一种含TCP-25的可注射快速止血水凝胶及其制备方法

一种含tcp-25的可注射快速止血水凝胶及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物医用材料，属于生物体的伤口敷料、止血或胃溃疡愈合等技术领域，具体涉及一种基于羧甲基壳聚糖的含tcp-25的快速止血水凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.胃溃疡严重影响着人们的健康。在临床研究中，胃溃疡患者有溃疡穿孔、幽门梗阻、癌症等并发症，并伴有上消化道出血，严重者甚至危及患者生命。即使胃溃疡在内镜下愈合，其组织学和超微结构仍可能存在异常，如黏膜厚度减少、腺体和毛细血管减少等，容易导致胃溃疡复发。出血是胃溃疡的必然结果，会给患者带来极大的痛苦，甚至危及生命，消化性溃疡出血总是导致明显的发病率和死亡率。为应对胃溃疡后快速出血的巨大挑战，近年来开发了一系列止血药物，如静脉注射质子泵抑制剂和止血剂、口服胃黏膜保护剂等。然而，药物治疗对止血和愈合的影响是有限的，数据显示会有20%的病例会发生延迟出血。一方面，这些药剂由于耐酸性不强，溶解较快，所以一般持续时间较短；另一方面，一些粉剂药物必须通过导管输送到病灶，这给手术过程带来了额外的负担；此外，由于患者治疗期间寻求太多的治疗方案，在医生的建议下消耗了太多的治疗费用，给患者及其家人带来了很大的经济压力。迄今为止，溃疡出血后的止血治疗仍面临很大挑战。
3.水凝胶作为主要伤口敷料的目的是促进伤口愈合，减少术后感染。同时，水凝胶形成后，可直接注射到伤口部位，减少手术过程，加快伤口愈合。因此，当治疗胃溃疡出血不便时，水凝胶具有无可比拟的优势。郭等人报道了一种基于丙烯酰基-6-氨基己酸和aa-g-n-羟基琥珀酰亚胺通过原位自由基聚合形成的可注射水凝胶，用于胃止血和伤口愈合。（guo y, dundas cm, zhou x, et al. molecular engineering of hydrogels for rapid water disinfection and sustainable solar vapor generation[j]. advanced materials, 2021, 33(35): 2102994.）夏等人报道了一种止血混合水凝胶，他们进一步证明了水凝胶具有良好的凝血能力（~60 s）。（xia x, xu x, wang b, et al. adhesive hemostatic hydrogel with ultrafast gelation arrests acute upper gastrointestinal hemorrhage in pigs[j]. advanced functional materials, 2021: 2109332.）但这些水凝胶所用原料复杂，对急性胃溃疡出血患者的止血时间较长，严重时可能危及患者生命，从而限制了其在治疗危重上消化道大出血中的应用。
[0004]
为了克服这些限制，我们设计了一种理想的自愈性可注射止血水凝胶敷料，用于急性胃溃疡出血后的止血和伤口愈合。壳聚糖及其衍生物是经由食品药品监督管理局批准的可以用作局部止血的药品，同时，凝血酶c端衍生肽
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gkygfythvfrlkkwiqkvidqfge，标记为tcp-25，具有治愈伤口以及抑制细菌生长的能力，在实验动物模型中证明可以清除病原体中的脂多糖（lipopolysaccharide，lps，）-是造成炎症形成的罪魁祸首。此外，凝血酶-是凝血过程的关键因素，广泛用于止血困难的出血部位。凝血酶可以止血的主要原因是促使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，直接作用于血液凝固的最后一步，因此能够快速止血，从而可以作为功能因子掺杂至水凝胶中制备止血水凝胶敷料。


技术实现要素：

[0005]
针对目前存在的技术问题，本发明旨在制备一种具有自愈性可注射止血水凝胶敷料，其步骤简单，原料廉价易获得，具有普适性，在生物医用材料、无菌处理、体外伤口敷料、快速止血、胃溃疡伤口愈合、记忆体内术后伤口处理等方面的用途。本发明的自愈性可注射止血水凝胶具极短的凝胶时间、良好的生物相容性和优秀的止血性能；此外，还能够使得生物体内术后所形成的创面进行保护，达到尽早愈合的目的，减少患者术后疼痛等相关临床症状，更有助于防止术后穿孔、狭窄、出血等并发症的发生。
[0006]
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种含tcp-25的可注射快速止血水凝胶的制备方法为：取一定量的黄原胶或魔芋胶溶解于去离子水中，加入适量的naio4裂解顺二醇基团的c-c键生成醛基，然后基于动态亚胺键作用，将端基带有醛基的黄原胶衍生物或魔芋胶衍生物作为凝胶因子，引入tcp-25，交联羧甲基壳聚糖，得到了含tcp-25的系列自愈性水凝胶tcp-cx和tcp-co；具体包括以下步骤：（1）将羧甲基壳聚糖溶于水得到第一组分溶液；（2）将黄原胶或魔芋胶溶于水，再加入naio4，充分搅拌反应后，经透析、离心沉淀、冷冻干燥、溶于水得到第二组分溶液；（3）将凝血酶衍生肽加入到第一组分溶液后，与第二组分溶液混合，待其交联后，形成含tcp-25的可注射快速止血水凝胶。
[0007]
进一步地，所述第一组分溶液的浓度是50-80mg/ml；第二组分溶液的浓度为5-50mg/ml。
[0008]
进一步地，步骤（2）中naio4与黄原胶或魔芋胶的质量比为1-100:15或1-100:5。
[0009]
进一步地，步骤（2）中反应为氧化反应，反应温度为20-80℃，反应时间为4-24h，达到反应时间后会加入乙二醇以终止反应，优选地，氧化反应加入1-3ml的乙二醇终止反应，反应1-5h以终止氧化反应。
[0010]
进一步地，步骤（3）中交联时间为8-20s。
[0011]
进一步地，步骤（3）中凝血酶衍生肽的浓度为0.3
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1mm。
[0012]
进一步地，本发明选用的羧甲基壳聚糖，羧甲基壳聚糖分子链上存在有活性的氨基，可以提供发生席夫碱反应的活性位点，对于交联形成水凝胶有很好的基础；而且羧甲基壳聚糖有一系列优异的理化性质和生物特性，比如良好的水溶性、抗菌性、凝血性、促进细胞增殖等，有广阔应用前景。
[0013]
进一步地，本发明选用的原料是黄原胶，作为一种水溶性多糖，由于他的大分子特式结构和交替特性，而具有多种功能，同时其主、侧链上含有大量的羟基、羧基等活性基团，从而可以通过改性赋予其新的性能。
[0014]
进一步地，本发明选用的另一种基质魔芋胶。魔芋胶是一种水溶性非离子型的天然多糖。其分子中存在丰富的羟基，因而反应活性好，方便进行多种改性提高其应用性能，而且对水有很好的亲和力，溶胶性良好。对于其进行醛化改性之后，能够和第一组分溶液发生席夫碱反应，形成三维网络结构稳定的水凝胶。
[0015]
进一步地，本发明选用的黄原胶和魔芋胶，两者分子链中的顺二醇基团能被强氧化剂naio4氧化为醛基，氧化后的衍生物上的醛基能和羧甲基壳聚糖上的氨基生成动态亚
胺键，醛基和氨基生成的动态亚胺键能为水凝胶带来自愈性和可注射性，从而满足多种医疗需要，且反应条件温和，反应速率快。
[0016]
有益效果：（1）本发明目的之一在于通过表界面胶体相互作用，制备了基于tcp-25肽的抗菌止血水凝胶材料，选用的基质材料无毒、绿色健康，对生物体没有潜在危害；（2）本发明目的之二通过将氧化后的天然高分子与羧甲基壳聚糖混合，采用“一锅法”制备而成，避免了其他有毒物质的加入，因此这种水凝胶材料能提高其生物相容性。
[0017]
（3）本发明目的之三在于采用天然高分子制备的tcp-25水凝胶具有快速止血的（8-9s）及促进胃溃疡愈合的功能功能，能促进创面创伤的愈合以及降低感染率和发炎率。还在于发展其在生物体体内上消化道的术后治疗，可以用在胃、十二指肠等部位。
[0018]
（4）本发明目的之四在于其可注射性，可拓宽在外科手术或内镜粘膜下剥手术（esd），内镜经粘膜下隧道切除术（ster），内镜下全层切除术(eftr)等的应用。
[0019]
（5）本发明目的之五在于因此有望在抗菌止血材料、消炎抗菌材料、药物缓释材料、生物医药、快速止血、上消化道胃溃疡愈合等多种领域具有潜在的应用。
附图说明
[0020]
图1是羧甲基壳聚糖-醛化黄原胶水凝胶的制备过程示意图；图2是羧甲基壳聚糖、黄原胶的醛化过程以及水凝胶的反应机理图；图3是水凝胶的数码图片；图4是羧甲基壳聚糖-醛化魔芋胶水凝胶的制备过程示意图；图5是羧甲基壳聚糖、魔芋胶的醛化过程以及水凝胶的反应机理图；图6是水凝胶的红外光谱图；图7是水凝胶的自愈性和可注射性能图；图8是水凝胶的肝脏外伤止血图；图9是水凝胶的活体胃溃疡治疗图。
具体实施方式
[0021]
本发明公开了一种含tcp-25的可注射快速止血水凝胶的制备方法及应用。制备材料包括：羧甲基壳聚糖、黄原胶、魔芋胶、naio4、乙二醇、tcp-25、超纯水。
[0022]
实施案例1-3：将羧甲基壳聚糖（1.5~2.4g）在无菌水（30ml）进行搅拌溶解，搅拌直至完全溶解为止，得到50-80mg/ml的羧甲基壳聚糖溶液作为第一组分溶液；在本实施案例中，选用的第一组分溶液浓度是80mg/ml，反应流程图如图1所示。
[0023]
将黄原胶（1g）在无菌水（100ml）进行搅拌溶解，然后将超声溶解的高碘酸钠溶液（10%（w/v）；3 ml）加入到黄原胶水溶液中，充分搅拌，使其在黑暗条件下，t=45℃的条件下发生氧化反应，反应时间8h，然后加入乙二醇（1ml）使得氧化反应终止，终止时间1h。然后将反应溶液透析72h，随后在无水乙醇中离心沉淀得到反应产物，最后冷冻干燥得到最终的醛化黄原胶产物。
[0024]
继续将醛化黄原胶产物溶于无菌水得到5-30mg/ml醛化黄原胶溶液作为第二组分
溶液；在本实施案例中，选用的第二组分溶液浓度分别是5mg/ml、15mg/ml、30mg/ml。
[0025]
将第一功能组分溶液和第二组分溶液等体积混合，待其交联，形成羧甲基壳聚糖-醛化黄原胶水凝胶。
[0026]
反应过程机理图如图2，羧甲基壳聚糖上有很多氨基活性反应位点，醛化黄原胶上有很多醛基活性反应位点，氨基和醛基发生席夫碱反应生成亚胺键，从而发生逐步交联形成三维网络结构稳定的水凝胶材料。水凝胶的数码图片如图3所示，倒立放置，样品不流动，为凝胶状态。
[0027]
实施案例4-6：将羧甲基壳聚糖（1.5-2.4g）在无菌水（30ml）进行搅拌溶解，搅拌直至完全溶解为止，得到50-80mg/ml的羧甲基壳聚糖溶液作为第一组分溶液；在本实施案例中，选用的第一组分溶液浓度是60mg/ml，反应流程图如图4所示。
[0028]
将魔芋胶（1g）在无菌水（100ml）进行搅拌溶解，然后将超声溶解的高碘酸钠溶液（10%（w/v）；3 ml）加入到魔芋胶水溶液中，充分搅拌，使其在黑暗条件下，t=30℃的条件下发生氧化反应，反应时间4h，然后加入乙二醇（1ml）使得氧化反应终止，终止时间3h。然后将反应溶液透析48h，随后离心沉淀得到反应产物，最后冷冻干燥得到最终的醛化魔芋胶产物。
[0029]
将醛化魔芋胶产物溶于无菌水得到30-50mg/ml醛化魔芋胶溶液作为第二组分溶液；在本实施案例中，选用的第二组分溶液浓度分别是30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml。
[0030]
将第一功能组分溶液和第二组分溶液等体积混合，待其交联，形成羧甲基壳聚糖-醛化魔芋胶水凝胶。
[0031]
反应过程机理图如图5，羧甲基壳聚糖上有很多氨基活性反应位点，醛化魔芋胶上有很多醛基活性反应位点，氨基和醛基发生席夫碱（schiff）反应生成亚胺键，从而发生逐步交联形成三维网络结构稳定的水凝胶材料。水凝胶的数码图片如图3所示，倒立放置，样品不流动，为凝胶状态。
[0032]
实施案例7-9：按照实施案例1的方法配置第一组分水溶液和第二组分醛化黄原胶水溶液。
[0033]
将凝血酶衍生肽（tcp-25，c=0.3mm）作为第三功能组分溶入第一组分溶液中得到第一功能组分溶液；在本实施案例中，选用的第一功能组分溶液浓度是80mg/ml；在本实施案例中，选用的第二组分溶液浓度分别是5mg/ml、15mg/ml、30mg/ml。
[0034]
将第一功能组分溶液和第二功能组分溶液等体积混合，待其交联，形成羧甲基壳聚糖-醛化黄原胶-凝血酶衍生肽水凝胶，成胶示意图如图2所示，水凝胶的红外光谱图如图6所示。
[0035]
羧甲基壳聚糖上有很多氨基活性反应位点，醛化黄原胶上有很多醛基活性反应位点，氨基和醛基发生席夫碱反应生成亚胺键，在从而发生逐步交联形成三维网络结构稳定的水凝胶材料，同时凝血酶衍生肽（tcp-25）作为功能组分起到抗菌止血的作用，所获得的水凝胶不但具有优异的自愈性和出色的可注射性（图7），还具有快速止血功能（图8），以及促进胃溃疡伤口止血和伤口愈合的作用（图9）。
[0036]
实施案例10-12：按照实施案例1的方法配置第一组分水溶液和第二组分醛化魔芋胶水溶液。
[0037]
将凝血酶衍生肽（tcp-25，c=0.3 mm）作为第三功能组分溶入第一组分溶液中得到第一功能组分溶液；在本实施案例中，选用的第一功能组分溶液浓度是60mg/ml；在本实施案例中，选用的第二组分溶液浓度分别是30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml。
[0038]
将第一功能组分溶液和第二功能组分溶液等体积混合，待其交联，形成羧甲基壳聚糖-醛化魔芋胶胶-凝血酶衍生肽水凝胶，成胶示意图如图5所示，水凝胶的红外光谱图如图6所示。
[0039]
羧甲基壳聚糖上有很多氨基活性反应位点，醛化黄原胶上有很多醛基活性反应位点，氨基和醛基发生席夫碱反应生成亚胺键，在从而发生逐步交联形成三维网络结构稳定的水凝胶材料，同时凝血酶衍生肽作为功能组分起到抗菌止血的作用，所获得的水凝胶不但具有优异的自愈性和出色的可注射性（图7），还具有快速止血功能（图8），以及促进胃溃疡伤口止血和伤口愈合的作用（图9）。
[0040]
以上所述均是本发明的优选实施方式，并不局限本发明保护范围，本技术领域的普通专业人员阅读本发明之后，在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施实例，都属于本发明保护的范围。