咪唑二肽。
6.下述专利文献3(该文献的全部记载在此作为公开被引用。)中，记载了以下方法：使动物性提取物与强酸性阳离子交换树脂接触而吸附咪唑二肽，该强酸性阳离子交换树脂为使用调节至与动物性提取物相同电导率范围(10
±
2ms/cm)以及ph范围(5.0
±
0.5)的缓冲液预先平衡化为h型的强酸性阳离子交换树脂；然后用缓冲液以及纯水洗涤后，通过通入或混合ph8～ph12范围的碱性溶液来溶出咪唑二肽。
7.现有技术文献
8.专利文献
9.专利文献1：日本特开2020-22433号公报
10.专利文献2：日本特许第4612549号
11.专利文献3：日本特许第5142126号


技术实现要素：

12.发明要解决的课题
13.一般地，动物性提取物根据动物的种类以及部位，含有两种以上的咪唑二肽。但是，由于如鹅肌肽、肌肽、鲸肌肽和高肌肽的咪唑二肽具有相似的电学性质，因此专利文献2以及3所记载的利用离子交换处理的方法中，两种以上的咪唑二肽没有被单独分离，而是以
动物的提取物的原本具有的成分比例被回收。即，专利文献2以及3中记载的利用离子交换处理的方法存在不能将两种以上的咪唑二肽相互分离的问题。
14.此外，由于肌肽的分子量为226，高肌肽、鹅肌肽以及鲸肌肽的分子量为240，因此它们的分子量彼此相似，在使用反渗透膜、纳滤(nf)膜等按分子量的膜分级中，存在不能将两种以上的咪唑二肽相互分离的问题。
15.例如，使用来源于鸡的提取物，通过离子交换处理法得到的咪唑二肽是含有重量比2：1～3：1的鹅肌肽以及肌肽的混合物。在使用来源于鲸的提取物的情况下，得到的咪唑二肽是含有重量比为4：1至5：1的鲸肌肽和肌肽的混合物。而且，迄今为止，从这些混合物中将各种咪唑二肽在工业上相互分离的方法几乎是未知的。
16.另一方面，由于鲑鱼中所含的咪唑二肽大部分为鹅肌肽，因此通过将来源于鲑鱼的提取物供于离子交换处理法，可以获得高纯度的鹅肌肽。但是，具有单一的咪唑二肽的动物种类有限，而且鲑鱼还存在受渔获量影响的问题。
17.因此，仍然存在的问题是，迄今为止几乎没有不依赖动物性提取物的种类，以高纯度、工业规模地大量生产各种咪唑二肽的方法。
18.因此，本发明要解决的课题在于，提供一种不依赖动物性提取物的种类，以高纯度且工业规模地大量生产各种咪唑二肽的方法。
19.解决课题所采用的手段
20.本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，着眼于鹅肌肽以及鲸肌肽相对于肌肽具有在咪唑环上多了一个甲基的结构。而且，由于这种结构上的差异，针对利用这些分子种类的疏水性差异的相互分离，反复地进行了试错。
21.其结果令人惊奇的是，发现将含有两种以上咪唑二肽的动物性提取物处理液供于使用疏水性吸附树脂的吸附处理以及使用特定的洗脱液的溶出处理，能够将咪唑二肽相互分离。
22.基于这样的见解，本发明人最终成功地创造了从含有至少两种咪唑二肽的动物性提取物处理液中，制造以高纯度含有各个咪唑二肽的精制咪唑二肽的方法。本发明是基于这样的见解和成功示例而完成的发明。
23.因此，根据本发明的一方面，提供以下[1]～[9]所示的方法。
[0024]
[1]咪唑二肽精制物的制造方法，包括以下工序(1)以及(2)。
[0025]
(1)通过将含有至少两种咪唑二肽的动物性提取物处理液供于与疏水性吸附树脂接触的吸附处理，使咪唑二肽吸附到疏水性吸附树脂上的工序；
[0026]
(2)通过将吸附有咪唑二肽的疏水性吸附树脂供于使用水性溶液的溶出处理，将所述至少两种咪唑二肽相互分离并回收，来精制咪唑二肽的工序。
[0027]
[2]根据[1]所述的方法，所述至少两种咪唑二肽含有：肌肽和除肌肽以外的咪唑二肽。
[0028]
[3]根据[1]所述的方法，所述至少两种咪唑二肽含有：肌肽和鹅肌肽；或者，肌肽和鲸肌肽。
[0029]
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，所述疏水性吸附树脂为芳香族系疏水性吸附树脂。
[0030]
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，所述水性溶液是选自水、稀碱性水溶液以
及稀有机溶剂水溶液中的至少一种水性溶液。
[0031]
[6]根据[5]所述的方法，所述稀碱性水溶液是0.001m～0.008m氢氧化钠水溶液，以及，所述稀有机溶剂水溶液是0.1质量％～0.8质量％乙醇水溶液。
[0032]
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，所述动物性提取物处理液是通过将动物性提取物供于使用强酸性阳离子交换树脂的离子吸附处理以及使用碱性水溶液的溶出处理而得到的。
[0033]
[8]根据[7]所述的方法，所述动物性提取物是供于脱盐处理后的动物性提取物。
[0034]
[9]根据[7]～[8]中任一项所述的方法，所述动物性提取物为来源于选自鸡、鲸、牛、猪、鲑鱼、鲣鱼以及金枪鱼中的至少一种动物的肉的动物性提取物。
[0035]
发明效果
[0036]
根据本发明的一方面的方法，通过采用使用疏水性吸附树脂的吸附处理以及使用特定的洗脱液的溶出处理，即使不使用复杂的设备、装置、操作等，也能够得到以高纯度含有各个咪唑二肽的咪唑二肽精制物。因此，本发明的一方面的方法是简便且经济性好、能够在工业规模上实施的方法。
[0037]
根据通过本发明的一方面的方法得到的咪唑二肽精制物，有望在各种咪唑二肽(例如，鹅肌肽、鲸肌肽或肌肽)表现出固有的生理作用。
附图说明
[0038]
图1是表示如后述的实施例所示的将鹅肌肽精制品以及肌肽精制品的混合物相互分离所得到的分离例的图。
[0039]
图2是表示如后述的实施例所示的使用各种洗脱液将鹅肌肽以及肌肽相互分离所得到的分离例的图。
[0040]
图3是表示如后述的实施例所示的使用diaion hp20作为合成吸附树脂将鹅肌肽以及肌肽相互分离所得到的分离例的图。
[0041]
图4是表示如后述的实施例所示的鸡提取物、离子交换处理液以及离子交换处理 nf膜处理液的hplc色谱图。
[0042]
图5是表示如后述的实施例所示的使用鸡肉作为原料，将鹅肌肽以及肌肽相互分离所得到的分离例的图。
[0043]
图6是表示如后述的实施例所示的粗鹅肌肽精制液、前半回收部分以及后半回收部分的hplc色谱图。
[0044]
图7是表示如后述的实施例所示的鲸肉提取物、离子交换处理液以及离子交换处理 nf膜处理液的hplc色谱图。
[0045]
图8是表示如后述的实施例所示的使用鲸肉作为原料，将鹅肌肽以及肌肽相互分离所得到的分离例的图。
[0046]
图9是表示如后述的实施例所示的粗鲸肌肽精制液、前半回收部分以及后半回收部分的hplc色谱图。
[0047]
图10是表示如后述的实施例所示的使用猪肉作为原料，将肌肽、鹅肌肽以及鲸肌肽相互分离所得到的分离例的图。
[0048]
图11是表示如后述的实施例所示的粗肌肽精制液、前半回收部分以及后半回收部
分的hplc色谱图。
具体实施方式
[0049]
下面将对本发明的一方面的方法进行详细说明，但本发明并不仅限于本项目的事项，只要能够实现本发明的目的，可以采取各种方式。
[0050]
除非另有说明，本说明书中的术语以食品领域、药品领域、化妆品领域等技术领域的本领域技术人员通常使用的含义使用，而不应当被不合理地解释为具有限制的含义。另外，本说明书中的推测以及理论是基于本发明人迄今为止的见解以及经验进行的，因此本发明并不仅拘泥于这些推测和理论。
[0051]“rv”表示溶剂相对于树脂量的流量倍数，例如，在通入相对于树脂量为2倍的动物性提取物的情况下，rv为2。
[0052]“sv”表示空间速度(space velocity)，表示每小时通过树脂量(体积)的液量(体积)相对于树脂量的比率。例如，每小时5m3的液量通过1m3的树脂的情况下，sv为5。
[0053]“和/或”表示列出的多个相关项目中的任何一个，或者两个以上的任意组合或全部的组合。
[0054]
数值范围的“～”是含有其前后的数值的范围，例如，“0质量％～100质量％”是指0质量％以上且100质量％以下的范围。另外，本说明书中，“重量％”与“质量％”、“％(w/w)”含义相同。
[0055]“含有”是指能够附加除了明示作为含有的要素以外的要素(与“至少含有”同义)，包含“由...组成”以及“本质由...组成”。即，“含有”可以意味着：含有明示的要素以及任意的一个或两个以上的要素，由明示的要素组成，或者本质上由明示的要素组成。作为要素，可以列举成分、工序、条件、参数等限制事项等。
[0056]
整数值的位数和有效数字的位数一致。例如，1的有效数字是1位，10的有效数字是2位。此外，小数值的小数点以后的位数和有效数字的位数一致。例如，0.1的有效数字是1位，0.10的有效数字是2位。
[0057]
[本发明的一方面的方法的概要]
[0058]
本发明的一方面的方法涉及以下制造方法：从将动物性提取物供于离子交换处理等所得到的含有多种咪唑二肽的动物性提取物处理液中，制造以高纯度含有一种咪唑二肽的咪唑二肽精制物。
[0059]
例如，如图4所示，将鸡提取物吸附到强酸性阳离子交换树脂，然后用苛性钠溶出咪唑二肽，再用nf膜进行脱盐处理的情况下，可以得到去除了肌酐的高纯度咪唑二肽。但在鸡提取物、离子交换处理液以及离子交换处理 nf膜处理液中，咪唑二肽的构成比(鹅肌肽以及肌肽的含量比率)几乎没有变化。
[0060]
同样地，如图7所示，在使用鲸肉提取物的情况下，所得到的咪唑二肽中的鲸肌肽以及肌肽的含量比率经过各处理也几乎没有变化。
[0061]
因此，仅对动物性提取物进行离子交换处理，所得到的处理物中的如鹅肌肽、鲸肌肽、肌肽等各个咪唑二肽组成比取决于所使用的动物性提取物的动物的种类。
[0062]
但是，使用本发明的一方面的方法，可以不依赖于动物性提取物的动物种类，将动物性提取物的离子交换处理液中的各个咪唑二肽相互分离。例如，参照表示将鸡提取物的
离子交换处理液供于本发明的具体方式的方法的结果的图5，使用馏分编号5～7，可以得到以高纯度地含有肌肽且几乎不含有鹅肌肽的咪唑二肽精制物。与此相反，使用后半部分，可以得到以高纯度地含有鹅肌肽且几乎不含有肌肽的咪唑二肽精制物(参照图6c)。
[0063]
作为其它的例子，参照表示将鲸肉提取物的离子交换处理液供于本发明的具体方式的方法的结果的图8，使用前半部分，可以得到以高纯度地含有肌肽且几乎不含有鲸肌肽的咪唑二肽精制物(参照图9b)。与此相反，使用后半部分，可以得到以高纯度地含有鲸肌肽且几乎不含有肌肽的咪唑二肽精制物(参照图9c)。
[0064]
因此，根据本发明的一方面的方法，不限于如鸡、鲸等动物种类，能从动物性提取物处理液中得到以高纯度含有如鹅肌肽、鲸肌肽和肌肽等各个咪唑二肽的咪唑二肽精制物。
[0065]
本发明的一方面的方法包括以下工序(1)和(2)。
[0066]
(1)通过将含有至少两种咪唑二肽的动物性提取物处理液供于与疏水性吸附树脂接触的吸附处理，使咪唑二肽吸附到疏水性吸附树脂上的工序；
[0067]
(2)通过将吸附有咪唑二肽的疏水性吸附树脂供于使用水性溶液的溶出处理，将所述至少两种咪唑二肽相互分离并回收，来精制咪唑二肽的工序。
[0068]
咪唑二肽只要是通常已知的物质就没有特别限定，例如可以是具有咪唑基的组氨酸或组氨酸衍生物与氨基酸结合而成的二肽。作为咪唑二肽的具体例，可以列举出：鹅肌肽(β-丙氨酰-1-甲基组氨酸)、肌肽(β-丙氨酰组氨酸)、鲸肌肽(β-丙氨酰-3-甲基组氨酸)、高肌肽(γ-氨基丁酰-l-组氨酸)等。在本发明的一方面的方法中，由于使用疏水性吸附树脂，并根据咪唑二肽的疏水性差异来实施吸附处理和溶出处理，因此，待相互分离的咪唑二肽优选地是具有疏水性差异的咪唑二肽，更优选地是肌肽和除肌肽以外的咪唑二肽，进一步优选地是肌肽和鹅肌肽，或者，肌肽和鲸肌肽。
[0069]
动物性提取物只要是通过将鱼类、禽类、哺乳类等动物的肉等部位中所含有的成分溶解在提取介质中得到的即可。动物的种类只要是在肉等部位含有咪唑二肽的动物就没有特别限定，例如可以举出：富含鹅肌肽的鲣鱼、金枪鱼、鲑鱼、鳗鱼、鲨鱼、牛、鸡；富含肌肽的猪；富含鲸肌肽的鲸等。动物性提取物的咪唑二肽含量大，从资源量丰富或者容易饲养的角度来看，优选鸡、鲸、牛、猪等畜肉以及鲑鱼、鲣鱼、金枪鱼等鱼类的肌肉。
[0070]
动物性提取物的获取方法没有特别限定，可以使用将含有咪唑二肽的动物部位供于水提取、热水提取、超临界提取等公知的提取方法而得到的提取物，也可以使用市售的提取物。优选地将动物性提取物供于固液分离处理、浓缩处理、干燥处理和稀释处理等加工处理，以从上述提取物中去除不溶性固体以及杂质。
[0071]
将动物性提取物供于离子交换处理的情况下，从降低损失率、提高单位树脂对咪唑二肽的吸附量、从而提高咪唑二肽的纯度的观点来看，优选地将动物性提取物供于脱盐处理。动物性提取物的脱盐处理优选地在例如以下条件实施：使用具有cmv-n/amv-n作为阳离子交换膜/阴离子交换膜的电渗析脱盐机“dw-3e2型”(agc工程公司制)，每1质量％咪唑二肽的目标电导率为2ms/cm至14ms/cm，优选地为约5ms/cm。
[0072]
动物性提取物处理液优选地以高纯度含有至少两种咪唑二肽。作为从动物性提取物得到动物性提取物处理液的方法，可以列举出专利文献1中记载的方法、专利文献2中记载的方法、日本特愿2019-235532的说明书(该文献的全部记载在此作为公开被引用。)中记
载的方法等，但不限于此。
[0073]
动物性提取物处理液中的咪唑二肽的含量以干燥质量(固体成分)计，优选地为70质量％以上，更优选地为80质量％以上。由于动物性提取物中大多含有肌酐，因此动物性提取物处理液中肌酐的含量相对于咪唑二肽的质量优选地为10质量％以下，更优选地为5质量％以下。
[0074]
作为动物性提取物处理液的优选具体例，咪唑二肽的含量以干燥质量(固体成分)计为80质量％以上，且肌酐的含量相对于咪唑二肽的质量为5质量％以下的动物性提取物处理液可以通过例如日本特愿2019-235532说明书中记载的方法得到。因此，动物性提取物处理液的优选具体例是将动物性提取物(优选地供于脱盐处理后的动物性提取物)供于使用强酸性阳离子交换树脂的离子吸附处理以及使用碱性水溶液的溶出处理而得到的动物性提取物处理液。
[0075]
从将各个咪唑二肽相互分离的观点来看，动物性提取物处理液含有至少两种咪唑二肽，但从更高度精制的意义上来说，动物性提取物处理液也可以实质上含有一种咪唑二肽。
[0076]
为了在吸附处理工序中使疏水性吸附树脂对咪唑二肽的吸附良好，动物性提取物处理液优选地ph为7～10，由于咪唑二肽的有效电荷在零附近，因此更优选ph为7.5～9.5，进一步优选地ph为8.0～9.0。动物性提取物处理液的ph不在这些范围内的情况下，可以使用酸或碱来调节ph。
[0077]
[工序(1)：吸附处理工序]
[0078]
在工序(1)中，通过将动物性提取物处理液供于与疏水性吸附树脂接触的吸附处理，使咪唑二肽吸附到疏水性吸附树脂。
[0079]
疏水性吸附树脂只要是不具有离子交换基而具有疏水性的多孔性结构的合成树脂，就没有特别限定，优选地为芳香族系疏水性吸附树脂。芳香族系疏水性吸附树脂是具有作为吸附性取代基的苯环的疏水性吸附树脂，例如可以列举出具有苯基或苯基烷基作为吸附性取代基的疏水性吸附树脂等，其中苯基或苯基烷基可具有具有相同结构或不同结构的取代基，优选地为具有下述通式(i)所示的结构的疏水性吸附树脂。
[0080]
[化学式1]
[0081][0082](i)[0083]
(式中，r1以及r2分别独立地为氢原子、选自f、cl、br以及i中的卤素原子、甲基、乙基、亚甲基或亚乙基，x为0到2的整数，y是0到2的整数。)
[0084]
疏水性吸附树脂可以是通过公知的方法制造的，也可以是市售的。例如，作为市售的芳香族系疏水性吸附树脂，可以列举出：“sepabeads sp207”、“sepabeads sp70”、“sepabeads sp850”、“sepabeads sp825l”、“sepabeads sp700”、“diaion hp20”、“diaion hp21”(均为三菱化学公司制)等，在本发明的一方面的方法中可以优选地使用这些芳香族系疏水性吸附树脂。
[0085]
使动物性提取物处理液与疏水性吸附树脂接触的方法没有特别限定，只要通过它们的接触使动物性提取物处理液中的咪唑二肽吸附到疏水性吸附树脂即可，可以采用将疏水性吸附树脂浸渍在动物性提取物处理液中的分批方式，也可以采用向填充有疏水性吸附树脂的柱中通入动物性提取物处理液的柱方式中的任意一种方式。此时，如果柱操作采用模拟移动床法，则有可能提高咪唑二肽的回收率。
[0086]
动物性提取物处理液中咪唑二肽的含量、疏水性吸附树脂对动物性提取物处理液的负荷量、吸附温度等其他的吸附条件，可以根据所使用的疏水性吸附树脂的种类以及量等，在疏水性吸附树脂的吸附容量的范围内适当设定。在向填充有疏水性吸附树脂的柱中通入动物性提取物处理液的情况下，只要动物性提取物处理液中的咪唑二肽吸附到疏水性吸附树脂，疏水性吸附树脂对动物性提取物处理液的接触速度就没有特别限定，例如优选为，在10℃～30℃下，优选在室温(约20℃)下，sv为0.5～10，优选为1～5的流速。
[0087]
例如，假设1l树脂吸附2g咪唑二肽，则通过使咪唑二肽的含量为0.01质量％以上(优选地为0.05～1.0质量％)的动物性提取物处理液的1rv～10rv(优选地为1rv～5rv)的量，以sv1至sv3的流速，在15℃～25℃(优选地为室温)与疏水性吸附树脂接触，从而能够使咪唑二肽吸附到疏水性吸附树脂。
[0088]
[工序(2)：溶出处理工序]
[0089]
在工序(2)中，将吸附有咪唑二肽的疏水性吸附树脂供于使用水性溶液的溶出处理。通过实施这样的工序(2)，可以将动物性提取物处理液中的多种咪唑二肽相互分离并回收，从而得到以高纯度含有单一咪唑二肽的咪唑二肽精制物。
[0090]
采用水性溶液作为洗脱液，能够根据各个咪唑二肽的疏水性，将多种咪唑二肽相互分离。水溶液只要是水为95质量％以上的、且ph为中性至弱碱性的水性溶液即可。作为水性溶液，优选水、稀碱性水溶液以及稀有机溶剂水溶液。稀碱性水溶液只要含有碱性物质且ph为8～12即可。稀有机溶剂水溶液只要是亲水性有机溶剂和水的混合液即可。
[0091]
稀碱性水溶液中的碱性物质的种类并没有特别限定，稀碱性水溶液例如可以列举出：氢氧化钠水溶液以及氢氧化钾水溶液等碱金属盐氢氧化物水溶液、如氨水溶液等无机碱性水溶液等，从溶出效率及咪唑二肽回收率的观点来看，优选碱金属盐氢氧化物水溶液，更优选氢氧化钠水溶液。例如，稀碱性水溶液是0.001m～0.01m碱金属盐氢氧化物水溶液，更优选地是0.001m～0.008m碱金属盐氢氧化物水溶液，进一步优选地是0.002m～0.007m碱金属盐氢氧化物水溶液。
[0092]
作为稀有机溶剂水溶液中使用的亲水性有机溶剂没有特别限定，例如可以列举出：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等碳原子数为1～5的低级脂肪醇；丙酮、甲乙酮等低级脂肪酮；1，3-丁二醇、丙二醇和甘油等碳原子数为2～5的多元醇，优选地是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇以及丙酮。例如，稀有机溶剂水溶液优选地是0.01质量％～1.0质量％的稀有机溶剂水溶液，更优选地是0.1质量％～0.8质量％的稀有机溶剂水溶液，进一步优选地是0.2质量％～
0.7质量％的稀有机溶剂水溶液。
[0093]
洗脱液的使用量没有特别限定，例如，在向填充有2l芳香族系疏水性吸附树脂的柱中通入动物性提取物处理液的情况下，以2rv～20rv(优选5rv～10rv)的量及sv1.0～sv3.0的流速，在15℃～25℃(优选室温)下通入0.003m～0.006m氢氧化钠水溶液，能够高效地将吸附在疏水性吸附树脂上的多种咪唑二肽相互分离。
[0094]
溶出处理可以在柱内填充以及保持疏水性吸附树脂的状态下，通过搅拌机或通过吹入气体，在搅拌疏水性吸附树脂的同时，通过逐渐添加洗脱液来进行搅拌。
[0095]
经过工序(1)以及工序(2)，能够将动物性提取物处理液中的多种咪唑二肽相互分离并回收，从而得到以高纯度含有单一咪唑二肽的咪唑二肽精制物。咪唑二肽精制物只要是经由工序(1)以及工序(2)得到的即可，对咪唑二肽的纯度没有特别限定。咪唑二肽精制物例如为以下的咪唑二肽精制物：相对于咪唑二肽的总量，特定的单一咪唑二肽的含量为75质量％以上，优选地为85质量％以上，更优选地为90质量％以上，进一步优选地为95质量％以上。
[0096]
作为咪唑二肽精制物的具体例，在使用鸡胸肉的热水提取物作为动物性提取物的情况下，可以列举出以下的咪唑二肽精制物等：相对于咪唑二肽(鹅肌肽、肌肽、鲸肌肽)的总量，鹅肌肽的含量为75质量％以上，优选地为80质量％，更优选地为90质量％以上，进一步优选地为95质量％以上，更进一步优选地为97质量％以上。该情况下，相对于咪唑二肽的总量，肌肽的含量为25质量％以下，优选地为20质量％以下，更优选地为10质量％以下，进一步优选地为5质量％以下。此外，该情况下，以动物性提取物处理液中的鹅肌肽的量为基准，则鹅肌肽的收率可以是50％以上。
[0097]
作为其他的咪唑二肽精制物的具体例，在使用鲸肉的热水提取物作为动物性提取物的情况下，可以列举出以下的咪唑二肽精制物等：相对于咪唑二肽(鲸肌肽、肌肽、鹅肌肽)的总量，鲸肌肽的含量为85质量％以上，优选地为90质量％以上，更优选地为95质量％以上，进一步优选地为97质量％以上。该情况下，相对于咪唑二肽的总量，肌肽的含量为20质量％以下，优选地为25质量％以下，更优选地为10质量％以下，进一步优选地为5质量％以下。此外，该情况下，以动物性提取物处理液中的鲸肌肽的量为基准，则鲸肌肽的收率可以是70％以上。
[0098]
鹅肌肽、鲸肌肽以及肌肽的含量通过后述的实施例中记载的方法测量。
[0099]
为了作为食材使用，可以将经过工序(1)以及工序(2)所得到的咪唑二肽精制物供于ph调节处理、脱色处理、除臭处理、固液分离处理、脱盐处理、浓缩处理、无菌处理、干燥处理等各种处理。例如，可以列举出将工序(2)中所得到的咪唑二肽精制物供于：使用盐酸等酸将ph调节至6～8(优选地接近7)的ph调整处理；使用活性炭以及强碱性离子交换树脂等吸附着色成分和/或臭气成分的材料的脱色处理和/或除臭处理；使用陶瓷过滤器进行过滤处理等的固液分离处理；使用电渗析膜或纳滤膜的脱盐处理；使用蒸发器等进行浓缩处理；使用膜过滤器等的无菌处理；使用喷雾干燥机等的干燥处理；以及依次进行其中的两种以上的处理等。关于各种处理，只要咪唑二肽的损失不变大，关于其条件、步骤等方法就没有特别限定，可以采用公知的方法。
[0100]
例如，咪唑二肽精制物的脱盐处理可以在ph8.0以下的条件下，使用截留分子量为500以下、和/或食盐阻截率(食盐在膜上的保留率)为50％以下的纳滤膜来实施。关于此种
纳滤膜，在特许文献3的表3中有记载。将咪唑二肽精制物供于脱盐处理的情况下，脱盐后的盐浓度例如相对于咪唑二肽的质量以钠量计，优选地为5质量％以下，更优选地为2质量％以下。
[0101]
本发明的一方面的方法，只要能够解决本发明的课题，可以在上述的工序之前或之后、或者在工序过程中添加各种工序以及操作。其中，本发明的一方面的方法中，作为咪唑二肽的精制工序，由以下工序(1)和工序(2)组成：(1)通过将含有至少两种咪唑二肽的动物性提取物处理液供于与疏水性吸附树脂接触的吸附处理，使咪唑二肽吸附到疏水性吸附树脂上的工序；和，(2)通过将吸附有咪唑二肽的疏水性吸附树脂供于使用水性溶液的溶出处理，将所述至少两种咪唑二肽相互分离并回收，来精制咪唑二肽的工序；即，优选地，工序(1)和工序(2)之间不含其他工序。
[0102]
下面将说明包括动物性提取物处理液的获取方法在内的咪唑二肽精制物的制造方法的具体方式，但本发明的方法并不限于以下内容。
[0103]
在填充有强酸性阳离子交换树脂的柱中，通入酸使树脂的离子交换基为h型后，通入水，再通入碱金属盐水溶液，将树脂的离子交换基转换为na型。接着，通入水，洗涤多余的碱金属盐水溶液。
[0104]
将含有咪唑二肽的动物的部位添加到水中后，在80℃～95℃下，供于数十分钟～数小时的热水提取处理。将得到的热水提取物直接供于浓缩处理以及固液分离处理，或者，将得到的热水提取物供于使用电渗析膜或纳滤膜的脱盐处理后再供于浓缩处理以及固液分离处理，得到咪唑二肽为0.1质量％～1.0质量％、brix为1.0％～10.0％、且ph为5.6～8.0的动物性提取物。
[0105]
将动物性提取物以1rv～10rv、sv1～sv3通入填充有已转换为na型的强酸性阳离子交换树脂的柱中，接着通入0.5rv～5rv的水，使动物性提取物中的咪唑二肽吸附在强酸性阳离子交换树脂上。该吸附处理后柱内的ph为5.6～8.0。
[0106]
接着，将0.1n～1.0n的碱金属盐氢氧化物水溶液以1rv～5rv、sv1～sv5通入柱，得到作为溶出液(动物性提取物处理液)的高纯度咪唑二肽。溶出处理后柱内的ph为8.5～14.0。
[0107]
将得到的动物性提取物处理液添加酸，调节至ph8～9，以10℃～30℃、1rv～10rv、sv1～sv5通入填充有芳香族系疏水性吸附树脂的柱中，使动物性提取物处理液中的咪唑二肽吸附到芳香族系疏水性吸附树脂。该吸附处理后的柱内的ph与使用的动物性提取物处理液相同，为8～9。
[0108]
接着，通过将0.001m～0.01m的碱金属盐氢氧化物水溶液作为稀碱性水溶液，以10℃～30℃、1rv～10rv、sv1～sv5通入柱中，多种咪唑二肽相互分离并按适当量馏分回收，来精制咪唑二肽，从而得到以高纯度含有各个咪唑二肽的咪唑二肽精制物。另外，溶出处理后柱内的ph与使用的稀碱性水溶液相同，为8～12。
[0109]
可以将咪唑二肽精制物依次供于使用酸调节至接近中性的ph调节处理、使用电渗析膜或纳滤膜的脱盐处理、使用蒸发器的浓缩处理、以及使用孔径0.20μm～0.45μm的膜过滤器的无菌过滤处理，得到咪唑二肽高度精制物。
[0110]
通过本发明的一方面的方法得到的咪唑二肽精制物的剂型没有特别限定，可以是液体状，也可以是固体状。为了适合长期保存，优选地将液体状的咪唑二肽精制物供于风
干、减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等干燥处理，使其成粉末状。
[0111]
通过本发明的一方面的方法得到的咪唑二肽精制物的用途没有特别限定。咪唑二肽精制物中，特定的咪唑二肽的含量较大，且其他咪唑二肽含量较小。例如，咪唑二肽精制物以高纯度含有鹅肌肽、鲸肌肽、肌肽，因此可以期待这些各个物质所具有的抗疲劳作用、抗氧化作用、血糖上升抑制作用、认知功能改善作用等生理活性，可以作为如饮食品、医药品等口服用组合物、如化妆品等外用组合物等各种组合物原料或该组合物本身使用。
[0112]
饮食品以及化妆品中咪唑二肽精制物的含量没有特别限定，例如，相对于饮食品和化妆品的总量，咪唑二肽以干燥质量计，优选地为0.001质量％以上的量，更优选地为0.1质量％～99质量％的量。
[0113]
饮食品的剂型没有特别限定，例如可列举出液剂、散剂、片剂、丸剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、果冻、咀嚼剂、膏剂等。
[0114]
作为饮食品的具体形式，可以列举出但不限于：清凉饮料、碳酸饮料、果实饮料、蔬菜汁、乳酸菌饮料、乳饮料、豆浆、矿泉水、茶类饮料、咖啡饮料、运动饮料、酒精饮料、果冻饮料等饮料类；番茄泥、蘑菇罐头、干菜、酱菜等蔬菜加工品；干燥果实、果酱、果泥、果实罐头等果实加工品；咖喱粉、芥末、姜、香料混合料、调味粉等香辛料；意大利面、乌冬面、荞麦面、拉面、通心粉等面类(含鲜面、干面)；面包、点心面包、烹饪面包、甜甜圈等面包类；脱水米饭、燕麦片、面筋、面糊粉等粉类产品；烘焙点心、饼干、米饼、糖果、巧克力、口香糖、零食、冷点心、蜜饯点心、日式点心、西式点心、半生点心、布丁、冰淇淋等点心类；小豆、豆腐、纳豆、黄豆粉、豆腐皮、煮豆、花生等豆类产品；蜂蜜、蜂王浆等加工食品；火腿、香肠、培根等肉制品；酸奶、布丁、炼乳、奶酪、发酵乳、黄油、冰淇淋等奶酪乳制品；加工蛋制品；干货、鱼板、鱼糕、鱼肉香肠等加工鱼；干裙带菜、海带、佃煮等加工海藻；鳕鱼子、鲱鱼子、鲑鱼子、乌鱼子等加工鱼子；高汤、酱油、醋、料酒、清汤底料、中式底料、浓缩汤汁、调味汁、蛋黄酱、番茄酱、味增等调味料；色拉油、芝麻油、亚油酸油、甘油二酯、香油等食用油脂；汤(含粉末、液体)、家常菜、蒸煮食品、保鲜食品、半熟食品(例如，煮好的米饭配料、蟹肉配料)等熟食等。
[0115]
在化妆品中配合使用的情况下，可以以化妆水、乳液、乳霜、凝胶、面膜剂等各种形态使用。
[0116]
下面将参考实施例进一步地详细地描述本发明，但本发明不限于这些实施例，只要能够解决本发明的课题，本发明可以采取各种方式。
[0117]
实施例
[0118]
[例1.鹅肌肽以及肌肽的相互分离评价]
[0119]
调制100ml的混合溶液，该混合溶液含有200μmol的l-鹅肌肽(源于鲑鱼的鹅肌肽精制品，东海物产公司制)和200μmol的l-肌肽(滨理药品公司制)。将得到的混合液在20℃下以sv2通入装有50ml芳香族系合成吸附树脂(“sepabeads sp207”；三菱化学公司制)的柱(φ20mm、高300mm)中，使鹅肌肽以及肌肽吸附到树脂。接着，向柱中以6rv、sv2、20℃通入0.005m氢氧化钠水溶液，每次馏分回收10ml洗脱液，溶出鹅肌肽以及肌肽。
[0120]
通过hplc测量了所得馏分中的鹅肌肽以及肌肽的浓度。hplc中，使用“inertsustain c18(粒径5μm、φ4.6mm
×
150mm)”(gl科学公司制)作为柱，使用添加了10mm磷酸钠(ph6.5)的水作为展开溶剂，使用“pu-2089”(日本分光公司制；流速1.0ml/min、25℃、注入容量5μl、检测波长210nm)作为hplc。
[0121]
分离例如图1所示。如图1所示，确认了肌肽首先溶出，其次鹅肌肽溶出。确认了由于肌肽以及鹅肌肽以不同的洗脱峰溶出，因此通过错开回收时机，回收肌肽溶出结束后的洗脱液，可以得到富含鹅肌肽的部分。
[0122]
[例2.用于相互分离的洗脱液的评价]
[0123]
使用例1中所使用的含有鹅肌肽以及肌肽的混合液，与例1同样地确认了肌肽以及鹅肌肽的吸附、溶出。
[0124]
其中，作为洗脱液，使用蒸馏水、0.5质量％乙醇水溶液、0.01m氢氧化钠水溶液及0.005m氢氧化钠水溶液。
[0125]
分离例如图2所示。如图2所示，确认了在使用所使用的洗脱液的情况下，肌肽以及鹅肌肽以不同的洗脱峰溶出。
[0126]
[例3.用于相互分离的合成吸附树脂的评价]
[0127]
调制100ml的混合溶液，该混合溶液含有50μmol的l-鹅肌肽(源于鲑鱼的鹅肌肽精制品，东海物产公司制)和50μmol的l-肌肽(滨理药品公司制)(各0.5mm)。将得到的混合液在20℃下以sv2通入装有50ml芳香族系合成吸附树脂(“diaion hp20”；三菱化学公司制)的柱(φ20mm、高300mm)中，使鹅肌肽以及肌肽吸附到树脂。接着，向柱中以rv3、sv2、20℃通入蒸馏水，每次馏分回收10ml洗脱液，溶出鹅肌肽以及肌肽。
[0128]
与例1同样地，通过hplc测量了所得馏分中的鹅肌肽以及肌肽的浓度。
[0129]
分离例如图3所示。如图3所示，可知使用不同的芳香族系合成吸附树脂也可以将肌肽以及鹅肌肽相互分离。
[0130]
[例4.使用鸡肉的肌肽以及鹅肌肽的相互分离评价]
[0131]
将鸡胸肉进行热水提取，得到鸡提取物。将得到的鸡提取物供于硅藻土过滤处理，然后用水稀释，得到brix为7.5％、鹅肌肽为0.53质量％以及肌肽为0.22质量％的鸡肉粗提取液。将得到的鸡肉粗提取液以4rv、2sv通入填充有1000ml预先用10％nacl制成na型的强酸性阳离子交换树脂(“diaion sk1b”；三菱化学公司制)的柱中，使其吸附咪唑二肽。吸附处理后，向柱中以sv2通入1rv的ro水，然后以2rv、sv2通入0.4m氢氧化钠溶液，溶出树脂上吸附的咪唑二肽，得到来源于鸡的粗鹅肌肽精制液(离子交换处理液)。另外，作为参考，对于将另外准备的鸡提取物及离子交换处理液、以及使用截留分子量为500以下且食盐阻截率为50％以下的纳滤膜对离子交换处理液进行处理所得到的过滤液(离子交换处理 nf膜处理液)，与例1同样地测量后的结果示于图4以及表1中。
[0132]
[表1]
[0133][0134]
向填充有1000ml的芳香族系合成吸附树脂(“sepabeads sp207”；三菱化学公司制)的柱(φ550mm、高1000mm)中，以2rv、sv2通入来源于鸡的粗鹅肌肽精制液(鹅肌肽
2002mg、肌肽757mg)，进行吸附处理。
[0135]
接着，向柱中以6rv、sv2通入0.005m氢氧化钠，进行溶出处理。洗脱液按每400ml馏分回收，与例1同样地用hplc测量鹅肌肽以及肌肽。分离例如图5所示。
[0136]
如图5所示，确认了肌肽首先溶出，然后鹅肌肽溶出。由于各自的洗脱峰相互分离，因此推测通过在肌肽完全溶出后回收鹅肌肽，能够得到鹅肌肽比率高的洗脱液。
[0137]
将洗脱液以肌肽/鹅肌肽的质量比率低于10％为界分成2部分，作为前半部分及后半部分回收。各部分的hplc色谱图如图6所示，鹅肌肽、肌肽及鲸肌肽的回收率以及组成比率如表2所示。
[0138]
[表2]
[0139][0140]
如图6以及表2所示，相对于负荷量的鹅肌肽回收率，前半部分中为29重量％，后半部分中为56重量％。咪唑二肽的组成比率为重量％，前半部分为鹅肌肽：肌肽＝47.1：52.9，后半部分为鹅肌肽：肌肽＝97.1：2.9。
[0141]
因此，在后半部分中，能够得到咪唑二肽中含有90重量％以上鹅肌肽的高鹅肌肽含有物。
[0142]
[例5.使用鲸肉的肌肽以及鲸肌肽的相互分离评价]
[0143]
对于1500g小须鲸的胸肉(冰岛产)，添加3000g自来水，在90℃下热水提取60分钟，得到鲸肉提取物。将全部的鲸肉提取物通过硅藻土过滤，得到brix为1.7％、鲸肌肽为0.48质量％、且肌肽为0.09质量％的鲸粗提取液2800g。用与例4同样的方法对该鲸粗提取液进行离子交换处理，得到来源于鲸的粗鲸肌肽精制液(离子交换处理)。另外，作为参考，对于将另外准备的鲸提取物及离子交换处理液、以及使用例4中所使用的纳滤膜对离子交换处理液进行处理所得到的过滤液(离子交换处理 nf膜处理液)，与例1同样地测量后的结果示于图7以及表3中。
[0144]
[表3]
[0145][0146]
使用来源于鲸的粗鲸肌肽精制液(鲸肌肽2001mg、肌肽359mg、鹅肌肽19mg)，与例4同样地进行吸附处理以及溶出处理。洗脱液按每400ml馏分回收，与例1同样地用hplc对鲸肌肽、肌肽以及鹅肌肽进行定量。分离例如图8所示。
[0147]
如图8所示，确认了肌肽首先溶出，然后鲸肌肽溶出。由于各自的洗脱峰相互分离，因此推测通过在肌肽完全溶出后回收鲸肌肽，能够得到鲸肌肽比率高的洗脱液。
[0148]
将洗脱液以肌肽/鲸肌肽的质量比率低于10％为界分成2部分，作为前半部分及后半部分回收。各部分的hplc色谱图如图9所示，鹅肌肽、肌肽以及鲸肌肽的回收率以及组成比率如表4所示。
[0149]
[表4]
[0150][0151]
如图9以及表4所示，相对于负荷量的鲸肌肽回收率，前半部分中为4重量％，后半部分中为81重量％。咪唑二肽的组成比率按重量％，前半部分为鲸肌肽：肌肽：鹅肌肽＝19.0：78.8：2.2，后半部分为鲸肌肽：肌肽：鹅肌肽＝97.7：1.5：0.8。
[0152]
因此，在后半部分中，能够在咪唑二肽中得到含有90重量％以上鲸肌肽的高鲸肌肽含有物。
[0153]
[例6.使用猪肉的肌肽、鹅肌肽及鲸肌肽的相互分离评价]
[0154]
对于2000g猪大腿肉(国产)，添加2000g的自来水，用90℃的热水提取60分钟，得到猪肉提取物。将全部的猪肉提取物通过硅藻土过滤，得到brix为1.9％、肌肽为0.16质量％、且鹅肌肽为0.01质量％、鲸肌肽为0.01质量％的猪肉粗提取液2450g。用与例4同样的方法对该猪肉粗提取液进行离子交换处理，得到来源于猪的粗肌肽精制液(离子交换处理)。
[0155]
使用来源于猪的粗肌肽精制液(肌肽1786mg、鹅肌肽116mg、鲸肌肽132mg)，与例4同样地进行吸附处理以及溶出处理。洗脱液按每400ml馏分回收，与例1同样地用hplc对肌肽、鹅肌肽以及鲸肌肽进行定量。分离例如图10所示。
[0156]
如图10所示，确认了肌肽首先溶出，然后鹅肌肽以及鲸肌肽溶出。由于各自的洗脱峰相互分离，因此推测通过在鹅肌肽以及鲸肌肽溶出前回收肌肽，能够得到肌肽比率高的洗脱液。
[0157]
将洗脱液以(鹅肌肽 鲸肌肽)/肌肽的质量比率超过1％为界分成2部分，作为前半部分及后半部分回收。各部分的hplc色谱图如图11所示，肌肽、鹅肌肽以及鲸肌肽的回收率以及组成比率如表5所示。
[0158]
[表5]
[0159]
[0160]
如图11以及表5所示，相对于负荷量的肌肽回收率，前半部分中为68重量％，后半部分中为32重量％。咪唑二肽的组成比例按重量％，前半部分为肌肽：鹅肌肽：鲸肌肽＝100：0：0，后半部分为肌肽：鹅肌肽：鲸肌肽＝76.0：11.7：12.3。
[0161]
因此，在前半部分中，能够得到咪唑二肽中含有95重量％以上肌肽的高肌肽含有物。
[0162]
产业上的可应用性
[0163]
本发明在饮食品、医药品、化妆品、保健品等领域有用，特别是在可以制造抗疲劳用组合物、抗氧化用组合物、抑制血糖值上升用组合物、改善认知功能用组合物或这些组合物的原料方面有用。
[0164]
相关申请的交叉引用
[0165]
本技术主张2020年4月30日申请的日本特愿第2020-080065号的优先权，其全部记载在此作为公开被引用。