残留1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱分析方法与流程

1.本发明属于医疗器械检测分析技术领域，具体涉及一种交联剂1-乙基[3-(二甲 氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐(edc)的高效液相色谱分析方法。


背景技术：

[0002]
碳二亚胺是一类含有官能团-n＝c＝n-的化合物，其分子呈线性结构，能与胶原 蛋白中的羧基及氨基发生交联反应，改善胶原蛋白材料的性能，在此交联剂下制备 得到的胶原蛋白海绵具有疏松的多孔网络结构，良好的吸水率和耐降解性能。碳二 亚胺交联可克服胶原材料机械强度低、易被酶降解等缺陷，具有作为支架材料应用 于创伤修复的巨大潜能。目前有很多工艺中采用edc与其物质进行反应，如多糖、 胶原、多肽、高分子等，应用前景巨大。尤其是在胶原蛋白应用飞速发展的条件下， 采用edc对胶原蛋白进行改性，衍生其他产品，如：胶原海绵、人工皮肤、硬脑 膜等，但样品制备过程中edc可能过量，医疗器械中的残留需进行控制，所以定 量的测定化学改性中交联剂edc残留的是有必要的。
[0003]
目前有文献建立了一种多糖蛋白疫苗中残余碳二亚胺的检测方法，该方法使用 的是液相色谱及质谱联用技术(lc-mc)对碳二亚胺尿素衍生物进行定量分析。但 液质联用成本较高，并不是所有的企业及研究者可以普遍使用，在应用上受到了极 大的限制。申请号为201510239250.5的发明专利中公开了一种采用hplc-elsd检 测edc残留的方法，检测对象为edc，采用的是高效液相色谱仪及蒸发光散射检 测器，但该专利中提到的方法不适用于在水溶液中处理的样本，因为在水溶液中 edc会转化为edu，且为不可逆反应。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供了一种残留交联剂1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺 盐酸盐(edc)的高效液相色谱分析方法，该方法可通过高效液相色谱仪紫外检测 器(hplc-uv)进行检测重组类胶原蛋白海绵中的交联剂edc残留，从而保证重 组类胶原蛋白海绵的质量。
[0005]
本发明所述残留1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐的高效液相色谱 分析方法，包括如下步骤：
[0006]
(1)样品溶液的制备：取待测物加入超纯水中，于40～60℃浸提，使残留的 1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐水解成1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基 脲，然后用0.22μm水膜过滤，得到样品溶液；水解反应过程如下：
[0007][0008]
其中r1代表-ch
2-ch3(乙基)，r2代表-(ch2)
3-n-(ch3)2(二甲氨基丙基)；
[0009]
(2)配制1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲标准品溶液；
[0010]
(3)采用高效液相色谱法配合紫外检测器检测1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基 脲标准品溶液，记录同一保留时间下的峰面积；色谱条件为：色谱柱采用c18反相 柱，流动相为流动相a和流动相b体积比99：1～80：20的混合溶液，所述流动 相a为含0.1mm 1-庚烷磺酸钠、体积浓度0.04％三乙胺的水溶液并用磷酸调ph至 3，流动相b为乙腈，洗脱方式为等度洗脱；以1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲的 浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，根据标准品溶液的检测结果绘制标准曲线，得到 标准曲线方程；
[0011]
(4)按照步骤(3)的条件检测步骤(1)中样品溶液，代入步骤(3)得到的 标准曲线方程中计算出样品溶液中1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲的浓度，根据公 式：edc残留量＝edu浓度
×
样品溶液总体积/173
×
191/待测物质量
×
100％，计算待 测物中edc残留量，所述edc为1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]-碳二亚胺盐酸盐， edu为1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲。
[0012]
上述步骤(2)中，优选称取10mg 1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲标准品，置 于100ml容量瓶中，加超纯水至刻度线，摇晃使其充分溶解，得到100μg/ml的 1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲储备液；将1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基脲储备液 用超纯水分别稀释为3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml、24μg/ml、48μg/ml的1-[3-(二 甲氨基)丙基]-3-乙基脲标准品溶液。
[0013]
上述步骤(3)中，所述c18反相柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱 aq-c18 welch，其规格为4.6mm
×
250mm，填料孔径粒径5μm。
[0014]
上述步骤(3)中，优选进样体积为10～20μl，流速为0.8～1.2ml/min，柱温 为25～40℃，检测波长为200～210nm。
[0015]
上述步骤(3)中，进一步优选所述色谱柱进样前需用流动相平衡柱子120～ 150min。
[0016]
上述步骤(3)中，更进一步优选所述流动相为流动相a和流动相b体积比97： 3～95：5的混合溶液。
[0017]
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0018]
(1)检测时间短，减少了有机相的使用，为企业节省成本和减少对环境的污 染；且在进样时，使用的是混合流动相，减少了基线波动；
[0019]
(2)edu由于极性较强在c18柱上无保留而穿柱，且edu在200～210nm 的紫外吸收较弱，通过1-庚烷磺酸钠、三乙胺、磷酸等试剂延长了edu在c18柱 上的保留使其主峰达到合理的保留时间，同时加强了edu在色谱柱上的吸收，减 弱了其他杂质对edu的影响，检测限更敏感，达到纳克级别；精密度良好(重复 性rsd％《1.97％)，线性关系良好，检测限浓度为重组类胶原蛋白海绵交联剂edc 杂质规定限值的0.44％时，信噪比为3.71，各个浓度的回收率均在94％之上，回收 率良好，准确度高，耐用性良好(rsd％《2％)；
[0020]
(3)本方法相较于液质谱联用(lc-ms)、高效液相色谱仪联合蒸发光散射 检测器(hplc-elsd)更便宜、更普遍，从而降低企业成本，且操作简单，通过 调整流动相中的相关试剂，使其检测限达到40ng/ml，且edc转化为edu具有不 可逆性，直接检测edu结果更可靠、准确，稳定性更好，既可以满足企业生产的 高通量检测，也适用于实验室以研发为目的的检测。
附图说明
[0021]
图1是edu的标准曲线图。
[0022]
图2是本发明流动相对edu的检测限色谱图。
[0023]
图3是普通流动相对edu的检测限色谱图。
[0024]
图4是edu储备液的高效液相色谱图。
[0025]
图5是现配edc水溶液的高效液相色谱图。
[0026]
图6是edc水溶液放置7天后的高效液相色谱图。
[0027]
图7是重组类胶原蛋白海绵浸提液的高效液相色谱图。
具体实施方式
[0028]
下面结合附图和实施例对本发明进行说明，但本发明的保护范围并不仅限于这 些实例。
[0029]
实施例1
[0030]
1、样品溶液的制备：称取重组类胶原蛋白海绵100mg，用剪刀剪碎后置于离 心管中，加入2ml超纯水，并用封口膜密封离心管，在50℃水浴锅中浸提72h， 使重组类胶原蛋白海绵中残留的交联剂edc在超纯水中转换成edu；然后用 0.22μm的滤膜进行过滤，过滤后得到的重组类胶原蛋白海绵浸提液即为样品溶液。
[0031]
2、配制edu标准品溶液：称取10mg edu标准品，置于100ml容量瓶中， 加超纯水至刻度线，摇晃使其充分溶解，得到100μg/ml的edu储备液。将edu 储备液用超纯水分别稀释0、2、4、8、16倍，获得浓度为3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml、 24μg/ml、48μg/ml的edu标准品溶液。
[0032]
另外，称取10mg edc，置于100ml容量瓶中，加超纯水至刻度线，混匀放置 7天，备用；检测前再称取10mg edc，置于100ml容量瓶中，加超纯水至刻度线， 混匀备用。
[0033]
3、采用angilent infinity 1260ⅱ高效液相色谱仪配合紫外检测器检测edu标 准品溶液，记录同一保留时间下的峰面积；色谱条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷 键合硅胶柱(c18反相柱)aq-c18 welch，其规格为4.6mm
×
250mm， 填料孔径粒径5μm，流动相为流动相a和流动相b体积比97：3的混合溶 液，所述流动相a为含0.1mm 1-庚烷磺酸钠、体积浓度0.04％三乙胺的水溶液并用 磷酸调ph至3，流动相b为乙腈(色谱级fisher chemical)，进样前色谱柱先用 流动相150min，进样体积为20μl，流速为1ml/min，柱温为30℃，检测波长为 201nm，检测器为紫外检测器，洗脱方式为等度洗脱。以edu的浓度y为纵坐标， 峰面积x为横坐标，根据标准品溶液的检测结果绘制标准曲线，得到标准曲线方程： y＝0.039x 0.4939(见图1)，r2＝0.9995，线性关系良好。说明通过1-庚烷磺酸钠、 三乙胺、磷酸等试剂延长了edu在c18柱上的保留使其主峰达到合理的保留时间， 同时加强了edu在色谱柱上的吸收，减弱了其他杂质对edu的影响。检测限浓度 为重组类胶原蛋白海绵交联剂edc杂质规定限值的0.44％时，信噪比为3.71，检 测限达到40ng/ml，即40ng/ml*20μl＝800pg，色谱图见图2。
[0034]
若将上述流动相换成含体积浓度0.1％的三氟乙酸的超纯水(流动相a)和含体 积浓度0.1％的三氟乙酸的乙腈(流动相b)体积比97：3的混合溶液(普通流动相)， 结果显示其检测限值为微克级别，且其他成分对主峰影响较大，色谱图见图3。
[0035]
取上述edu储备液、放置7天的edc水溶液、现配edc水溶液，分别用超 纯水将其稀
释成9.05μg/ml的溶液，按照上述方法进行检测。通过高效液相色谱图 4～6对比，edu为最终产物。
[0036]
4、按照步骤3的条件检测步骤1中样品溶液，其色谱图见图7。将峰面积代入 步骤3得到的标准曲线方程中计算出样品溶液中1-乙基[3-(二甲氨基)-丙基]碳 二亚胺盐酸盐的浓度，根据公式：edc残留量＝edu浓度
×
样品溶液总体积/173
×
191/ 待测物质量
×
100％。结果显示，重组类胶原蛋白海绵中edc的残留量小于0.02％， 即edc的残留量小于9μg/ml。
[0037]
为了证明本发明的有益效果，对本发明的方法进行重复性、稳定性、加标回收 率以及样品检测实验，具体实验如下：
[0038]
1、重复性
[0039]
称取重组类胶原蛋白海绵若干，按照上述实施例1的方法制备成样品溶液，进 样20μl，重复进样6次，按照实施例1的色谱条件进行检测，记录同一保留时间下 的峰面积，结果见表1。
[0040]
表1重复性结果
[0041]
名称主峰保留时间峰面积峰高拖尾因子理论塔板数样品溶液-17.299166.14718.8721.1417018.9样品溶液-27.294171.65918.9881.1416743.1样品溶液-37.285170.43019.1811.1416901.59样品溶液-47.279171.23819.2791.1416946.11样品溶液-57.274175.43319.5491.1816865.19样品溶液-67.27174.89519.6041.1616865.65标准偏差sd0.0113.370.294
‑‑‑‑
算术平均值xbar7.284171.63319.246
‑‑‑‑
相对标准偏差rsd(％)0.161.961.53
‑‑‑‑
[0042]
以上数据证明所用高效液相色谱仪精密度良好。
[0043]
2、稳定性
[0044]
取样品溶液，将其在室温下放置0h、4h、24h、48h、96h，检测杨品液放置0h、 4h、24h、48h、96h的稳定性，精密吸取20μl的样品溶液，注入高效液相色谱仪 中，按照实施例1的色谱条件进行检测，记录同一保留时间下的峰面积，检测结果 见表2。
[0045]
表2稳定性检测结果
[0046]
名称峰面积峰高理论塔板数样品溶液0h433.00648.20416803.10样品溶液0h430.95148.07416834.84样品溶液4h438.73449.32716947.52样品溶液4h432.47649.33216997.93样品溶液24h452.56250.69116908.13样品溶液24h455.00150.76216860.88样品溶液48h448.59250.52916651.98样品溶液48h446.71850.53716671.07
样品溶液96h437.21246.04915683.01样品溶液96h438.52646.25115746.76标准偏差sd8.70
‑‑‑‑
算术平均值xbar441.378
‑‑‑‑
相对标准偏差rsd(％)1.97
‑‑‑‑
[0047]
上述数据证明样品溶液在室温放置96h后，样品溶液的性质稳定，放置时间对 样品中edu杂质在96h内没有影响，证明edc转化为edu的不可逆性。
[0048]
3、加标回收率
[0049]
称取重组类胶原蛋白海绵若干，按照上述实施例1的方法制备成供试品溶液； 精密称量edu 0.2mg置于10ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度线，混匀，作为对 照品溶液。取上述供试品溶液加入不同体积的对照品溶液，制备成加样回收的样品 溶液，按照实施例1的色谱条件进行检测。按照下述公式计算加样回收率：加样回 收率＝回收率％＝(c-a)/b*100％，式中a为供试品溶液所含被测成分量；b为加入 对照品的量；c为实测值。结果见表3。
[0050]
表3加标回收率结果
[0051][0052]
注：对照品2.4-1中的2.4表示取20μg/ml的对照品溶液2.4ml，加水定容至10ml，混匀，
ꢀ‑
1代表平行样1。样 对2.4-1-1中的2.4代表取20μg/ml的对照品溶液2.4ml，加入供试
品溶液 3ml，再定容至10ml，-1-1代表第1组样品的平行样1，样 对3.6-2-2中的3.6代表取20μg/ml 的对照品溶液3.6ml，加入供试品溶液3ml，再定容至10ml，-2-2代表第2组样品的平行样2. 其余代表的意思与上述相同。
[0053]
由表3可见，当edu含量在0.1％～1％之间时，回收率限度为90％～108％之 间，实际检测中高低浓度的回收率为95％，加样回收率良好。
[0054]
4.样品检测
[0055]
称取连续三批重组类胶原蛋白海绵样品，按照上述实施例1的方法制备成样品 溶液，并按照实施例1的色谱条件进行检测，记录同一保留时间下的峰面积，检测 结果见表4。
[0056]
表4样品检测结果
[0057]
名称主峰保留时间峰面积峰高拖尾因子理论塔板数含量％15-17.114145.55516.7801.1816664.160.014％15-27.113144.90816.7601.1916698.240.013％15-37.111144.62116.7371.1816695.040.013％29-17.108124.03214.4901.1516977.490.012％29-27.106125.14514.5271.1616786.460.012％29-37.103123.96114.5081.1516993.170.012％05-17.099202.66423.5141.2016644.250.018％05-27.096202.34923.5681.1816741.640.018％05-37.093203.01323.6091.2016726.950.018％
[0058]
注：表中15、29、05为三批样品，其后的-1、-2、-3代表每批样品做三个平行。
[0059]
上述检测结果含量值均低于限定值，结果合格。
[0060]
上述实施例仅为对重组类胶原蛋白海绵中交联剂edc残留量检测方法，但不 限于重组类胶原蛋白海绵，对于其他物质中交联剂edc的检测，本方法皆适用。