凝聚复合物的治疗性纳米粒子及其治疗细菌的用途的制作方法

凝聚复合物的治疗性纳米粒子及其治疗细菌的用途


背景技术：

1.细菌感染症的治疗因为细菌抗药性的出现而面临重大挑战。举例而言，具碳青霉烯抗药性(carbapenem-resistant)的鲍氏不动杆菌(acinetobacter baumannii)、绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)及肠杆菌科(enterobacteriaceae)菌，是严重危害人体健康的三种革兰氏阴性菌，相关叙述详见willyard,nature,2017,543,15。这些细菌会引发各种疾病，包括肺炎、菌血症、脑膜炎、尿道感染、皮肤感染、伤口感染，相关叙述详见bergogne-berezin et al.,clin.microbiol.rev.,1996,9,148-165及guzek et al., adv.exp.med.biol.,2017,955,39-46。
2.碳青霉烯为治疗致命细菌感染症时经常使用的最后一线药物，因此，当此种药物的疗效逐渐衰退，便促使研究人员着手针对特定菌种研发替代抗菌药物，相关叙述详见antachopoulos et al.,pediatr.infect.dis.j.,2017,36,905-907。在诸多替代药物当中，已有十年历史的抗菌剂的克痢霉素(colistin)受瞩目的程度与日俱增，因为其他药物抗革兰氏阴性菌的成效皆难望其项背，相关叙述详见montero et al.,the j.antimicrob. chemother.,2004,54,1085-1091。克痢霉素是一种多黏菌素药物(polymyxins)，由多价阳离子环状胜肽(polycationic cyclic peptide)混合而成，且可与细菌的细胞膜产生强大静电作用，因此具备强大的抗菌活性，相关叙述详见colom
é
et al.,int.j.pharm., 1993,90,59-71。克痢霉素被更广泛地作为抗菌剂使用于治疗多种药物抗药性的革兰氏阴性菌，然而，克痢霉素因所具有的肾毒性及神经毒性等副作用，而有危害健康之虞，相关叙述详见falagas et al.,expert rev.anti-infect.ther.,2018,6,593-600。
3.为提升克痢霉素的安全性，必须对其进行化学修饰及调剂。譬如克痢霉素前药及其衍生物是经由甲磺酸甲酯修饰，并以非阳离子残基取代胺基来合成。相关叙述详见 li et al.,journal of antimicrobial chemotherapy,2003,52,987-992；li et al.,j.antimicrob. chemother.,2004,53,837-840；vaara et al.,antimicrob.agents chemother.,2008,52,3229
‑ꢀ
3236；vaara et al.,j.antimicrob.chemother.,2013,68,636-639；及vaara et al.,peptides, 2010,31,2318-2321。虽然上述衍生物的电荷减少后可提升药物安全性，但却同时降低其抗菌力。
4.纳米粒子药物运输平台(如微脂体及聚合纳米粒子)被广泛开发来提升现有抗生素的疗效并减少其副作用。克痢霉素曾与许多纳米粒子平台共同调剂，包括量子点 (quantum dot)、微脂体、聚(乳酸-甘醇酸共聚物)粒子(poly(lactic-co-glycolic acid)
‑ꢀ
particles)、二氧化硅纳米粒子及聚(苯乙烯磺酸)粒子(poly(styrene sulphonate)particles)，相关叙述详见carrillo-carrion et al.,biosens.bioelectron.,2011,26,4368-4374；wallaceet al.,drug delivery and translational research,2012,2,284-292；wallace et al.,j.pharm. sci.,2012,101,3347-3359；shah et al.,pharm.res.,2014,31,3379-3389；gounani et al., int.j.pharm.,2018,537,148-161；insua et al.,eur.polym.j.,2017,87,478-486；及insuaet al.,sci.rep.,2017,7,9396。然而在许多情况中，与纳米载体搭配的克痢霉素展现较低的抗菌活性。
5.据此，有必要开发新纳米载体系统来运输抗生素，以改善抗生素疗效，并提高所期望的药物安全性。


技术实现要素：

6.本发明的一个方面是一种治疗性纳米粒子，其包含一阳离子多肽及一多阴离子分子。该阳离子多肽具备抗菌活性，与该多阴离子分子形成静电作用，且该治疗性纳米粒子的直径小于50纳米。令人意外的是，该治疗性纳米粒子可提升该阳离子多肽(即克痢霉素)的疗效，并改善其药物安全性。
7.一般而言，该阳离子多肽是一抗生素，其选自由克痢霉素、多黏菌素b及多黏菌素m组成的一群组。在一示例性的治疗性纳米粒子中，其包含作为阳离子多肽的克痢霉素。
8.另一方面，该多阴离子分子可为一阴离子多肽、阴离子寡核苷酸、阴离子多核苷酸或阴离子聚有机酸。举例而言，该多阴离子分子是一质体，其大小为少于10,000个碱基对(如少于6,000个碱基对、少于500个碱基对、少于20个碱基对)。在另一实例中，该多阴离子分子可为反义寡核苷酸。此外，该多阴离子分子亦可为包含聚乙二醇(peg)及阴离子多肽的二嵌段共聚物(diblock copolymer)。
9.值得一提的是，该治疗性纳米粒子可进一步包含双亲性稳定剂(amphiphilicstabilizer)。一般而言，该双亲性稳定剂为聚乙二醇脂质。聚乙二醇脂质的实例包括但不限于二硬脂酰基-sn-丙三醇-3-磷基乙醇胺-聚乙二醇(distearoyl-sn-glycero-3
‑ꢀ
phosphoethanolamine-polyethyleneglycol,dspe-peg)、dspe-peg-马来亚酰胺(dspe
‑ꢀ
peg-maleimide)、dspe-peg-生物素(dspe-peg-biotin)、甲氧基peg-胆固醇(mpeg
‑ꢀ
cholesterol)及胆固醇-peg-胺(cholesterol-peg-amine)。
10.上述治疗性纳米粒子一般包括阳离子多肽及多阴离子分子，其阳离子与阴离子的电荷比为1:4至7:1(如1:2、1:1、2:1及4:1)。
11.本发明的另一方面是一种医药组合物，其包含如前述的一治疗性纳米粒子，及一医药上可接受的载体。
12.本发明亦涵盖一种制备该治疗性纳米粒子的方法。该方法包括提供包含双亲性稳定剂的水溶液、将具有既定摩尔比率的阳离子多肽与多阴离子分子加入该水溶液中混合，及由所得混合物中获得一治疗性纳米粒子。
13.本发明涵盖的范围尚包括一种治疗革兰氏阳性菌的方法，该方法包括向有需要的受试者施予一有效量的上述治疗性纳米粒子。
14.本发明的内容将详述于下文。本发明的其他特征、目的及优点，在参照附图、多个具体实施例内容及所附权利要求后将会变得明显。
附图说明
15.图1a显示克痢霉素纳米粒子(cs nps)经冻干处理前与后的大小与界达电位 (zeta potential)(n＝3)；图1b显示cs nps中的克痢霉素a、克痢霉素b、dspe
‑ꢀ
peg及聚麸胺酸的包覆率(n＝3)；图1c显示cs nps于磷酸盐缓冲液(pbs)及5％胎牛血清(fbs)溶液于25℃下浸泡4天后的大小测量，插图放大显示胎牛血清蛋白及胎牛血清中克痢霉素纳米粒子的大小分布(n＝3)；图1d显示ph 7.4及ph 5下自cs nps释放的克痢霉素(cs)(n＝3)，误
差线代表平均值
±
标准偏差。
16.图2a为cs nps制备流程及cs nps结合表现绿色荧光蛋白(gfp)革兰氏阴性菌的示意图；图2b为荧光显微影像，其显示与alexa 647-cs nps共轭体共同培养的鲍氏不动杆菌；图2c为荧光显微影像，其显示与花菁染料(cy5)-cs nps共轭体共同培养的鲍氏不动杆菌，影像中的gfp在绿色通道中成像，而纳米粒子在红色通道中成像；图2d为荧光显微影像，其显示与cy5-cs nps共轭体共同培养的大肠杆菌，影像中的gfp于绿色通道中成像，而纳米粒子在红色通道中成像；图2e显示标准化gfp荧光讯号及表现gfp的鲍氏不动杆菌内的纳米粒子荧光讯号，讯号于使用荧光 cs nps治疗后1.5小时后测定；图2f显示标准化gfp荧光讯号及表现gfp的鲍氏不动杆菌内的纳米粒子荧光讯号，讯号于使用荧光cs nps治疗后24小时后测定。
17.图3a显示经静脉注射12.5mg/kg的cs或cs nps后小鼠的存活情形(n＝6)；图3b至图3m分别显示经pbs、cs或cs nps治疗后，血清中的天门冬胺酸胺基转移酶(aspartate transaminase,ast)、丙胺酸胺基转移酶(alanine transaminase,alt)、总蛋白(total protein,tp)、白蛋白(albumin,alb)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, alp)、肌酸酐(creatinine,crea)、尿素氮(blood urea nitrogen,bun)、磷(phosphorus, phos)、钙(calcium,ca)、总胆固醇(total cholesterol,t-cho)、葡萄糖(glucose, glu)、三酸甘油酯(triglyceride,tg)的浓度(虚线代表正常值，误差线代表平均值
±
标准偏差；n＝3)。
18.图4a为示意图，其绘示使用cs np对鲍氏不动杆菌肺炎的小鼠模型进行治疗以及治疗时程。图4b显示三组不同实验组小鼠(即分别接受5mg/kg cs、5mg/kg csnps的实验组，与接受pbs治疗的控制组)在注射治疗后的存活情形。
19.图5a为alexa 647荧光染剂-cs nps和alexa 488荧光染剂-cs nps共轭体制备流程及量化分析结果示意图，详细内容如实例2所述；图5b显示将细菌与荧光染剂
ꢀ‑
cs nps共轭体共同培养1.5及24小时后，菌体所含的alexa 647和alexa 488相对荧光强度(误差线代表平均值
±
标准偏差；n＝3)。
20.图6a为直方图，其绘示cs、实例1中的cs nps(1
st cs nps)及实例2中的csnps(2
nd cs nps)的最大耐受剂量(maximum tolerated dose，mtd)，测量条件分别为10mg/kg、12.5mg/kg、40mg/kg；图6b显示小鼠经静脉注射cs(10mg/kg、11 mg/kg、12mg/kg)、1
st cs nps(12.5mg/kg)及2
nd cs nps(40mg/kg、45mg/kg、50 mg/kg)后的存活情形。
21.图7a为示意图，其绘示使用cs np对受克雷伯氏肺炎菌nhri 1临床分离菌株感染的小鼠存活模型进行治疗以及治疗时程；图7b显示三组不同实验组小鼠在注射治疗后(即分别接受pbs、5mg/kg cs、5mg/kg cs nps治疗)的存活情形，使用对数-等级检定(log-rank test)进行测量及分析(n＝5-6)；图7c为示意图，其绘示使用cs np对受克雷伯氏肺炎菌nhri 1临床分离菌株感染的小鼠感染模型进行治疗以及治疗时程；图7d显示两组不同实验组小鼠(即分别接受5mg/kg cs、20mg/kg
ꢀꢀ
cs nps治疗的小鼠)的血液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏中的菌落形成单位(cfu) 的数量，使用单因子变异数分析进行测量及分析(误差线代表平均值
±
标准偏差；n ＝3)。
22.图8为荧光显微影像，其显示抗碳青霉烯克雷伯氏肺炎菌与cs-dna纳米粒子 (左图)或仅与dna(右图)共同培养后，以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino
‑ꢀ
2-phenylindole)染色。
23.图9为直方图，其显示大肠杆菌atcc25922与cs、反义寡核苷酸ftsz dna片段(aso
ftsz
)、cs aso
ftsz
、cs-aso
ftsz
共轭纳米粒子(cs-aso
ftsz nps)共同培养24 小时后的菌落形成情形。
具体实施方式
24.本文首先揭露一种治疗性纳米粒子，其意外提升抗生素(即克痢霉素)的疗效与药物安全性。
25.如前所述，本发明的治疗性纳米粒子包含一阳离子多肽及一多阴离子分子，其中该阳离子多肽具备抗菌活性，与该多阴离子分子形成静电作用。
26.该治疗性纳米粒子的直径小于50纳米，较佳为小于25纳米，更佳为小于15纳米。
27.该阳离子多肽的实例包括但不限于克痢霉素(即多黏菌素e)、多黏菌素b及多黏菌素m。
28.同样地，该多阴离子分子一般为阴离子多肽、阴离子寡核苷酸、阴离子多核苷酸或阴离子聚有机酸。
29.在一具体实施例中，该多阴离子分子为由麸胺酸组成的多胺酸(即聚麸胺酸 (pga))，或由天门冬胺酸组成的多胺酸(即聚天门冬胺酸(pld))。该多阴离子分子亦可为由一或多个麸胺酸或天门冬胺酸与一或多个其他种类的胺基酸(例丙胺酸、丝胺酸及酪胺酸)结合而成的聚合物。
30.在另一具体实施例中，该阴离子分子为单股或双股脱氧核醣核酸(dna)、核醣核酸或锁核酸。举例而言，该阴离子分子是大小为20mer的双股dna。在另一实例中，该阴离子分子是一质体，其大小为少于10,000个碱基对(如少于6,000个碱基对、少于500个碱基对、少于20个碱基对)。在又另一实例中，该多阴离子分子系反义寡核苷酸。
31.在又一具体实施例中，该多阴离子分子是包含聚乙二醇(peg)及阴离子多肽的二嵌段共聚物，其中该阴离子多肽可为由麸胺酸或天门冬胺酸组成的多胺酸。包含二嵌段共聚物的示例性治疗性纳米粒子是由克痢霉素及peg-聚天门冬胺酸(peg-pld) 组成。
32.如前所述，本发明的治疗性纳米粒子可进一步包含双亲性稳定剂，该双亲性稳定剂一般为聚乙二醇脂质。聚乙二醇脂质的实例包括但不限于dspe-mpeg、dspe-peg
‑ꢀ
马来亚酰胺、dspe-peg-生物素、mpeg-胆固醇及胆固醇-peg-胺。该等分子的结构如下所示。
33.[0034][0035]
值得一提的是，上述治疗性纳米粒子一般包括阳离子多肽及多阴离子分子，其阳离子与阴离子的电荷比为1:4至7:1，较佳为1:1至7:1。
[0036]
在一较佳具体实施例中，该治疗性纳米粒子进一步包含双亲性稳定剂，且直径小于15纳米，该阳离子多肽及多阴离子分子之阳离子与阴离子电荷比为1:4至7:1，且该多阴离子分子为阴离子多肽、阴离子寡核苷酸、阴离子多核苷酸或阴离子聚有机酸。
[0037]
本发明亦揭露一种医药组合物，其包含上述治疗性纳米粒子及一医药上可接受载体。
[0038]
该医药组合物中的载体须为“可接受的”；意思是，载体必须与组合物中的活性成分兼容(较佳地可使活性成分稳定)，且不得危害受试者。可使用一或多个溶解剂作为医药赋形剂，以运输活性醣苷化合物。其他载体的实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、十二烷基硫酸钠及d&c黄色10号染料。
[0039]
本发明亦涵盖一种制备该治疗性纳米粒子的方法。该方法包括以下步骤：(i)提供包含双亲性稳定剂的一水溶液；(ii)将具有既定摩尔比率的阳离子多肽及多阴离子分子加入该水溶液中混合；及(iii)由所得混合物中获得一治疗性纳米粒子。
[0040]
制备该治疗性纳米粒子时，阳离子多肽与多阴离子分子一般以1.6:1至518:1的摩尔比率混合。
[0041]
最后，本发明涵盖的范围尚包括一种治疗革兰氏阴性菌的方法，该方法包括向有需要的受试者(如患者)施予一有效量的上述治疗性纳米粒子。
fisher scientific(invitrogen,卡尔斯巴德，加利福尼亚)。甲氧基-聚乙二醇
ꢀ‑
嵌-聚(l-天门冬胺酸钠盐)(methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-aspartic acidsodium salt))[乙二醇重复单元数：n＝454(分子量＝20,000da)；重复单元数：x＝ 75(分子量＝10,500da)]购自alamanda polymers(阿拉巴马州亨茨维尔)。反义寡核苷酸自eurogentec(5
’→3’
)(cy5-mcmcmamu-tg-gtt-caa-a-mcmamuma,m_: 2'氧甲基碱基)合成。
[0050]
实例1：由克痢霉素、pga及dspe-peg2000组成的纳米粒子
[0051]
针对克痢霉素、pga及dspe-peg2000组成的治疗性纳米粒子进行制备、定性及测试实验，过程描述如下。
[0052]
为使阳离子cs及阴离子pga凝聚，首先将两者成分以不同摩尔比率混合，进行筛选试验。当cs:pga比例低于5:5时，未有相分离现象产生。当cs:pga比例高于6:4时，所得溶液开始变得混浊并出现液滴。当cs:pga比例提高至6:4至9:1时，液滴平均大小增为～300纳米至～20,000纳米，界达电位相应增为-20mv至2mv。当cs:pga比例介于0:10至6:4的间，或者9:1至10:0的间时，未有凝聚现象产生。确认cs及pga凝聚复合物产生后，即开始制备cs纳米粒子(cs nps)，此时cs:pga 的摩尔比率为6:4，因为混合物中产生的凝聚液滴最小，且界达电位为负值。
[0053]
按一般制备过程，将3.6mg cs及2.4mg pga加入含36mg dspe-peg2000的 7.2ml水中相混合。接着使用高压均质机nanolyzer-n2(gogene corporation；新竹县, 台湾省，中国)分散混合物，运作压力为5,000psi。使用30kda mwco超离心过滤机(merck millipore；科克郡，爱尔兰)过滤生成的纳米粒子，以去除游离态cs、pga或dspe-peg。
[0054]
接着分析该等纳米粒子的物理化学性质。动态光散射(dls)测量分析结果显示， cs nps的直径为8纳米、界达电位为-3mv，且经过冻干处理及加水还原后，cs nps 的大小或界达电位并无变化(见第1a图)。针对cs nps组成成分使用高效能液相层析仪(hplc)进行分析，结果显示克痢霉素a、克痢霉素b、dspe-peg及pga的包覆率分别为99.07、95.74、99.60及81.45(见第1b图)，即cs与纳米粒子结合效率相当高。
[0055]
另测定该等纳米粒子的稳定度。实验发现，纳米粒子在室温下置于pbs及10％ fbs溶液至少4天后，仍可维持稳定状态，大小不会变化(见第1c图)。
[0056]
将cs nps置于含50k mwco膜的透析管(pur-a-lyzer
tm maxi dialysis kit,sigma
‑ꢀ
aldrich)中，分别以0.15m磷酸盐缓冲液(ph 7.4)及0.15m乙酸缓冲溶液(ph 5.0) 针对释出的cs进行分析。磷酸盐缓冲液含16.48g/l na2hpo4及4.67g/l nah2po4，乙酸缓冲溶液含0.3％(v/v)乙酸及1.3％(w/v)乙酸钠。将各样品分别置入透析管，于 37℃下缓慢搅拌，并于既定时间点采集样品，使用hplc分析其中的cs成分。
[0057]
结果发现，游离态cs在透析开始后即可被快速透析，而cs nps则呈现持续释放状态，在24小时后，cs nps仍保有70％的cs成分(见第1d图)。在释放动力学方面，ph 7.4和ph 5.0的环境并未呈现显著差异。cs结构中的胺基所具有的pka约为10，而pga结构中的羧基所具有的pka约4.3，因此预期在ph 7.4及ph 5.0的环境下，前述两种分子仍会保有正负电荷。因此可预期的是，即使生理环境的酸度产生变化，复合物动力学并不会受到显著影响。
[0058]
cs nps的抗菌效力
[0059]
为测定cs nps的抗菌效力，实验针对5种参考菌株及39种抗碳青霉烯的鲍氏不动杆菌(a.baumannii)、绿脓杆菌(p.aeruginosa)、大肠杆菌(e.coli)、克雷伯氏肺炎菌
(k.pneumoniae)临床分离株进行cs nps最低抑菌浓度(mic)及最低杀菌浓度(mbc)试验。
[0060]
参考菌株购自美国菌种中心(atcc)。抗碳青霉烯的临床分离菌株取自中国台湾卫生研究院。mic定义为抑制细菌生长所需的最低浓度，mbc定义为灭菌所需的最低浓度。使用培养液微量稀释法(broth microdilution method)测定cs及cs nps的 mic。将细菌悬浮液的浊度调整至0.5
±
0.05mcfarland，并于不同cs或cs nps浓度下隔夜培养。无抗菌处理的控制组是作为对照之用。隔夜培养后，以目测方式判定溶液浊度。针对目测无浊度的培养孔内容物进一步继代培养，以测定其mbc。将清澈培养孔中的溶液置于琼脂培养盘上隔夜培养，以测定其mbc。
[0061]
如下表1所示，cs nps的mic及mbc整体上与cs相同。针对某些菌株，csnps的抗菌效力则出乎预期增至cs的2至4倍。值得注意的是，pga及peg并未呈现任何抑菌或杀菌效力，意即两者与cs nps活性提高无关。
[0062]
结果显示cs始终具有疗效，但在某些情况下，会因为搭配纳米粒子聚集体 (assembly)而意外提高疗效，形成另一种有效抑制抗碳青霉烯菌临床表现的方法。
[0063]
表1：cs及cs nps针对不同菌种的mic及mbc
[0064]
[0065][0066]
cs nps与菌种的结合
[0067]
实验进一步检验各菌种与cs nps的交互作用。
[0068]
简言之，制备荧光cs nps时，首先于水中以5:1的摩尔比率共同培养cs及alexafluor 647n-羟基琥珀酰亚胺基酯(n-hydroxysuccinimidyl(nhs)ester)48小时。共轭反应结束后，使用nanolyzer n-2将cs与pga及dspe-peg以分散方法混合，以形成纳米粒子聚集体，运作压力为5,000psi。再使用30kda mwco amicon超离心过滤机过滤所生成的纳米粒子，以去除未形成共轭体的荧光染剂。采集呈蓝色的滞留物，将含染剂标示的cs nps冻干并贮存于-80℃下。接着，将含荧光染剂标示的cs nps 粉末回溶于pbs中，并与表现gfp的鲍氏不动杆菌或大肠杆菌共同培养(见第2a 图)。共同培养90分钟或24小时后，使用pbs冲洗细菌，去除未与细菌结合的纳米粒子。将处理后所得的细菌利用4％多聚甲醛固定于涂覆有聚-l-离胺酸的玻片上，并使用共轭焦荧光显微镜(zeiss lsm 700)观察之。
[0069]
于cs nps的mic下处理90分钟后，以共轭焦荧光显微镜观察发现，细菌表面覆有荧光斑点(见第2b图)。同时观察到纳米粒子附于鲍氏不动杆菌(第2c图)及大肠杆菌(第2d图)上，显示革兰氏阴性菌与纳米粒子之间具亲和性。动力学实验将鲍氏不动杆菌与cs nps共同培养90分钟或24小时，结果发现培养时间越长，细菌携带的粒子荧光越多(第2e及2f图)。而当粒子荧光越多，gfp荧光也会随之减少。根据菌体外粒子与菌体内蛋白质成分的平衡情
形，显示菌体细胞壁的完整性已遭破坏。以上观察证明，纳米粒子能使cs维持活性。纳米粒子和细菌结合后，菌体上的膜会被破坏，进而抑制细菌生长。
[0070]
cs nps的药物安全性
[0071]
实验另比较cs nps及cs置于小鼠体内时的药物安全性。
[0072]
简言之，实验自台湾省biolasco co.,ltd(台北，台湾省，中国)取得8周龄 balb/c小鼠，并透过小鼠尾静脉注射将cs或cs nps注入小鼠体内，cs浓度分别为8、9、10、11、12、12.5及13mg/kg，藉此测定药物在单独使用与搭配纳米粒子使用时，对小鼠的最大耐受剂量(mtd)，可参考如li et al,international journal ofpharmaceutics,2016,515,20-29；及barnett et al.,british journal of pharmacology andchemotherapy,1964,23,552-574。能使实验中所有受试者持续存活的最高剂量，即定义为mtd。
[0073]
结果显示，cs nps及cs的mtd分别为12.5mg/kg及10mg/kg。当cs浓度达 12.5mg/kg时，会使小鼠颤抖、呼吸困难并于数分钟内死亡；相反地，无论cs nps浓度为何，小鼠皆能耐受(见第3a图)。
[0074]
为进一步比较cs和cs nps长期疗效，实验针对各含三只小鼠的不同组别，使用不同制剂(皆溶于pbs中)分别治疗7天后(静脉注射4mg/kg，每天两次)，再对各组进行综合血清生化检验(comprehensive serum chemistry)。将无菌pbs经尾静脉注射注入其中一组小鼠体内，该组即为负控制组。最后一次治疗结束后24小时，自小鼠身上采集0.5ml血液，进行综合代谢检查(comprehensive metabolic panel， cmp)的分析，并使用graphpad prism软件(graphpad software,圣地亚哥，加利福尼亚州)，以student's t检定及dunnett's多重比较分析检定进行数据分析。p值小于 0.05时具显著性。
[0075]
如第3b及3c图所示，相较于pbs控制组，经cs治疗组别的天门冬胺酸胺基转移酶(ast)及丙胺酸胺基转移酶(alt)浓度显著提升，ast及alt皆为肝脏损伤指标。此实验结果与先前研究报告的结论一致：报告指出，临床案例显示cs及cs 衍生物与肝脏毒性相关。可参考kalin et al.,infection,2014,42,37-42；katz et al.,med. ann.d.c.,1963,32,408-413；及falagas et al.,crit.care,2006,10,r27。相反地，相较于cs组，经cs nps治疗组别的alt及ast值较低。而在综合代谢检查中的其他参数(第3d至3m图)，cs及cs nps皆不会引发任何显著变化。以上结果显示，施予cs nps的安全性较高，而添加pga及dspe-peg不会引发任何预期之外的不良反应。值得注意的是，虽然研究报告指出cs会引发的副作用之一为肾脏毒性，但本实验并未观察到此一现象，且就肌酸酐(crea)及尿素氮(bun)浓度而言，pbs 组、cs组及cs nps组的结果皆相近。
[0076]
总之，以上结果显示纳米粒子聚集体意外提升了cs的mtd，且降低了肝脏毒性。
[0077]
cs nps的活体内(in vivo)抗菌活性
[0078]
实验进一步使用鲍氏不动杆菌肺炎的小鼠模型，测定cs nps的活体内抗菌活性。可参考yang et al.,antimicrobial agents and chemotherapy,2016,60,4047-4054。
[0079]
简言之，实验于37℃下、30ml lb培养液中震荡培养鲍氏不动杆菌atcc17978，使之达对数生长中期。接着，以4,000g离心该菌15分钟，形成菌体。将菌体置于pbs中回溶，并与由猪胃提取的5％黏液素(type 3；sigma-aldrich,台湾省，中国)相混合。
[0080]
为诱发鲍氏不动杆菌肺炎，实验首先抓取8周龄c57bl/6小鼠(中国台湾实验研究院实验动物中心)，以2％三溴乙醇(avertin；0.018ml/g)麻醉。接着以气管内注射方式，对
小鼠施予6.07x108cfu的鲍氏不动杆菌atcc 17978以诱发肺炎(见第4a图)。在接种后2小时，透过静脉注射方式以pbs(控制组)、cs或cs nps治疗小鼠，剂量为5mg/kg，每天注射两次。
[0081]
透过存活分析比较cs及cs nps的疗效。使用graphpad prism，以对数-等级检定分析各组的存活差异。待诱发感染后36小时观察cs及cs nps疗效；两组实验组皆未有小鼠死亡，而控制组则有37.5％小鼠死亡。观察72小时后发现cs nps的疗效与cs相近(p＝0.67)，而各含8只受试小鼠的两组实验组中，分别有3只与4只小鼠存活(见第4b图)。存活分析的结果显示，cs搭配纳米粒子聚集体后仍保有抗菌活性。
[0082]
上述结果显示，本发明的cs nps意外具有治疗抗药性细菌的效果，且符合预期的药物安全性。
[0083]
实例2：由cs、pga及dspe-peg5000组成的纳米粒子
[0084]
针对cs、pga及dspe-peg5000(分子量5000)组成的治疗性纳米粒子进行制备、定性及测试实验。
[0085]
根据实例1描述的流程进行调整以制备治疗性纳米粒子，调整方式如下所述。具体而言，将cs:pga的摩尔比率调整为6:7(w/w)，并将纳米粒子稳定于1.5％dspe
‑ꢀ
peg5000中。此外，实验使用剂量更高的pga及具更高分子量的peg，以提升csnps的稳定性。
[0086]
按一般制备过程，将6mg cs和7mg pga加入含180mg dspe-peg5000的12 ml水中相混合。接着使用高压均质机分散混合物，并过滤生成的纳米粒子。使用动态光散射分析过滤后纳米粒子的大小及界达电位，接着将纳米粒子冻干并贮存于
‑ꢀ
80℃下。所有实验皆使用pbs回溶冻干的cs nps。动态光散射分析显示，该等纳米粒子的直径为12.5纳米、界达电位为-5mv，且经冻干及回溶处理后呈稳定态(见表2)。
[0087]
表2中的“z-ave”是指累积量平均值，而“pdi”则指多分散指数(polydispersityindex)。
[0088]
表2：经动态光散射分析测得的cs nps物理化学性质
[0089][0090]
hplc量化分析显示，cs nps对于克痢霉素a及克痢霉素b具高包覆率 (encapsulation efficiency,ee％)(见表3)。
[0091]
表3：经hplc测定的cs nps对cs的包覆率
[0092]
cs nps克痢霉素a克痢霉素bpegee％99.1
±
4.498.9
±
3.094.6
±
3.6
[0093]
cs、pga及dspe-peg5000组成的纳米粒子的抗菌效力
[0094]
为测定本实验cs nps的抗菌效力，实验按实例1中所述的流程针对5种参考菌株及20种抗碳青霉烯的鲍氏不动杆菌(a.baumannii)、大肠杆菌(e.coli)、克雷伯氏肺炎菌
(k.pneumoniae)、绿脓杆菌(p.aeruginosa)临床分离株进行mic及mbc 试验。参考菌株购自atcc。抗碳青霉烯的临床分离菌株取自中国台湾卫生研究院。
[0095]
如表4所示，较实例1添加更多聚合物时，并不影响生成的cs nps的抗菌活性，而cs nps的抗菌活性亦与cs不相上下。值得注意的是，pga及dspe-peg未表现出任何抑菌或杀菌效力，意即两者与cs nps活性提高无关。
[0096]
表4：cs及cs nps对不同细菌的mic及mbc
[0097][0098][0099]
检验cs nps与菌种的结合
[0100]
实验检验各菌种与cs nps的交互作用，实例2的cs nps较实例1包含更多聚合物(见第5a图)。
[0101]
为制备与荧光染剂共轭的cs，于0.1m碳酸氢钠缓冲液中以5:1的摩尔比率共同培养cs及alexa fluor 647nhs 72小时。至于制备与荧光染剂共轭的pga时，则于0.1m碳酸氢钠缓冲液中以1:7.5的摩尔比率共同培养pga及alexa fluor 488nhs 酯72小时。荧光共轭反应结束后，于包含dspe-peg的水中混合cs及pga，再以 nanolyzer n-2分散混合物，运作压力为5,000psi。接着使用30kda mwco amicon 超离心过滤机过滤所生成的荧光纳米粒子，以去除未形成共轭体的荧光染剂。采集荧光滞留物，并将荧光纳米粒子冻干并贮存于-80℃下。
[0102]
将经隔夜培养的大肠杆菌atcc 25922于4℃下以10,000x g离心10分钟，形成片状沉淀物。将沉淀物置于pbs中回溶，再将细菌回溶液与荧光cs或荧光cs nps 于37℃下共同
培养，另制备不含cs或cs np的细菌回溶液作为负控制组。将荧光cs或荧光cs nps与细菌共同培养1.5及24小时后，使用pbs冲洗细菌。将所取得的样品冻干，并置于1％十二烷基硫酸钠(sigma-aldrich)(w/v)中回溶。使用微量盘荧光分析仪(tecan infinite m1000,奥地利austria)测量回溶液中的cs成分。
[0103]
共同培养24小时后，alexa 647及488的荧光强度增加，显示cs nps中的cs 快速与细菌产生交互作用(见第5b图)。换言之，多添加的聚合物并未影响cs nps 与细菌结合的功能。
[0104]
测定cs nps的mtd
[0105]
使用小鼠进行药物增量实验，以测定cs nps的mtd。
[0106]
实验自台湾省biolasco co.,ltd(台北，台湾省，中国)取得8周龄balb/c 小鼠，并透过小鼠尾静脉注射将cs或cs nps注入小鼠体内，以测定老鼠对纳米粒子的mtd，cs base浓度分别为25、40、45及50mg/kg(n＝10)。能使实验中所有受试者持续存活的最高剂量，即定义为mtd。
[0107]
如第6图所示，本实验的cs nps所表现的mtd为40mg/kg，较实例1中的cs 高3倍、cs nps高2倍(见第6图)。当mtd提高，治疗临床抗药性分离株时可投予的药物剂量即随之提高。
[0108]
使用cs np治疗感染克雷伯氏肺炎菌的小鼠存活模型
[0109]
使用克雷伯氏肺炎菌的小鼠感染模型，测定cs nps的活体内抗菌活性(见第7a 图)。
[0110]
自台湾省biolasco co.,ltd(台北，台湾省，中国)取得10周龄、20-22g的 balb/c小鼠。感染前3天及前1天，以腹膜内注射方式对小鼠分别注射150mg/kg及 100mg/kg的环磷酰胺，以诱发嗜中性白血球低下症。实验于37℃下、60ml mh培养基中震荡培养克雷伯氏肺炎菌nhri 1临床分离菌株2.5小时，震荡速度为150rpm (回转式震荡器,yihder ts-580)，使之达对数生长中期。接着，于4℃下以10,000x g离心该菌10分钟，形成片状沉淀物。将沉淀物置于pbs中回溶，为诱发腹腔内克雷伯氏肺炎菌感染且使细菌达致命剂量，以腹腔内注射方式对每只小鼠施予50μl、浓度1.5x108cfu的克雷伯氏肺炎菌。在接种后5小时，以5mg/kg cs(50％mtd)、 20mg/kg cs nps(50％mtd)或pbs(控制组)治疗感染小鼠。
[0111]
结果发现，cs nps形成的高剂量药物疗法使小鼠存活率自0％提升至50％，而 cs则未改善感染小鼠的存活率(见第7b图)。
[0112]
使用cs np治疗感染克雷伯氏肺炎菌的小鼠感染模型
[0113]
为比较cs及cs nps的疗效，进一步于非致命细菌挑战实验(non-lethal bacterialchallenge)中进行细菌计数试验(见第7c图)。
[0114]
自台湾省biolasco co.,ltd(台北，台湾省，中国)取得10周龄、20-22g的 balb/c小鼠，每组3只。感染前3天及前1天，以腹膜内注射方式对小鼠分别注射 150mg/kg及100mg/kg的环磷酰胺，以诱发嗜中性白血球低下症。实验于37℃下、 60ml mh培养基(mueller hinton broth)中震荡培养克雷伯氏肺炎菌nhri 1临床分离菌株2.5小时，震荡速度为150rpm(回转式震荡器,yihder ts-580)，使之达对数生长中期。接着，于4℃下以10,000x g离心10分钟，形成片状沉淀物。将沉淀物置于pbs中回溶，为诱发腹腔内克雷伯氏肺炎菌感染，以腹腔内注射方式对每只小鼠施予50ml、浓度8.4x107cfu的克雷伯氏肺炎菌。于接种后2小时及7小时，以 5mg/kg cs或20mg/kg cs nps透过静脉内注射治疗被感染的小鼠。接种
后24小时牺牲小鼠，并采集其组织进行细菌计数。观察组织中的细菌cfu数值，比较两种药物的疗效。
[0115]
自接受50％mtd cs或cs nps疗法的小鼠体内摘取器官，并计算器官内菌数后发现，在经cs nps治疗的组别中血液和心脏内的菌数以2-log幅度下降(见第7d 图)。
[0116]
结果显示，本发明的cs nps相较于cs意外表现出更佳的药物安全性，且不影响抗菌活性。
[0117]
实例3：由cs、寡核苷酸及dspe-peg5000组成的纳米粒子
[0118]
针对cs、寡核苷酸及dspe-peg5000组成的治疗性纳米粒子进行制备、定性及测试实验，过程描述如下。
[0119]
使用带荧光的20mer双股dna作为寡核苷酸。制备带荧光的20mer双股dna 时，将带有荧光素酰胺(fluorescein amidite，fam)((5
’‑
/56-fam/tt ggc tac gtccag gag cgc-3’)的单股寡核苷酸与无荧光染剂的另一正向单股寡核苷酸相混合，再于94℃下与反向单股寡核苷酸黏合，并缓缓冷却之。制备含cs及寡核苷酸 (cs/dna nps)的纳米粒子时，将cs与寡核苷酸以6:7(w:w)的比例相混合，并稳定于1.5％的dspe-peg5000中。
[0120]
按一般制备过程，将6mg cs和7mg寡核苷酸加入含1.5％dspe-peg5000的 12ml水中相混合。接着使用nanolyzer n-2分散混合物，运作压力为5,000psi，并使用30kda mwco amicon超离心过滤机过滤生成的纳米粒子，以去除处于游离态的cs、寡核苷酸及dspe-peg5000。观察荧光滞留物，以确认cs/dna nps确实制备成功，此结果代表含荧光标记的dna未被尺寸大小过滤器筛除。采集黄色荧光滞留物，并将cs/dna纳米粒子冻干且贮存于-80℃下。动态光散射分析显示，该等纳米粒子的直径为10.75纳米、具有微负值的界达电位，且经冻干后呈稳定态(见表5)。
[0121]
关于“z-ave”及“pdi”的定义，详见实例2中的说明。
[0122]
表5：经动态光散射分析测得的cs/dna nps物理化学性质
[0123][0124][0125]
为观察各菌种与cs-dna nps的交互作用，将纳米粒子回溶于pbs中，并与抗碳青霉烯的克雷伯氏肺炎菌共同培养。将游离dna与细菌共同培养作为对照组。经 3小时培养后，使用pbs冲洗细菌，去除未与细菌结合的纳米粒子。将处理后所得的细菌利用4％多聚甲醛固定于涂覆有聚-l-离胺酸的玻片上，并使用共轭焦荧光显微镜 (zeiss lsm 700)观察之。实验结果显示，cs-dnanps使大量dna进入细菌体中；反之，在控制组中的细菌仅含有少量dna(见第8图)。
[0126]
为证明具疗效的寡核苷酸(如反义寡核苷酸(asos))可并入cs nps以增强抗菌的疗效，本实验制备含asos ftsz dna片段(aso
ftsz
)的cs nps并进行测定，因为阻断aso
ftsz
可
抑制原核生物的细胞增生。当asos成功接触到原核生物的ftsz基因，即可阻断该基因并抑制菌落生成。
[0127]
本实验合成以花菁染料标记的aso
ftsz
(cy5-aso
ftsz
)，并利用该cy5-aso
ftsz
与 alexa 488-cs共轭体(alexa488-cs)形成凝聚复合物，以制备纳米粒子。使用微量盘分析仪(tecan infinite m1000 pro)测量alexa488-cs及cy5-aso
ftsz
的包覆率，结果分别为89.5％及71.13％。
[0128]
针对大肠杆菌atcc 25922测定alexa488-cs及双荧光染剂标记的cs nps(cs
‑ꢀ
aso
ftsz nps)的mic及mbc。结果显示，并入aso
ftsz
后未影响cs的mic及mbc (见表6)。此外，在浓度1μg/ml时(即低于cs的mic)，cs-aso
ftsz nps表现出协同抗菌效果(见第9图)。
[0129]
表6：各治疗药物针对e.coli atcc 25922的mic及mbc
[0130][0131][0132]
为观察各菌种与cs-aso
ftsz nps的交互作用，将纳米粒子回溶于pbs中，并与大肠杆菌atcc 25922共同培养。经2小时培养后，使用pbs冲洗细菌，去除未与细菌结合的纳米粒子。将处理后所得的细菌利用4％多聚甲醛固定于涂覆有聚-l-离胺酸的玻片上，并使用共轭焦荧光显微镜(inverted confocal plus super resolutionmicroscope；lsm 780 elyra)观察之。
[0133]
细菌与cs-aso
ftsz nps或游离态cs/游离态aso
ftsz
混合物共同培养后，cs及 aso
ftsz
的分布位置呈现显著差异。具体而言，细菌与游离态cs及游离态aso
ftsz
共同培养后，会使cs及aso
ftsz
落在细菌体边缘上，而与纳米粒子共同培养后，则会使 cs及aso
ftsz
分布在整个细菌体上。当cs-aso
ftsz nps成功将aso
ftsz
输入细菌体内，亦会提高dna含量，由4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)染色区域增加即可证明。
[0134]
结果显示，asos可作为用来制备cs np的生物聚合物，且cs nps可使asos 更容易输入细菌体内。此外，将治疗用aso与cs耦合成为纳米粒子即可形成协同作用。而就aso
ftsz
而言，一旦aso
ftsz
成功输入细菌体内，便会影响内部细胞分化，使细菌dna累积更多。
[0135]
实例4：由cs及甲氧基-聚乙二醇-嵌-聚(l-天门冬胺酸钠盐)(methoxy
‑ꢀ
poly(ethylene glycol)-block-poly(l-aspartic acid sodium salt),mpeg
20k-b-pld
75
)组成的纳米粒子
[0136]
亦可使用cs及二嵌段共聚物(即mpeg
20k-b-pld
75
)制备cs nps。二嵌段共聚物与cs的比例为2:3(w/w)。简言之，将克痢霉素及二嵌段共聚物以2:3(w/w)的比例相混合形成凝聚复合物，再使用nanolyzer n-2进一步分散该复合物，运作压力为5,000psi。使用30kda mwco amicon超离心过滤机过滤生成的纳米粒子，以去除处于游离态的cs及共聚物。将采集到的纳米粒子冻干并贮存于-80℃下。
[0137]
动态光散射分析显示，生成的纳米粒子(即cs/mpeg
20k-b-pld
75 nps)的大小约为60
纳米，且经冻干后呈稳定态，大小及界达电位皆维持恒定，如表7所示。
[0138]
同样地，关于“z-ave”及“pdi”的定义，详见实例2中的说明。
[0139]
表7：经动态光散射分析测得的cs/mpeg20k-b-pld75 nps物理化学性质
[0140][0141][0142]
制备纳米粒子时，cs的包覆率相当高，根据hplc的分析结果，克痢霉素a及克痢霉素b的包覆率分别达97.6％及64.2％。经冷冻电子显微镜观察发现，此配方可形成大小约10纳米的纳米粒子。而在动态光散射分析下，亦发现数个造成测量偏差的大型纳米粒子(见表7)。本实验纳米粒子的mtd为17.5mg/kg，显见其药物安全性较cs(mtd＝10mg/kg)高。
[0143]
[其他具体实施例]
[0144]
本文揭露的所有特征可结合为任何组合。本文揭露的各项特征，可由其他具备同样、对等或类似目的的特征代换。因此，除非另有说明，本文揭露的各项特征仅为一系列对等或类似的基本特征的范例。
[0145]
又，根据以上说明，本发明所属技术领域中具通常知识者可明确掌握本发明的主要特征，且在不背离本发明的精神及申请专利范围的情形下，可对本发明进行各种变化及修饰，以使本发明满足特定用途及条件。因此，其他具体实施例亦涵盖于本发明申请专利范围之中。