一种油莎豆组培技术培养基配方及制作工艺的制作方法

1.本发明涉及油莎草培养，具体指一种油莎豆组培技术培养基配方及制作工艺。


背景技术：

2.油莎豆属莎草科莎草属一年生单子叶草本植物，又叫油莎草。其果实称为油莎豆，富含脂肪、淀粉、糖等多种成分。油莎豆生物量大，抗旱耐涝，耐贫瘠，经济价值和生态价值高。利用各种生物技术手段培育油莎豆优质新品种，合理有效地利用边际化土地种植油莎豆，不仅可以改善生态环境，还可以缓解粮食安全隐患。油莎豆被农业专家称为“油料之王”,出油率在20%～ 30%，油味醇香，久放不易变质，富含亚油酸和α不饱和脂肪酸，是良好的保健食用油。其饼粕除作优质饲料外，还可制取淀粉、制糖和酿酒等，地上植株是优质牧草。油莎豆种植后可以肥地改土，特别是在荒地、荒坡、幼林果园种植，可以抑制杂草、疏松土壤、抗旱保墒、提高果树成活率、防止水土流失，具有明显的生态效益。油莎豆适应性强、分蘖力强，投入少产出高，是综合利用前景广阔的经济作物。一般亩产在750kg以上，地上产青草3000～ 5 000kg或干草500kg。
3.油莎豆分蘖力极强，生长期内会从茎基部不断分生出新的植株，靠分蘖增加产量。油莎豆很少开花，即使开花也不能结种子，靠地下的块根进行繁殖。
4.我国油莎豆的遗传多样性很低，缺乏优良品种。油莎豆一般不开花不结实，因此利用常规杂交技术培育新品种比较困难，并且长期用块茎繁殖，易出现品种退化、遗传不稳定、品质下降、带菌严重等问题。通过组织及诱变技术可以实现种苗的规模化生产及优良品种的种质创新。目前，国内油莎豆培养基配方较少。组织培养的关键技术不仅在于培养基配方，其操作流程的细节把控对成苗率也影响较大。
5.油莎豆在茎尖培养中极易出现褐化现象。在植物组织培养过程中，由于要切开外植株，切口就会迅速变成暗褐色，同时这些褐色物质也会扩散到培养基中，导致培养基变成褐色，甚至会导致植株的死亡，这就是褐化现象。油莎豆是一种极易发生褐变的植物材料，在组织培养过程中褐变的机率很高，如何去克服和减少褐变的发生也是一项极其关键的技术。但是目前还未有如何解决油莎豆组培褐化的系统研究报告，这也是研究中急需填补的一个空白。
6.本发明是以油莎豆的无菌苗为供试材料，系统研究了不同植物生长调节剂对油莎豆丛芽增殖、愈伤诱导及分化和生根的影响，从而筛选出了最适合的培养基，为油莎豆的快速繁殖提供技术指导和理论基础，也为油莎豆的遗传转化和分子育种等研究奠定基础，选育出高产、品种优、抗逆性强的油莎豆品种。


技术实现要素：

7.针对上述目前油莎豆的遗传多样性很低，缺乏优良品种，一般不开花不结实，利用常规杂交技术培育新品种比较困难，且长期用块茎繁殖，易出现品种退化、遗传不稳定、品质下降、带菌严重等所存在的问题，本发明要解决的目的是提供一种油莎豆组培技术培养
基配方及制作工艺，这种工艺从培养基配方及操作流程进行详细说明，为高效繁育油莎豆种苗、种质资源优化提供技术支撑。
8.本发明通过如下方式实现：1.选种：选择没有虫口、病斑及硬伤，当年收获粒型饱满的油莎豆块茎。
9.2.配方成分、名称、比例；油莎豆丛生芽的诱导。以油莎豆无菌芽作为外植体，最佳的丛芽增殖培养基，为通过茎尖分化培养、增殖培养、生根培养三个培养步骤，实现组培苗扩繁生产，每一个培养步骤所用培养基配方不同，具体如下：
①
号培养基（茎尖分化培养）：ms 0.5～0.7mg/l6-ba 0.1～0.3mg/lnaa
②
号培养基（增殖培养）:ms 0.5～0.7mg/l6-ba
③
号培养基（生根培养）:ms 0.04～0.06mg/l6-ba 0.01～0.02mg/lnaa3.操作过程：3.1种子消毒处理：外植体的消毒是整个茎尖培养体系构建的第一步，同时也是至关重要的一步。如果消毒不彻底，外植体会在培养过程中因污染而死亡，不仅浪费实验材料还会对实验数据的统计造成干扰。挑选饱满油莎豆种子经
→
无菌水冲洗3～5次
→
500倍液多菌灵浸泡24h
→
无菌水冲洗3～5次
→
0.2%升汞浸泡30min
→
无菌水冲洗3～5次
→
灭菌湿纱布包裹置于培养皿中（湿度100%）
→
发芽箱中培养3～4d（环境温度保持在25～26
°
c）；可以获得比较好的消毒效果，同时能保证比较高的成苗率。
10.3.2茎尖培养：待芽长2～3mm取下嫩芽经
→
75%洒精处理30s
→
无菌水冲洗2～3次
→
0.1%升氯化汞处理15min
→
无菌水冲洗3～5次
→
0.1%升氯化汞处理15min
→
无菌水冲洗3～5次
→
置于灭菌滤纸上吸干芽表面水分
→
超净工作台中，解剖镜40倍数下剥出茎尖生长点（0.3～0.5mm）接种到
①
号培养基中
→
人工气候箱培养40～60d（培养温度26~28
°
c，湿度70%，光照强度2000lx,光照时长10～12h）
→
无毒组培苗。
[0011] 3.3增殖培养：将
①
号培养基中培养成功的组培苗（1～2cm）在无菌环境下移栽到
②
号培养基中
→
人工气候箱培养15～25d（培养温度28
°
c，湿度70%，光照强度2000lx,光照时长12h）
→
由1株分化为7～10株
→
无毒组培苗。
[0012]
3.4生根培养：将
②
号培养基中增殖培养后的组培苗（每瓶7～10株），在无菌环境下分栽到
③
号培养基中
→
人工气候箱培养7～10d（培养温度24～25
°
c，湿度70%，光照强度2000lx,光照时长12h）
→
获得油莎豆植株，完成油莎豆的组织培养。在所有的处理中，添加naa的培养基中，生根率偏低，但再生苗的根形态比较好，根系发达，多且粗壮。
[0013]
油莎豆的愈伤诱导及分化。优化的油莎豆愈伤诱导培养基为：ms 3.0～3.1mg/l2,4-d 1.0～1.1mg/lkt 0.5mg/l6-ba 0.5～0.6mg/lnaa 700～800mg/l酸水解酪蛋白 4g/lpvp 3～4%蔗糖和0.8～1.0%琼脂（ph=5.8），愈伤诱导率为53.23%；优化的愈伤分化培养基为：ms 2.0～2.1mg/l2,4-d 1.0～1.1mg/lkt 0.5～0.6mg/l6-ba 0.5～0.6mg/lnaa 700～800mg/l酸水解酪蛋白 4g/lpvp 3～4%蔗糖和0.8～1.0%琼脂（ph=5.8）。
[0014]
防止褐变方法，一，6-ba溶液预处理，将消毒后催好芽待剥离的油莎豆浸泡在20～35mg/l的6
‑ꢀ
ba溶液中3～5min;二，配制防褐变培养基，培养基中加入0.5～0.8�和10 ～
15mg/l硝酸银。
[0015]
通过现场试验和检测，本发明油莎豆组培技术培养基配方及制作工艺其优点在于油莎豆无菌苗，在以上不加任何植物生长调节剂的ms培养基上能诱导出根，生根率可达84%～87.10%，平均生根条数为2.0～2.05，移栽成活率可达93%～95.1%。组培苗移栽35天左右开始分蘖，地上部分基本停止生长，主要进行地下部分物质的积累。通过试验结果表明，e2处理组即在固体培养基中添加0.7%活性炭，抗褐化效果最好，褐化率较低，同时保证较高的茎尖分化率。愈伤诱导率为54.0%～56.1%；分化率为62.30%。减少褐变，产苗率高达90%～92%，扩繁倍数7～10倍。
[0016]
表油莎豆组培技术培养基配方实测统计表注：实测试验地块地址：内蒙古自治区呼伦贝尔市扎兰屯市河西回民村郑家沟试验基地。
具体实施方式
[0017]
本发明通过如下实施方式实现：1.选种：选择没有虫口、病斑及硬伤，当年收获粒型饱满的油莎豆块茎。
[0018]
2．配方成分、名称、比例；油莎豆丛生芽的诱导。以油莎豆无菌芽作为外植体，最佳的丛芽增殖培养基，为通过茎尖分化培养、增殖培养、生根培养三个培养步骤，实现组培苗扩繁生产，每一个培养步骤所用培养基配方不同，具体如下：
①
号培养基（茎尖分化培养）：ms 0.5～0.7mg/l6-ba 0.2～0.3mg/lnaa
②
号培养基（增殖培养）:ms 0.5～0.7mg/l6-ba
③
号培养基（生根培养）:ms 0.04～0.06mg/l6-ba 0.01～0.02mg/lnaa3.操作过程：3.1种子消毒处理：挑选粒型饱满的油莎豆种子经
→
无菌水冲洗3～5次
→
500倍液多菌灵浸泡24h
→
无菌水冲洗3～5次
→
0.2%升汞浸泡30min
→
无菌水冲洗3～5次
→
灭菌湿纱布包裹置于培养皿中（湿度100%）
→
发芽箱中培养3～4d（环境温度保持在25～26
°
c）；可以获得比较好的消毒效果，同时能保证比较高的成苗率。
[0019]
3.2茎尖培养：待芽长2～3mm取下嫩芽经
→
75%洒精处理30s
→
无菌水冲洗2～3次
→
0.1%升氯化汞处理15min
→
无菌水冲洗3～5次
→
0.1%升汞处理15min
→
无菌水冲洗3～5次
→
置于灭菌滤纸上吸干芽表面水分
→
超净工作台中，解剖镜40倍数下剥出茎尖生长点（0.3～0.5mm）接种到
①
号培养基中
→
人工气候箱培养40～60d（培养温度26~28
°
c，湿度70%，光照强度2000lx,光照时长10～12h）
→
无毒组培苗。
[0020]
3.3增殖培养：将
①
号培养基中培养成功的组培苗（1～2cm）在无菌环境下移栽到
②
号培养基中
→
人工气候箱培养15～25d（培养温度28
°
c，湿度70%，光照强度2000lx,光照
时长12h）
→
由1株分化为7～10株
→
无毒组培苗。
[0021]
3.4生根培养：将
②
号培养基中增殖培养后的组培苗（每瓶7～10株），在无菌环境下分栽到
③
号培养基中
→
人工气候箱培养7～10d（培养温度24～25
°
c，湿度70%，光照强度2000lx,光照时长12h）
→
获得油莎豆植株，完成油莎豆的组织培养。在所有的处理中，添加 naa 的培养基中，生根率偏低，但再生苗的根形态比较好，根系发达，多且粗壮。
[0022]
油莎豆的愈伤诱导及分化。优化的油莎豆愈伤诱导培养基为：ms 3.0～3.1 mg/l2,4-d 1.0 ～1.1mg/l kt 0.5 mg/l 6-ba 0.5 ～0.6mg/l naa 700～800 mg/l 酸水解酪蛋白 4g/l pvp 3～4% 蔗糖和 0.8～1.0% 琼脂（ph=5.8），愈伤诱导率为 53.23%；优化的愈伤分化培养基为：ms 2.0～2.1 mg/l 2,4-d 1.0～1.1 mg/l kt 0.5～0.6 mg/l 6-ba 0.5～0.6 mg/l naa 700～800 mg/l 酸水解酪蛋白 4 g/l pvp 3～4% 蔗糖和 0.8～1.0% 琼脂（ph=5.8）。
[0023]
防止褐变方法，一，6-ba溶液预处理，将消毒后催好芽待剥离的油莎豆浸泡在20～35mg/l的6
‑ꢀ
ba溶液中3～5min;二，配制防褐变培养基，培养基中加入0.5～0.8�和10 ～15mg/l硝酸银。