含硼酸、亚硝酸盐的抗病原微生物组合物及应用的制作方法

1.本发明属于制药领域，涉及一种含硼酸、亚硝酸盐的抗病原微生物组合物及制备和应用。


背景技术：

2.病原微生物如病毒、细菌、真菌等侵入人体后会形成感染、发病导致如肺炎、疣、溃疡、疱疹、癣病、痤疮、结膜炎、手足口病、湿疹等疾病，不及时干预和防治会加剧感染扩散，对个人健康和社会公共卫生安全造成极大危害。通常采用酒精和84消毒液等进行外部环境消杀来阻断病原微生物的感染和传播。而针对上述病原微生物所引起的相应疾病治疗，临床上最重要的手段是使用特定的抗病毒药物或抗生素药物控制感染，但长期反复使用这类抗病原微生物剂极易诱发耐药性，这些耐药病原微生物可进一步获得多重抗药性，也是引起致命微生物感染的主要原因。过去解决病原微生物耐药性的主要手段是改进原有抗生素/抗病毒药物或发掘新抗生素/新抗病毒药物，但取得的成果远无法满足临床的需求，且新抗生素/ 新抗病毒药物同样面临病原微生物耐药性的问题。此外，大部分感染性疾病是由多种病原微生物引起的，如病毒感染合并细菌、真菌等病原微生物感染是临床上常见的并发症，仅针对一种病原微生物即一种感染源的治疗方案往往效果有限。因此亟需开发非抗生素类、高效的、广谱的抗多种病原微生物剂用于治疗和预防感染性疾病。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种含硼酸、亚硝酸盐的抗病原微生物组合物，所述组合物由第一组分和第二组分组成，第一组分由0.02～10.0w％的硼酸和90.0～ 99.98w％的赋形剂组成；第二组分由0.02～8.0w％的亚硝酸盐和92.0～99.98w％的赋形剂组成。
4.作为优选，上述亚硝酸盐为亚硝酸钠、亚硝酸钾中的一种或多种。
5.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含0.02～8.0w％的硼酸，第二组分中包含0.02～6.0w％的亚硝酸盐。
6.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含0.1～6.0w％的硼酸，第二组分中包含0.02～4.0w％的亚硝酸盐。
7.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含0.2～4.0w％的硼酸，第二组分中包含0.1～4.0w％的亚硝酸盐。
8.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含0.5～4.0w％的硼酸，第二组分中包含0.4～4.0w％的亚硝酸盐。
9.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含6.0w％的硼酸，第二组分中包含3.0w％的亚硝酸盐。
10.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含4.0w％的硼酸，第二组分中包含1.0w％的亚硝酸盐。
11.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含4.0w％的硼酸，第二组分中包含0.9w％的亚硝酸盐。
12.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物中，第一组分中包含3.0w％的硼酸，第二组分中包含6.0w％的亚硝酸盐。
13.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物中，第一组分中包含3.0w％的硼酸，第二组分中包含4.0w％的亚硝酸盐。
14.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含2.0w％的硼酸，第二组分中包含2.0w％的亚硝酸盐。
15.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含2.0w％的硼酸，第二组分中包含1.0w％的亚硝酸盐。
16.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含2.0w％的硼酸，第二组分中包含0.4w％的亚硝酸盐。
17.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含2.0w％的硼酸，第二组分中包含0.1w％的亚硝酸盐。
18.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含2.0w％的硼酸，第二组分中包含0.02w％的亚硝酸盐。
19.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含0.2w％的硼酸，第二组分中包含0.02w％的亚硝酸盐。
20.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含0.1w％的硼酸，第二组分中包含0.02w％的亚硝酸盐。
21.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物的第一组分中包含0.02w％的硼酸，第二组分中包含0.02w％的亚硝酸盐。
22.进一步优选，本发明的抗病原微生物组合物中的第一组分中包含0.5w％的硼酸，第二组分中包含0.5w％的亚硝酸盐。
23.本发明的抗病原微生物组合物中包含的赋形剂，包括但不限于溶剂、稀释剂、湿润剂、抗氧化剂、螯合剂、乳化剂、防腐剂、抗菌剂、遮光剂、着色剂、凝胶剂、调味剂、ph 调节剂、增稠剂以及其他适用的油性物质、水性物质中的一种或多种。
24.本发明的抗病原微生物组合物中的赋形剂包含粘度增稠剂，以组合物的0.3～0.6w％的量存在于组合物中。
25.所述粘度增稠剂包含一种或多种，包括但不限于聚丙烯酸聚合物，如聚丙烯酸、聚丙烯酸酯聚合物；纤维素醚，如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素及羧甲基纤维素钠盐；甲基乙烯基醚和马来酸酐的共聚物；卡波姆；树胶，如海藻酸钠、黄原胶或壳聚糖。
26.本发明的抗病原微生物组合物中的赋形剂包含湿润剂以组合物的10w％～30w％的量存在于组合物中。
27.所述湿润剂包含一种或多种，包括但不限于甘油或丙二醇。
28.本发明的抗病原微生物组合物中的赋形剂包含防腐剂以组合物的0.1w％的量存在于组合物中。
29.所述防腐剂包含一种或多种，包括但不限于山梨酸、苯甲酸或尼泊金乙酯。
30.本发明的抗病原微生物组合物中的赋形剂包含ph调节剂以第一组分的0.12～0.9w％的量存在于组合物中。
31.所述ph调节剂包含一种或多种，包括但不限于磷酸二氢钠、抗坏血酸、水杨酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、各种缓冲盐，其中缓冲盐如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。
32.本发明的抗病原微生物组合物中的赋形剂包含溶剂以大于组合物的50w％的量存在于组合物中。
33.所述溶剂包含一种或多种，包括但不限于生理盐水、灭菌水。
34.本发明的抗病原微生物组合物由第一组分和第二组分混合后制备得到。
35.本发明的抗病原微生物组合物包含1份第一组分和1份第二组分。
36.本发明的另一个目的是提供所述抗病原微生物组合物在制备治疗和/或预防病毒、细菌和/或真菌感染的外用药物中的应用。
37.所述的病毒、细菌和/或真菌感染包括但不限于由流感、禽流感、人乳头瘤病毒、冠状病毒、带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、肠道病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、鼻病毒、诺如病毒、麻疹病毒、传染性软疣病毒、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、痤疮丙酸杆菌、大肠杆菌、酵母菌、白色念珠菌、红色毛癣菌、沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌及其任何组合引起的感染。
38.本发明所述外用药物的制剂形式包括但不限于水剂、乳膏剂、软膏剂、乳剂、凝胶剂、外用液剂、糊剂、擦剂、外用散剂、气雾剂及经皮吸收剂。
39.上述剂型记载于作为公知于所有制药化学的处方书的文献(remington'spharmaceutical science，15th edition，1975.mack publishing company，easton，pennsylvania， 18042，chapter 87：blaug，seymour)中。这些剂型的原理、分类、制备以及非活性成分的组成，对于剂型领域的专家来说是显而易见的，其包含于本发明中。
40.本发明具有的有益效果为：本发明的组合物为非抗生素类，其活性成分分别包含硼酸及亚硝酸盐，其中所述组合表现出抗病毒、细菌、真菌等病原微生物具有协同作用，从而致使所述病原微生物的根除，同时可用于多种病原微生物引起的疾病预防和治疗。本发明提供一种广谱的抗病原微生物的组合物及其制备方法，可抑制包括病毒、细菌和真菌等在内的多种病原微生物的生长和/或根除，以预防和/或治疗感染性疾病。
附图说明
41.图1.硼酸抗流感病毒的活性。
42.图2.含硼酸不同组合物的抗流感病毒活性。
43.图3.硼酸与不同浓度亚硝酸钠组合的抗流感病毒活性。
44.图4.含硼酸、亚硝酸钠组合物的水剂抗细菌活性。
45.图5.含硼酸、亚硝酸钠组合物的水剂抗真菌活性。
46.图6.含硼酸、亚硝酸钠组合物的凝胶抗流感病毒活性。
47.图7.含硼酸、亚硝酸钠组合物的凝胶抗单纯疱疹病毒活性。
具体实施方式
48.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本发明未述及之处适用于现
有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。
49.实施例1：硼酸抗流感病毒的活性使用a/wsn/33流感病毒株，tcid
50
检测法来评价不同浓度硼酸的抗病毒活性，生理盐水作为空白对照。抗病毒活性测试实验操作：用生理盐水配制不同硼酸溶液(直接与病毒样品混合，没有进行1:1体积稀释)以及空白对照组(生理盐水)，上述样品/空白对照组与甲型流感病毒以体积比9:1混合，在25℃下孵育20min后，加入中止液(1:10)稀释，保存在-80℃。取样品与病毒的混合液，用培养基稀释20倍及倍系列稀释，后取检测液100μl，接种于单层细胞培养板上，每个滴度接种6孔，在培养箱中培养3天，记录细胞病变情况，即可得到病毒滴度tcid
50
；计算样品组与空白对照组的tcid
50
差值δlg＝tcid
50
(样品组-空白对照组)。δlg值越大说明抗病毒活性越强。a:0＜δlg《1；b:1≤δlg《3；c:3≤δlg《5.5；d:5.5≤δlg。
50.表1单独硼酸的抗流感病毒活性测试样品抗流感病毒活性(δlg)生理盐水00.05％硼酸溶液00.1％硼酸溶液00.5％硼酸溶液a1.0％硼酸溶液b1.5％硼酸溶液c2％硼酸溶液d3％硼酸溶液d4％硼酸溶液d5％硼酸溶液d
51.结果如表1所示，单独使用硼酸时，观察到剂量依赖性疗效，当终浓度为0.5％时表现出较弱的流感病毒抑制活性，当终浓度大于等于1.5％时表现出显著地抗流感病毒活性， tcid
50
相比于生理盐水组下降了10
5.5
倍以上。
52.实施例2：含硼酸不同组合物的抗流感病毒活性使用a/wsn/33流感病毒株，tcid
50
检测法来评价不同组合物对硼酸的抗病毒活性影响，生理盐水作为空白对照。在该测试中，选择氯化钠、氯化锌、硫酸铜、亚硝酸钠进行组合研究，组合物两个组分以体积比1:1混合。实验操作参考实施例1，a:0＜δlg《1；b:1≤δlg《3； c:3≤δlg《5.5；d:5.5≤δlg。
53.表2.含硼酸不同组合物的抗流感病毒活性测试物质抗流感病毒活性(δlg)生理盐水01％硼酸(单独)b组合物1:2％硼酸 0.4％氯化钠b组合物2：2％硼酸 0.4％氯化锌c组合物3:2％硼酸 0.4％硫酸铜c
组合物4：2％硼酸 0.4％亚硝酸钠d组合物5：2％硼酸 0.4％亚硝酸钾d
54.结果如表2所示，单独使用1％硼酸时表现出一定的抑制病毒活性(1≤δlg《3)，当与氯化钠组合时(组合物1)，组合物1的抗病毒活性没有差异。但当与氯化锌组合(组合物2) 或硫酸铜组合(组合物3)时，组合物2和3中的流感病毒滴度显著下降，抗流感病毒活性优于单独硼酸组。更重要的是当硼酸与亚硝酸盐组合(组合物4和组合物5)时，组合物4～5 的抗流感病毒活性显著优于组合物2、组合物3或者单独硼酸组。
55.实施例3：硼酸与不同浓度亚硝酸钠组合的抗流感病毒活性使用a/wsn/33流感病毒株，tcid
50
检测法来评价硼酸与不同浓度亚硝酸钠组合的抗病毒活性，生理盐水作为空白对照，组合物两个组分以体积比1:1混合。实验操作参考实施例1， a:0＜δlg《1；b:1≤δlg《3；c:3≤δlg《5.5；d:5.5≤δlg。
56.表3.硼酸与不同浓度亚硝酸钠组合的抗流感病毒活性测试物质抗流感病毒活性(δlg)生理盐水01％硼酸b0.2％亚硝酸钠0组合物4：2％硼酸 0.4％亚硝酸钠d0.05％亚硝酸钠0组合物6：2％硼酸 0.1％亚硝酸钠d组合物7：2％硼酸 0.1％亚硝酸钾d0.01％亚硝酸钠0组合物8：2％硼酸 0.02％亚硝酸钠d组合物9：0.2％硼酸 0.02％亚硝酸钠d组合物10：0.1％硼酸 0.02％亚硝酸钠d组合物11：0.02％硼酸 0.02％亚硝酸钠d
57.结果如表3所示，单独使用不同浓度(0.01％～0.2％)的亚硝酸钠没有抗流感病毒活性，当硼酸和不同浓度(0.02％～0.4％)的亚硝酸钠1:1组合时，组合物中的流感病毒滴度显著下降，组合物的抗流感病毒活性优于单独使用1％硼酸组。
58.实施例4：含硼酸、亚硝酸钠组合物的水剂抗细菌活性使用金黄色葡萄球菌(atcc6538，北纳创联生物科技有限公司提供，培养第3代)和大肠杆菌(8099,广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心提供，培养第3代)，悬液定量杀菌方法来评价硼酸与亚硝酸钠组合物水剂(体积比1：1混合)的抗细菌活性。取无菌试管，加入待测组合物样品，再加入试验用菌悬液，迅速混合并计时。待试验菌与组合物互相作用至10分钟或30分钟，分别吸取1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可用pbs进行10倍系列稀释后，再进行活菌培养计数。同时用pbs进行平行试验，作为阳性对照。阳性对照回收菌落数在1.0
×
10
4 cfu/ml～9.0
×
104cfu/ml。所有试验样本和对照样本均在36℃
±
1℃培养，对细菌繁殖体培养48h观察最终结果。试验重复3次，计算杀菌率。
59.表4.含硼酸、亚硝酸钠组合物的水剂抗细菌活性
60.结果如表4所述:单独使用2％硼酸对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌仅有弱的杀菌效果，单独0.45％亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌无明显杀菌效果，当4％硼酸和0.9％亚硝酸钠1:1组合时，组合物12的杀菌效果显著增强，作用10min即可达到大于99.9％的杀菌活性。
61.实施例5：含硼酸、亚硝酸钠组合物的水剂抗真菌活性使用白色念珠菌(atcc10231，北纳创联生物科技有限公司提供，培养第3代)，悬液定量杀菌方法来评价硼酸与亚硝酸钠组合物(体积比1：1混合)的抗真菌活性，实验操作同实施例4，对白色念珠菌需培养72h观察最终结果。
62.表5.含硼酸、亚硝酸钠组合物的水剂抗真菌活性
63.结果如表5所述:单独使用2％硼酸对白色念珠菌仅有弱的杀菌效果，单独使用0.45％亚硝酸钠对白色念珠菌和红色毛癣菌无明显杀菌效果，当2％硼酸和0.45％亚硝酸钠组合时，组合物12的杀菌效果显著增强，作用10min即可达到大于99.9％的杀菌活性。
64.实施例6：含硼酸、亚硝酸钠组合物的水凝胶制备
65.表6.含硼酸的示例性水凝胶剂
66.制备过程：根据表6的比例，取羟乙基纤维素加水完全溶解后，加入甘油、硼酸，混合搅拌，使其完全溶解后，加入尼泊金乙酯和ph调节剂(ph＝4～5)，继续搅拌5小时，静置24小时，凝胶变得澄清透明。
67.表7.含亚硝酸钠的示例性水凝胶剂成分na-01na-02na-03na-04na-05na-06羟乙基纤维素0.6％0.6％0.3％0.5％0.6％0.6％甘油15％15％10％10％15％15％亚硝酸钠1.0％6.0％4.0％2.0％1％0.5％尼泊金甲酯0.1％0.1％0.1％0.1％0.1％0.1％纯化水余量余量余量余量余量余量
68.制备过程：根据表7的比例，取羟乙基纤维素加水完全溶解后，加入亚硝酸钠，混合搅拌，使其完全溶解后，加入尼泊金乙酯,继续搅拌5小时，静置24小时，凝胶变得澄清透明。
69.实施例7：含硼酸和亚硝酸钠组合物水凝胶的抗流感病毒活性用法是：根据实施例6分别制备含硼酸和亚硝酸钠的示例性水凝胶，以体积比1:1混合形成组合物，用于抗病毒活性测试，抗病毒活性测试操作步骤如实施例1，a:0＜δlg《1；b: 1≤δlg《3；c:3≤δlg《5.5；d:5.5≤δlg。
70.表8.含硼酸和亚硝酸钠组合物水凝胶的抗流感病毒活性
71.结果如表8所示，含硼酸和亚硝酸组合物的水凝胶有显著的抗流感病毒活性，相比于生理盐水组，其tcid
50
下降了10
5.5
倍及以上。而且硼酸与亚硝酸钠组合物水凝胶具有长效抗病毒的作用，24小时后仍可以有效抑制。
72.实施例8：含硼酸和亚硝酸钠组合物水凝胶的抗单纯疱疹病毒活性用法是：根据实施例6分别制备含硼酸和亚硝酸钠的示例性水凝胶，以体积比1:1混合形成组合物，用于抗单纯疱疹病毒活性测试，抗病毒活性测试操作步骤：上述样品/空白对照组与滴度为1*10e^8/ml的hsv-1kos病毒株悬浮液以体积比20:3混合，在25℃下孵育20 min后，加入中止液(1:10)稀释。将样品用dmem高糖培养基梯度稀释，吸走孔板中的上清，将200ul稀释的病毒液加入铺有vero细胞的二十四孔板，每个稀释度做两个重复，37℃、 5％co2培养1h，每15min左右摇晃一次，使得病毒能够均匀吸附于vero细胞；培养1h 后，加入1ml dmem甲基纤维素培养液于二十四孔板，继续培养三天，观察孔板内细胞被病毒侵蚀而产生的噬斑并计数。
73.表9.含硼酸和亚硝酸钠组合物水凝胶的抗单纯疱疹病毒活性
74.结果如表9所示，相比于生理盐水组，含硼酸和亚硝酸组合物的水凝胶有显著的抗单纯疱疹病毒活性。而且硼酸与亚硝酸钠组合物水凝胶具有长效抗病毒的作用，4小时后仍可以有效抑制。
75.实施例9：含硼酸和亚硝酸钠组合物的乳剂制备制备过程：根据表10的比例，将水相和油相分别加热到65℃，将油相缓缓加入水相中并同时进行搅拌，使其完全乳化，冷却至室温。
76.表10.含硼酸的示例性乳剂ba-07
77.制备过程：根据表11的比例，将水相和油相分别加热到65℃，将油相缓缓加入水相中并同时进行搅拌，使其完全乳化，冷却至室温。
78.表11.含亚硝酸钠的示例性乳剂na-07
79.实施例10：含硼酸和亚硝酸钠组合物的抗菌活性
80.用法是：根据实施例9分别制备含硼酸和亚硝酸钠的示例性乳剂，以体积比1:1混合形成组合物，用于抗菌活性测试，抗菌活性测试操作步骤参考实施例4。
81.表12.含硼酸、亚硝酸钠组合物的水剂抗菌活性
82.结果如表12所示，含硼酸和亚硝酸组合物的乳剂有显著的抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的活性。