孢粉素微胶囊的制备方法及应用与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及孢粉素微胶囊的制备方法及应用。


背景技术：

2.目前针对肥胖人群的体重控制仍是一大挑战，据who相关数据统计显示，目前全球已有超过19亿的成人存在体重超重，有超过6.5亿的人群存在肥胖，每年约有300万以上的人群因肥胖导致的相关疾病死亡。因此控制体重，减少肥胖是现代社会人体健康的重中之重。目前市面上存在的体重控制产品主要是三类传统减肥药。传统激素类减肥药，此类减肥药是通过激素的摄入促进机体蛋白质和脂肪的分解代谢，从而达到减肥的目的，但该类减肥药副作用较大，容易造成机体内分泌紊乱，影响人体健康。食欲抑制类减肥药，该类药物直接作用于中枢神经系统，抑制食物对交感神经的刺激从而降低食欲达到减肥的效果，但神经抑制具有一定的广泛性容易造成人精神萎靡，活力下降等副作用。减肥茶类，减肥茶主要作用于胃肠道，能够促进肠胃蠕动，加快人体脂肪和热量的代谢，还能帮助清理肠道，因此减肥茶一般会引起腹泻等症状，长期服用容易造成胃肠道疾病。本发明从天然植物花粉中提取一种活性成分孢粉素，其对油脂具有很强的亲和性，口服后可吸附体内游离的油脂，通过隔绝油脂与消化酶的接触，降低油脂的消化分解，使机体对于油脂的吸收降低，控制因高油脂饮食带来的体重增长，体内脂质水平升高。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的是提供孢粉素微胶囊的制备方法及应用，该方法不仅能够制备出孢粉素微胶囊，而且还可以将花粉或孢子内部的生物质移除，进而使该孢粉素微胶囊可以针对需要包载活性成分，同时还移除了花粉或孢子内有负面影响的活性物质。此外，本发明还研究发现该天然材料具有有效控制体重与降低体内脂肪水平的功能。本发明的技术方案为：
4.第一方面，本发明提供一种孢粉素微胶囊的制备方法，包括：
5.步骤1，将花粉进行脱脂预处理；
6.步骤2，将脱脂花粉悬浮于体积浓度为磷酸溶液中，于70℃下处理一段时间，然后过滤收集孢粉素粗制品；
7.步骤3，将孢粉素粗制品采用不同溶剂进行洗涤，洗涤完毕收集孢粉素精制品；
8.步骤4，将孢粉素精制品风干，再于50～60℃干燥3～4h，即得。
9.进一步地，所述步骤1中花粉选自向日葵花粉、油菜花粉、党参花粉、沙枣花粉、益母草蜂花粉、马尾松花粉中的一种或多种混合。
10.优选地，所述花粉为向日葵花粉。
11.进一步地，所述步骤1中脱脂预处理包括：将花粉分散于纯化水中，过80目筛网后真空抽滤并洗涤滤饼，将滤饼再次分散于纯化水中，重复洗涤至滤液无色，然后分别使用50％、75％乙醇和无水乙醇依次重复洗涤3～5次，干燥得脱脂花粉。
12.进一步地，所述步骤2中磷酸溶液的体积浓度为85％。
13.进一步地，所述步骤3中将孢粉素粗制品分别采用水、碱液、水、有机溶剂、酸液、水、有机溶剂、水依次洗涤。
14.进一步地，有机溶剂为乙醇或丙酮。
15.优选地，所述步骤3中将孢粉素粗制品按照如下步骤进行洗涤：
16.1)80～100℃水洗涤3～5次，
17.2)60～70℃2mol/l的naoh洗涤1次，
18.3)80～100℃水洗涤4～6次，
19.4)40～50℃丙酮洗涤4～6次，
20.5)40～50℃2mol/l的盐酸洗涤1次，
21.6)80～100℃水洗涤4～6次，
22.7)40～50℃丙酮洗涤4～6次，
23.8)50～60℃乙醇洗涤4～6次，
24.9)80～100℃水洗涤1次，
25.每次洗涤花粉在溶剂中搅拌停留5min，最后通过真空过滤收集产物。
26.进一步地，所述搅拌停留5min替换成超声停留5min。
27.第二方面，本发明提供一种孢粉素微胶囊，是采用上述制备方法获得。
28.第三方面，本发明提供一种用于控制体重的药物或保健品，所述药物或保健品包含上述经配制以用于口服的孢粉素微胶囊。
29.第四方面，本发明提供一种用于降脂的药物或保健品，所述药物或保健品包含上述经配制以用于口服的孢粉素微胶囊。
30.第五方面，本发明提供一种用于阻断油脂吸收的药物或保健品，所述药物或保健品包含上述经配制以用于口服的孢粉素微胶囊。
31.本发明提供了一种孢粉微胶囊的制备方法，不仅能够提取出完整的花粉或孢子外壁形成孢粉微胶囊，而且剔除了该孢粉微胶囊内部有负面影响的生物质，比如蛋白质、糖蛋白等，并且纤维素等物质也得到了移除。制备得到的孢粉微胶囊是一种取材植物花粉或孢子的新型生物材质微胶囊，其尺寸具有优异的一致性，并且可选区间大，从3μm到200μm，化学和力学稳定性也十分突出，对酸、碱、微生物等分解手段抵抗能力较强，并且不溶于目前大部分有机溶剂，有十分广泛的应用前景。此外，本发明经动物研究实验还发现该天然材料具有有效控制体重与降低体内脂肪水平的功能。
附图说明
32.图1为本发明实施例1中花粉到脱脂花粉再到孢粉素微胶囊的扫描电子显微镜形貌变化，图(1)为原始花粉，图(2)为脱脂花粉，图(3)为孢粉素。
33.图2为本发明实施例1中花粉到脱脂花粉再到孢粉素微胶囊的激光共聚焦显微镜变化图，图(1)为原始花粉，图(2)为脱脂花粉，图(3)为孢粉素。
34.图3为本发明实施例3中体外模拟实验测定的向日葵孢粉素微胶囊的油脂吸附量。
35.图4为本发明实施例3中连续24天饲喂的动物体重变化情况。
36.图5为本发明实施例3中连续24天饲喂血清总胆固醇含量变化情况。
37.图6为本发明实施例3中连续24天饲喂总胆固醇含量变化情况。
38.图7为本发明实施例3中连续24天饲喂低密度脂蛋白含量变化情况。
39.图8为本发明实施例3中连续24天饲喂后高密度脂蛋白含量变化情况。
40.图9为本发明对比例1获得的孢粉素微胶囊的扫描电子显微镜形貌图。
41.图10为本发明对比例2获得的孢粉素微胶囊的扫描电子显微镜形貌图。
42.图11为本发明对比例3获得的孢粉素微胶囊的扫描电子显微镜形貌图。
43.注：图5～8中，**p＜0.01，*p＜0.05。
具体实施方式
44.在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
45.本发明提供了一种孢粉素微胶囊的制备方法及应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。
46.实施例1
47.本实施例提供一种孢粉素微胶囊的制备方法，具体包括以下步骤：
48.(1)花粉的预处理
49.分别取向日葵花粉、油菜花粉、党参花粉、沙枣花粉、益母草蜂花粉、马尾松花粉10g混合分散于100ml纯化水中，过80目筛网弃去不能通过筛网的杂质，真空抽滤洗涤，将产物再次分散于100ml纯化水中，重复洗涤至滤液基本无色。然后分别使用50％、75％乙醇和无水乙醇依次重复洗涤至滤液基本无色，在通风橱中放置干燥得脱脂花粉。
50.(2)孢粉素提取
51.将2g脱脂花粉悬浮于15ml磷酸(85％v
·
v-1)中，将其置于装有玻璃冷凝器的50ml单颈烧瓶中，温和搅拌下在70℃下处理5h。处理完成后，通过真空过滤收集孢粉素粗制品；
52.并按照如下一系列步骤对孢粉素粗制品进行洗涤(抽滤)：
53.1)80～100℃水100ml洗涤4次，
54.2)60～70℃2mol/l的naoh100ml洗涤1次，
55.3)80～100℃水100ml洗涤5次，
56.4)40～50℃丙酮100ml洗涤5次，
57.5)40～50℃2mol/l的盐酸100ml洗涤1次，
58.6)80～100℃水100ml洗涤5次，
59.7)40～50℃丙酮100ml洗涤5次，
60.8)50～60℃乙醇100ml洗涤5次，
61.9)80～100℃水100ml洗涤1次，
62.每次洗涤花粉在溶剂中搅拌停留5min，最后通过真空过滤收集产物。
63.(3)孢粉素微胶囊干燥
64.将洗涤过的孢粉素转移到干净的玻璃盘中铺展，并在通风橱中风干过夜。然后在烘箱中60℃烘干4小时，将干燥的孢粉素微胶囊在室温下储存在干燥的橱柜中。
65.将原始花粉、脱脂花粉和孢粉素微胶囊分别进行sem和clsm测试，结果如图1和图2所示。由图1的sem表征结果可以看出孢粉素的外层物质清除干净，得到了结构稳定的孢粉素微胶囊。由图2的clsm表征结果可以进一步看出孢粉素外层的物质得到了有效清除，更重要的是内腔中自身所携带的物质也得到了清除，获得球状的干净微胶囊。
66.本实施例还对原始花粉、脱脂花粉和孢粉素微胶囊进行了成分测试，结果如表1所示。
67.表1花粉到孢粉素微胶囊的元素构成含量变化(重量百分比％)
[0068][0069]
由表1的结果可知，在花粉到预处理花粉到孢粉素微胶囊的过程中，碳氢的含量变化不大，表明其主要是碳氢有机物的构成，而氮元素的含量降低明显，达到了95％以上。而花粉中的氮元素来源主要是蛋白质与糖蛋白，这也是花粉过敏的主要来源。氮元素的含量的显著降低可以表明其致敏物质的清除，进一步的证明了其安全性。
[0070]
实施例2
[0071]
本实施例提供一种孢粉素微胶囊的制备方法，与实施例1的区别在于：花粉只采用向日葵，其它同实施例1。
[0072]
实施例3
[0073]
本实施例考察了孢粉素微胶囊的油脂吸附性，以评价其用于体重和脂类物质代谢水平的控制能力。以实施例2获得的向日葵孢粉素微胶囊为例，本实施例通过体外模拟实验测定了向日葵孢粉素微胶囊的最大油脂吸附量为8.24。并通过药理实验证实了孢粉素微胶囊的油脂吸附能力。
[0074]
体外实验：
[0075]
称取20mg向日葵孢粉素6份，分别加入6个离心管中，然后吸取1ml不同的油脂(大豆油、椰子油、葵花籽油、棕榈油、菜籽油、花生油)分别加入到前述的6个离心管中，水浴超声，直至孢粉素完全分散在大豆油中，倒置离心管，所有液体能顺利流下，底部没有未被分散的孢粉素。静置10min，然后将样品放入高速离心机(8000rpm/min，10分钟)，离心完成后，将沉淀以上的未吸附的大豆油全部吸走，再次称量离心管的重量，然后计算孢粉素的油脂吸附量，以吸附质量比定义油脂吸附量(吸附油质量/孢粉素质量)，结果如图3所示，对大豆油的吸附量最高，达到8.24，对其它油脂的吸附量也能达到5.45以上。
[0076]
药理实验：
[0077]
实验动物：sd大鼠，体重180-220g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司。受试动
物预处理：在饲养室内环境适应一周，室温20-24℃，相对湿度40-80％，进食进食沈阳药科大学实验动物室提供的大小鼠繁殖饲料，饮自来水，正常通风，光照，每3日进行垫料的更换。
[0078]
具体实施例：
[0079]
sd大鼠24只，体重180-220g，随机分为4组，每组6只，自由饮水，控制摄食。对照组为正常进食组，每日给予鼠粮15g和0.7ml纯净水；单独给予孢粉素组，简称孢粉组，为每日给予孢粉素混悬液(0.2g孢粉素微胶囊 0.5ml纯净水)和0.2ml纯净水；摄油组为每日给予15g鼠粮与0.2ml大豆油和0.5ml饮用水；油与孢粉素共食用组，简称孢油组，为每日给予15g鼠粮，0.2ml大豆油和孢粉素混悬液(0.2g孢粉素微胶囊 0.5ml纯净水)。连续饲喂24天，记录每日的体重变化，与第24天进行眼眶静脉丛取血，利用试剂盒测定血液生化中tc(血清总胆固醇)、tg(总甘油三酯)、ldl-c(低密度脂蛋白)、hdl-c(高密度脂蛋白)的含量变化。
[0080]
实验结果如图4～8所示。由图4的结果可以看出四组大鼠的初始体重接近，通过每日的体重检测可以看出，摄油组的体重增长远大于其余三组。且其余三组之间体重变化接近。说明在定量饮食下高油饮食会带来迅速地体重增长，而孢粉素的油脂吸附作用能够迅速地控制住体重变化，且对照组与孢粉组组体重变化无明显差异，说明单独的孢粉素饲喂并不会对正常机体的消化有影响。
[0081]
由图5-8的结果可以看出各组大鼠血液中血清总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的含量除摄油组外含量接近，而摄油组的含量与其余三组均存在显著性差异，而油孢组与对照组和孢粉组未存在显著性差异，表明油脂的摄入未对它们的脂类代谢产生影响，说明孢粉素能够有效的抵消掉油脂的影响。
[0082]
对比例1
[0083]
本对比例将实施例1中步骤(1)花粉预处理的“分别使用50％、75％乙醇和无水乙醇依次重复洗涤至滤液基本无色”改成“只用50％的乙醇洗涤至滤液基本无色”，其它同实施例1，最终获得的孢粉素微胶囊扫描电子显微镜形貌如图9所示，显示表层脂质相互粘连，花粉不能完好分开。
[0084]
对比例2
[0085]
本对比例将实施例1中步骤(2)中对孢粉素粗制品进行系列洗涤(抽滤)的过程去掉步骤4)、7)，其它同实施例1，最终获得的孢粉素微胶囊扫描电子显微镜形貌如图10所示，整体外观来看，表层仍然具有极多的脂质，空隙不能打开，不能达到良好的洗涤效果，因此本发明在盐酸洗涤前后加入丙酮洗涤的过程。
[0086]
对比例3
[0087]
本对比例将实施例1中步骤(2)中对孢粉素粗制品进行系列洗涤(抽滤)的过程去掉步骤8)，其它同实施例1，最终获得的孢粉素微胶囊扫描电子显微镜形貌如图11所示，如果改不乙醇洗涤的过程，不仔细观察的话获得的也是孢粉素微胶囊，一旦放大会发现表层还覆盖有厚重的脂质层，导致表层结构不能暴露，洁净程度仍然较差，因此，本发明在丙酮洗涤后又加入乙醇洗涤。
[0088]
综上，本发明的孢粉微胶囊的制备方法，利用一定浓度梯度的醇溶液对花粉或孢子的表面进行处理，移除表面杂质和油脂，为后续的磷酸处理做铺垫，然后通过酸碱溶剂破坏和分解花粉或孢子除外壁外其他生物质，如细胞质，细胞膜等等，搭配利用有机溶剂将花
粉或孢子内外残留的分解物质溶解带出，相较现有制取方法，本发明方法在选择处理药品与溶剂上选择更加合适，提高每一步的效率，大大的缩短了整个流程的时耗，使其工业化生产更有效率，同时保证提取出的花粉或孢子壁材料完整。此外，本发明的制备方法利用常规的真空抽滤就可以完成，无特殊反应环境要求，设备场地门槛低，有利于产业推广和应用。本发明还建立了相关动物模型，将所获得的孢粉素微胶囊用于大鼠饲喂，证实了孢粉素微胶囊在高油饮食的大鼠中，有效控制其体重增长，且与正常组的结果一致。对于血液代谢中相关的脂类代谢物质tc(血清总胆固醇)、tg(总甘油三酯)、ldl-c(低密度脂蛋白)、hdl-c(高密度脂蛋白)也能得到很好地控制，与正常饮食组无异。实验结果很好的验证了孢粉素的体重控制效果，证实其应用于体重控制、降脂、阻断油脂吸收药物或保健品的优良前景。
[0089]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。