一种环氧树脂包埋动物组织标本的制作方法及应用

1.本发明属于生物标本的制备方法领域，涉及医学相关专业中的动物组织标本制作，具体是一种环氧树脂包埋动物组织标本的制作方法及应用。


背景技术：

2.在医学相关的专业中，动物组织标本几乎是必不可少的教学材料。最常用的中小型动物组织标本基本都是使用福尔马林浸泡法进行处理。福尔马林浸泡的标本，往往存放于玻璃罐子中，既散发出福尔马林特有的刺鼻气味，又因其体积巨大不便于移动。而使用环氧树脂制作的标本，相较于传统的福尔马林浸泡标本，不仅外形美观，成本低廉，制作时间短，便于携带且无毒无味，还具有透明度高，可长时间保存等优点。环氧树脂标本具有一定的硬度，且能够固定动物组织的形态，用于教学，可进行无死角观察。但现今环氧树脂标本存在分层明显的缺陷。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种全新的环氧树脂包埋动物组织标本的制作方法，且能够消除分层现象，还可以应用于昆虫、植物以及特殊动物组织的标本制作。
4.本发明的技术方案：一种环氧树脂包埋动物组织标本的制作方法，包括以下步骤：（1）取新鲜动物组织，用无水乙醇洗净，用手术刀对组织进行修整，用昆虫针以“x”形交叉穿针，镊子加以辅助，在不伤及组织的情况下，对动物组织进行整姿，并固定在塑料泡沫板上，用细线进行捆绑；将泡沫板固定动物组织的一面记为顶面，另一面记为底面；（2）另起几根线，穿针，从泡沫板的四角穿透泡沫板，横向固定于泡沫板顶面；线的另一端系上砝码，置于福尔马林中，使其顶面朝上，且保持平衡；（3）7d后，取出，拆线拆针，用吸水纸吸干残余福尔马林后包裹，置于泡沫板上，放至阴凉处备用；（4）两种环氧树脂同源支撑柱的制备：a\将塑料碗置于电子秤上，量程归零，ab硅胶以a：b=1:1的质量比缓慢倒入，顺序为先倒固化剂b后倒液体硅胶a，配置完毕后立刻搅拌，直至完全混匀为止；将搅拌好的ab混合硅胶置入真空桶中，抽真空20 min后，缓慢打开放气阀，放气；静置5 min，检查除泡情况；取2 mm直径金属棒，用试管夹夹住上端，固定于铁架台，调节合适高度，金属棒和下端垂直插入ab混合硅胶中，不要触底；将固定好的一套铁架台及ab混合硅胶置入4
°
c冰箱，放置24 h后取出；取下试管夹，取出金属棒，取下一次性塑料碗，环氧树脂同源支撑柱硅胶模具制备完成；将塑料碗置于电子秤上，量程归零,环氧树脂和固化剂以3:1的质量比缓慢倒入，顺序为先倒固化剂后倒环氧树脂；混合胶配置完毕后立刻搅拌，直至杯中不再出现肉眼可见的絮状物为止；将盛有环氧树脂混合胶的硅胶量杯放入真空桶中，开启真空泵直至混合胶表层产生大量白色气泡，关闭真空泵，静置并观察，15 min后气
泡全部消失后，缓慢放气后再打开真空桶盖，取适量混合胶，将环氧树脂同源支撑柱硅胶模具置于水平桌面上，缓慢倒入混合胶直至填满模具，取一次性塑料碗扣住模具防尘，静置48 h后脱模备用，环氧树脂同源支撑柱制备完成，用于体积较大的动物组织；b\配置环氧树脂混合胶备用，用无水乙醇浸泡毛细玻璃管10 min，取出后垂直放置，阴干；将毛细玻璃管缓慢垂直插入环氧树脂混合胶，置入真空桶，抽真空15 min；缓慢放气，用镊子将毛细玻璃管取出，横向放置于水平桌面上；静置48 h后，轻轻敲碎毛细玻璃管外壁，取出内芯，用手术刀对其进行修整；用7000目砂纸和10000目抛光块对内芯进行镜面抛光，抛光完成后置于无水乙醇中避光保存，环氧树脂同源微米支撑柱制备完成，用于体积较小且形状不规则的动物组织；（5）使用uv胶连接动物组织和环氧树脂同源支撑柱或环氧树脂同源微米支撑柱，置于紫外灯下照射2 min；用铁架台及试管夹固定环氧树脂同源支撑柱的空白上端，下端连接动物组织；（6）将动物组织端置入硅胶模具正中，调整试管夹；按照步骤（4）中方法制备环氧树脂混合胶，将混合胶用搅拌棒引流倒入，直至混合胶液面高度几乎与模具边缘齐平，在模具开口处蒙上保鲜膜罩上防尘罩以防止落入灰尘，超声30 min，取出，在水平桌面上静置6 h。
5.所述步骤（4）搅拌过程中适当刮蹭杯壁，防止杯壁附近的混合胶混合不匀。
6.所述步骤（4）如有明显气泡，最多重复上述步骤3次。
7.所述步骤4的固化剂b是缩聚型双组份硅橡胶rtv-2交联剂，一般情况下能购买到的所有环氧树脂和硅胶都是ab一起售卖，a液为环氧树脂/硅胶，b液为相应的固化剂；此步骤制备了两种支撑柱，一种为环氧树脂同源支撑柱，另一种为环氧树脂同源微米支撑柱，前者需要用硅胶制作模具，后者不需要；后者需要用到毛细玻璃管，前者不需要；两种支撑柱的区别在于使用条件不同：即支撑柱用于体积较大的动物组织，微米支撑柱用于体重较小且形状不规则的动物组织；所述体积较大的动物组织：心肝脾肾等实质性器官；体积较小且形状不规则动物组织：肺脏，肠管，子宫等。
8.所述步骤（5）视实际情况进行固定，使用多个环氧树脂同源支撑柱或使用多个环氧树脂同源微米支撑柱穿透动物组织以起到固定效果，在连接处使用uv胶，支撑柱上端用试管夹固定。
9.所述步骤（6）使用之前的硅胶模具，用无水乙醇清洗硅胶模具及硅胶量杯，洗净后倒扣在阴凉处使其杯口朝下，放至阴凉处自然风干，或洗净后用吸水纸擦去模具内外表面所有液体，用透明胶带清理内表面上的杂质。
10.所述步骤混合胶质量超过200 g或室温高于25
°
c时，将模具置于盛有凉水的盆中进行物理降温，减缓其放热反应的进行速度，硅胶同理。
11.使用环氧树脂混合胶制作包埋动物组织时，分两次注胶，为了尽可能消除分层现象，在室温25
°
c的情况下，两次注胶时间间隔控制在6 h，环氧树脂同源微米支撑柱分层现象最不明显。
12.用剪刀剪断环氧树脂同源（微米）支撑柱高于硅胶模具的部分，进行二次注胶。因为环氧树脂具有缩胶的特性（即固化后体积会减少，顶面向内凹陷），二次注胶时，将混合胶加到凸出硅胶模具但尚未溢出的程度，才能保证其彻底固化后顶面平整。
13.用吸管和牙签小心除去气泡，再次放到水盆中物理降温。在室温25
°
c条件下，约48h后完全固化。固化期间用手术刀轻按，完全固化之前，细小的压痕会随着时间的推移自动补全使表面变得光滑平整。
14.完全固化后，用手指在模具底部用力将其倒扣脱模，如上述流程操作仔细，除分层现象外，成品不易出现瑕疵。
15.如果对于标本成品有特定形状要求，而现有模具无法满足条件时，用砂纸打磨对其形状进行修整。
16.当在固定昆虫、植物以及特殊动物组织时，用卡尔氏液替代福尔马林，其余步骤不变；卡尔氏液的配制：取无水乙醇170 ml、蒸馏水280 ml、福尔马林60 ml、冰醋酸20 ml，搅匀后置于阴凉避光处。所述特殊动物组织如：眼球、大脑、小脑、坏疽和其他脆弱的健康组织或病变。
17.由于分层现象明显与否由两次注胶的间隔时间长短，环境温度以及环氧树脂固化物折光率的差异共同决定。而本发明制作标本的主体胶和固定动物组织的环氧树脂同源支撑柱材料和配比几乎完全相同，使用该方法制作的环氧树脂同源微米支撑柱直径只有200μm，肉眼不宜观察，从根源上解决了传统方法因分层制作，导致两层胶折光率不同，分层现象明显的的问题。
附图说明
18.图1是本发明实施例1的成品图。
19.图2是本发明实施例2的成品图。
20.图3是本发明实施例3的成品图。
21.图4是本发明实施例4的成品图。
22.图5是本发明实施例5的成品图。
23.图6是本发明实施例6的成品图。
具体实施方式
24.本发明是通过以下实验得到的：1.1 试验材料1.1.1 试验器材及动物组织新鲜动物组织、环氧树脂及其固化剂，ab硅胶、uv胶、紫外灯、试管夹、铁架台、硅胶模具、一次性塑料碗、一次性搅拌棒、一次性塑料吸管、一次性镊子、电子秤、无水乙醇、剪刀、福尔马林（37%甲醛溶液）、蒸馏水、冰醋酸、昆虫针（00#~5#）、细线、砝码、塑料泡沫板、手术刀柄、一次性手术刀片、超声波水浴恒温振荡器、真空泵及真空桶、2 mm直径金属棒、牙签、一次性手套、凉水盆、保鲜膜、80~7000目砂纸、抛光块、吸水纸、毛细玻璃管。
25.1.2 试验方法1.2.1 动物组织的整姿、脱水处理取新鲜动物组织，用无水乙醇洗净，用手术刀对组织进行修整，选择合适尺寸的昆虫针以“x”形交叉穿针，镊子加以辅助，在不伤及组织的情况下，对新鲜动物组织进行整姿，并固定在塑料泡沫板上，用细线进行捆绑，不宜过紧。将泡沫板固定新鲜动物组织的一面记
为顶面，另一面记为底面。另起几根线，穿针，从泡沫板的四角穿透泡沫板，横向固定于泡沫板顶面。线不宜过长，另一端系上砝码，置于福尔马林中，使其顶面朝上，且保持平衡。7 d后，取出，拆线拆针，用吸水纸吸干残余福尔马林后包裹，置于泡沫板上，放至阴凉处备用。
26.卡尔氏液的配制：取无水乙醇170 ml、蒸馏水280 ml、福尔马林60 ml、冰醋酸20 ml，搅匀后置于阴凉避光处，该固定液需现用现配。卡尔氏液适用于节肢动物，软体动物，以及植物的保色，大多数昆虫外壳，使用常规方法固定，极容易氧化变色，而卡尔氏液抗氧化效果极佳。
27.在固定昆虫、植物以及特殊动物组织时，可用卡尔氏液替代福尔马林，其余步骤不变。
28.1.2.2 注胶流程1.2.2.1 两种环氧树脂同源支撑柱的制备将塑料碗置于电子秤上，量程归零。ab硅胶以a：b=1:1的质量比缓慢倒入，顺序为先倒固化剂（b）后倒液体硅胶（a），配置完毕后应立刻搅拌，直至完全混匀为止。搅拌过程中适当刮蹭杯壁，防止杯壁附近的ab混合硅胶混合不匀。
29.将搅拌好的ab混合硅胶置入真空桶中，抽真空20 min后，缓慢打开放气阀，放气。静置5 min，检查除泡情况。如有明显气泡，最多重复上述步骤3次。取2 mm直径金属棒，用试管夹夹住上端，固定于铁架台，调节合适高度。金属棒和下端垂直插入ab混合硅胶中，但不要触底。将固定好的一套铁架台及ab混合硅胶置入4
ꢀ°
c冰箱，放置24 h后取出。
30.取下试管夹，取出金属棒。取下一次性塑料碗，环氧树脂同源支撑柱硅胶模具制备完成。
31.将塑料碗置于电子秤上，量程归零。环氧树脂和固化剂以3:1的质量比缓慢倒入，顺序为先倒固化剂后倒环氧树脂
5.。混合胶配置完毕后应立刻搅拌，直至杯中不再出现肉眼可见的絮状物为止。搅拌过程中适当刮蹭杯壁，防止杯壁附近的混合胶混合不匀。
32.环氧树脂和固化剂的体积比为2.5:1，但由于温度会对两者体积起到轻微影响，故质量比较为精确，一般情况下不使用体积比。如果比例不当，可能会发生环氧树脂混合胶无法固化的现象。
33.将盛有环氧树脂混合胶的硅胶量杯放入真空桶中，开启真空泵直至混合胶表层产生大量白色气泡，关闭真空泵，静置并观察，约15 min后气泡全部消失后，需缓慢放气后再打开真空桶盖，防止因突然进气过快而引起混合胶四处飞溅。
34.用无水乙醇浸泡毛细玻璃管10 min，取出后垂直放置，阴干。
35.将毛细玻璃管缓慢垂直插入环氧树脂混合胶，置入真空桶，抽真空15 min。缓慢放气，用镊子将毛细玻璃管取出，横向放置于水平桌面上。静置48 h后，轻轻敲碎毛细玻璃管外壁，取出内芯，用手术刀对其进行修整。
36.用7000目砂纸和10000目抛光块对内芯进行镜面抛光。抛光完成后的内芯即是环氧树脂同源微米支撑柱，置于无水乙醇中避光保存。
37.将环氧树脂同源支撑柱硅胶模具置于水平桌面上，缓慢倒入混合胶直至填满模具，取一次性塑料碗扣住模具，作为防尘罩。静置48 h后脱模备用。
38.分层现象明显与否由两次注胶的间隔时间长短，环境温度以及环氧树脂固化物折光率的差异共同决定。由于制作标本的主体胶和固定动物组织的环氧树脂同源支撑柱材料
和配比几乎完全相同，而使用该方法制作的环氧树脂同源微米支撑柱直径只有200μm，肉眼不宜观察，从根源上解决了传统方法因分层制作，导致两层胶折光率不同，分层现象明显的的问题。
39.1.2.2.2初次注胶选用合适尺寸的硅胶模具，用无水乙醇清洗硅胶模具及硅胶量杯，洗净后倒扣在阴凉处使其杯口朝下，放至阴凉处自然风干，或洗净后用吸水纸擦去模具内外表面所有液体，用透明胶带清理内表面上的杂质。
40.使用uv胶连接动物组织和环氧树脂同源支撑柱，置于紫外灯下照射2min。用铁架台及试管夹固定环氧树脂同源支撑柱的空白上端，下端已连接动物组织。视实际情况进行固定，可使用多个环氧树脂同源支撑柱。
41.使用多个环氧树脂同源微米支撑柱穿透动物组织以起到固定效果，可在连接处使用少量uv胶。支撑柱上端用试管夹固定。
42.将动物组织端置入硅胶模具正中，调整试管夹。按照1.2.2.1方法制备环氧树脂混合胶。
43.将真空消泡后的环氧树脂混合胶用搅拌棒引流倒入，直至混合胶液面高度几乎与模具边缘齐平，在模具开口处蒙上保鲜膜罩上防尘罩以防止落入灰尘，超声30min，取出，在水平桌面上静置6h。
44.1.2.2.3物理降温由于环氧树脂与固化剂混合时发生的是不可逆的放热反应，放热过快不仅会导致大量气泡的产生，也会极大缩短固化进程，减少固化时间，故混合胶质量超过200g或室温高于25
°
c时，应将模具置于盛有凉水的盆中进行物理降温，减缓其放热反应的进行速度，硅胶同理。
45.1.2.2.4二次注胶使用环氧树脂混合胶制作包埋动物组织时，需要分两次注胶。
46.为了尽可能消除分层现象，在室温25
°
c的情况下，两次注胶时间间隔控制在6h左右时，环氧树脂同源微米支撑柱分层现象最不明显。
47.混合胶按照1.2.2.1中的方法制备。用剪刀剪断环氧树脂同源（微米）支撑柱高于硅胶模具的部分，进行二次注胶。
48.因为环氧树脂具有缩胶的特性（即固化后体积会减少，顶面向内凹陷），二次注胶时，需将混合胶加到凸出硅胶模具但尚未溢出的程度，才能保证其彻底固化后顶面平整。
49.用吸管和牙签小心除去气泡，再次放到水盆中物理降温。在室温25
°
c条件下，约48h后完全固化。固化期间可用手术刀轻按，完全固化之前，细小的压痕会随着时间的推移自动补全使表面变得光滑平整。
50.完全固化后，可用手指在模具底部用力将其倒扣脱模，如上述流程操作仔细，除分层现象外，成品不易出现瑕疵。
51.1.2.3塑形、打磨及抛光如果对于标本成品有特定形状要求，而现有模具无法满足条件，这种情况下，可用砂纸打磨对其形状进行修整。本试验将打磨抛光人为分成了三个阶段。
52.塑形阶段：80~2000目砂纸可轻易使环氧树脂标本形状产生巨大变化。
53.打磨阶段：2500~7000目砂纸可逐步使环氧树脂标本透明度增加。
54.抛光阶段：7000目砂纸打磨过后，使用抛光块（约10000目）进行抛光，可使环氧树脂标本表面产生镜面效果。
55.1.2.3.1 砂纸的使用环氧树脂标本在打磨的过程中会产生大量粉尘，使用水磨法进行打磨，能够避免吸入大量粉尘且后续便于清理。为了增大砂纸与环氧树脂标本的接触面积，同时防止砂纸被磨破，可以用湿布垫在砂纸和平整桌面之间。打磨时按照需求选择砂纸目数进行逐步打磨。塑形根据需求从80~800目中选择，而划痕处理可从2000目开始。打磨时手持环氧树脂标本沾水朝同一方向来回打磨，使砂纸造成的磨痕方向统一。在砂纸上的水变浑浊时要及时擦去水分冲洗砂纸及环氧树脂标本，防止战场效应的发生（即上一目数的砂纸打磨残留的颗粒由于未冲洗干净参与更高目数打磨而引起的划痕）。每切换到一个更高目数的砂纸，打磨的方向需同上一次痕迹垂直。在一个目数打磨好的标志即为将上一目砂纸的磨痕完全覆盖，无论是塑形还是打磨，砂纸目数的打磨顺序都是从低到高，且砂纸目数的选择不能跨度过大，否则无法打磨到位。无论是人工打磨还是机器打磨，越高目数砂纸需要的打磨时间越长。使用7000目砂纸打磨完成后，环氧树脂标本表面手感细腻光滑，只是透明度有待提升。将环氧树脂标本洗净擦干，用抛光块反复进行擦拭，直至出现镜面效果。
56.实施例1：新鲜动物组织为母猫卵巢及子宫，其余步骤如上，成品见图1。
57.实施例2：新鲜动物组织为兔子肺脏，其余步骤如上，成品见图2。
58.实施例3：内置物节肢动物为蝎子，其余步骤如上，成品见图3。
59.实施例4：内置物节肢动物分别为云斑白条天牛与黑蚱蝉，其余步骤如上，成品见图4。
60.实施例5：内置物植物为蒲公英，其余步骤如上，成品见图5。
61.实施例6：内置物植物为麦秆菊，其余步骤如上，成品见图6。
62.以上仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。