一种鹿茸脱细胞基质水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物技术领域，特别是一种鹿茸脱细胞基质水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.鹿茸作为哺乳动物中唯一能够周期性再生的哺乳动物器官，其具有令人惊讶的生长速度，每天可以生产2cm左右，而这种超快的生长速度主要是由其尖部的间充质组织所引起的，间充质组织主要由干细胞及其分泌物组成，所以其中含有丰富的生物活性物质。
3.同时，鹿茸内部组织在以2cm/天的速度生长的同时，其外部的皮肤组织也在以20-30cm2的速度扩展，这种扩展速度主要有两方面的因素：其一是机械力，其二是鹿茸内部组织，即间充质组织中的活性物质作用。
4.目前一般的脱细胞基质水凝胶都是采用皮、膀胱等组织作为原料制得，这些组织都是成年动物的组织，相较于具有干细胞特性的鹿茸间充质组织而言，含有较少的生物活性物质，其在促皮肤伤口愈合中发挥的作用较差。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鹿茸脱细胞基质水凝胶及其制备方法和应用；通过对鹿茸间充质组织进行切块、冲洗、研磨、消化、震荡等处理制得纯度高、透明度好的鹿茸脱细胞基质水凝胶；将该鹿茸脱细胞基质水凝胶应用于皮肤伤口治疗中，取得了极为显著的疗效。
6.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
7.一种鹿茸脱细胞基质水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
8.s1采集梅花鹿二杠茸或三叉茸，切取顶端1.0-1.5cm的组织，并拨去组织上的茸皮，得到鹿茸间充质组织；
9.s2将所述鹿茸间充质组织切成小块，用生理盐水冲洗，并于液氮中研磨，获得鹿茸间充质组织粉末；
10.s3将所述鹿茸间充质组织粉末和胃蛋白酶加入0.01m hcl中并持续振荡46-50h，其后添加0.1m naoh直至使溶液ph＞7，最后向溶液中添加10
×
pbs并静置，得到所述鹿茸脱细胞基质水凝胶。
11.本发明通过对鹿茸间充质组织进行切块、冲洗、研磨、消化、震荡等处理制得鹿茸脱细胞基质水凝胶；通过本发明制备的鹿茸脱细胞基质水凝胶成胶效果以及品质极好，且细胞脱出程度高，极大程度降低细胞用于伤口治疗时发生免疫反应；此外，制得的脱细胞基质水凝胶中含有很多鹿茸间充质组织中的活性物质，其对于促进伤口愈合发挥积极的作用。
12.作为本发明的优选方案，所述步骤s2中的小块边长为0.8-1.2毫米。本方案中，通过进一步限定组织小块的边长，能够提高组织小块冲洗以及研磨效率，进而提高鹿茸脱细
胞基质水凝胶的制备效率。
13.作为本发明的优选方案，所述步骤s3中，持续震荡时间为48h。本方案中，进一步限定震荡时间为48h，该时间能够使鹿茸间充质组织粉末消化完全，避免消化时间过长对鹿茸间充质组织中的生物活性因子产生影响以及降低水凝胶制备效率。
14.作为本发明的优选方案，所述步骤s3中，持续震荡的温度为25℃，速度为200rpm。本方案中，通过将温度设为25℃，能够使间充质组织的生物活性因子始终保持活性，避免温度过高导致其失活，从而降低鹿茸脱细胞基质水凝胶中的生物活性因子，导致鹿茸脱细胞基质水凝胶对皮肤伤口的愈合能力降低。优选的，所述步骤s3中，加入naoh后，溶液ph为7.4。本方案中，通过将ph限定为7.4，能够使溶液更好成胶，且提高鹿茸脱细胞基质水凝胶的透明度，进而提高鹿茸脱细胞基质水凝胶的品质。
15.作为本发明的优选方案，所述鹿茸间充质组织粉末、胃蛋白酶和0.01m hcl三者的比例为10:1:1(w:w:v)。本方案中，10:1:1(w:w:v)为鹿茸间充质组织粉末、胃蛋白酶和0.01m hcl三者之间的最佳比例，其能够进一步促进鹿茸间充质组织消化，提高细胞脱出效率，提高鹿茸脱细胞基质水凝胶的制备效率以及品质。
16.本发明还提供了一种鹿茸脱细胞基质水凝胶在制备促皮肤伤口愈合药物中的运用。
17.本发明的有益效果是：
18.1.鹿茸间充质干细胞组织是一种干细胞组织，具有很多的生物活性因子，本发明首次采用该组织制备鹿茸脱细胞基质水凝胶，通过优化反应参数以及反应步骤，在制备过程中极大程度降低了生物活性因子的损失，使制得的水凝胶中含有大量的生物活性因子，对皮肤伤口的愈合发挥极为重要的的作用。
19.2.本发明的制备方法能够较为完全的将鹿茸干细胞脱出，使制得的水凝胶纯度较高，极大程度降低了水凝胶在治疗伤口愈合过程中因残留细胞而产生免疫反应，对伤口产生不利影响；此外，本发明制备的鹿茸脱细胞基质水凝胶成胶效果以及透明度极好，品质极佳。
20.3.本发明制备的鹿茸脱细胞基质水凝胶在治疗伤口愈合方面的效果优于商用hydromatrix(sigma-aldrich，usa)与表皮生长因子(egf)组合后产生的作用效果；此外，商用hydromatrix(sigma-aldrich，usa)价钱较贵(约3000元/5ml)，导致其难以大范围应用，而本发明的水凝胶制备方法简单，成本较低，有利于市场推广；同时因鹿茸干细胞增值速度快，因此其获取极为便利，可以大量制备水凝胶，并能够广泛运用于市场，提高鹿茸脱细胞基质水凝胶的商业价值，并进一步提高鹿茸的科技产值及促进鹿茸价值的深度开发。
附图说明：
21.图1：鹿茸脱细胞基质水凝胶(armh)的表征；
22.其中，1a.armh制备过程；1b.armh(右)和冻干armh(左)；1c.扫描电镜结果；
23.其中，
24.图2：细胞培养中armh最佳浓度的筛选；
25.图3：harm对全层皮肤缺损大鼠伤口愈合率和疤痕形成的影响；
26.其中，3a.实验流程设计；3b.伤口愈合过程的形态观察；3c.使用image j软件对伤
口区域进行量化；dpw，受伤后天数，n＝10；平均值
±
sem；*p《0.05，***p《0.001；
27.图4：armh对大鼠创伤愈合过程中皮肤附属器再生水平的影响；
28.其中，4a.15dpw和30dpw时愈合组织的he和masson染色结果；15dpw(4b，4c)和30dpw(4d，4e)时皮肤附属器数量和胶原纤维水平的统计数据；n＝3；平均值
±
sem；在*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，ns：无显著性。
29.图5：armh对大鼠皮肤伤口愈合中血管生成的影响；
30.其中：5a-5c.15dpw时愈合组织cd31和fgf2免疫荧光染色及统计结果；5d-5f.30dpw时愈合组织cd31和fgf2免疫荧光染色及统计结果；n＝3；平均值
±
sem；在**p《0.01，*p《0.001，ns：无显著性。
具体实施方式
31.下面结合实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下。
32.实施例1鹿茸脱细胞基质水凝胶的制备(制备流程如图1a所示)
33.s1采集梅花鹿二杠茸或三叉茸，切取顶端1.0-1.5cm的组织，并拨去组织上的茸皮，得到鹿茸间充质组织(reserve mesenchyme,rm)；
34.s2将所述鹿茸间充质组织切成边长为0.8毫米的小块，用生理盐水冲洗，并于液氮中研磨，获得鹿茸间充质组织粉末；
35.s3将所述鹿茸间充质组织粉末和胃蛋白酶在0.01m hcl中以10:1:1(w:w:v)的比例混合，在温度为25℃，以速度200rpm的恒定速率持续振荡48h；其后添加0.1m naoh使胃蛋白酶失活，并将所得溶液(ph值为3.0-4.0)的ph值调节至7.4，最后向溶液中添加10
×
pbs，并在37℃下静置1小时，得到所述鹿茸脱细胞基质水凝胶，即armh(图1b右)，通过图1b右可知，制得的鹿茸脱细胞基质水凝胶透明度好、纯度高、成胶能力强，具有极高的品质。
36.将所述鹿茸脱细胞基质水凝胶在-80℃下冷冻，然后冻干以获得干粉(图1b左)，使用扫描电子显微镜检测冻干后水凝胶的表面形态。
37.实施例2鹿茸脱细胞基质水凝胶的表征和体外评估
38.使用扫描电镜评估实施例1中冻干后水凝胶的微观结构(图1c)。
39.结果表明，armh具有一个相互连通的孔隙网络，其孔径约为100μm，armh中含有丰富的孔隙，表明水凝胶的主要成分是水，有利于细胞增殖。
40.同时，还体外评估了armh与四种不同类型的细胞的生物相容性。
41.四种不同类型的细胞系，包括人脐静脉内皮细胞(huvec)、小鼠胚胎成纤维细胞(nih 3t3)、脂肪间充质干细胞(adsc)和骨髓间充质干细胞(bmsc)；这四种细胞分别在不同浓度(0、10、20、30、40μg/ml)的armh中培养7天，通过cck-8测定细胞增殖能力。cck-8分析结果(图2)显示，20μg/ml的armh浓度对四种细胞系的增殖刺激作用最强，n＝3；平均值
±
sem。
42.实验例
43.动物实验方案如图3a所示，具体实验步骤如下：
44.(1)大鼠皮肤全皮层缺损模型的建立
45.实验大鼠于spf级动物饲养室中自由饮水采食，适应性生存一周后进行皮肤损伤建模。以3％的戊巴比妥钠麻醉大鼠(30mg/kg；腹腔注射)，然后用宠物剃毛器剔除大鼠背
毛，经1％碘伏及75％乙醇常规消毒后，用直径为12mm的环形皮肤取样器切除背部正中位置的全皮层皮肤，建立大鼠背部皮肤全皮层缺损模型。术后给予青霉素消炎(20000u/kg；肌注；每天一次，持续3天)和曲马多镇痛(50mg/kg；肌注；每天一次，持续3天)。
46.(2)分组与给药处理
47.建模后的大鼠随机分为3组，每组8只，分别为armh组、阴性对照组和阳性对照组。其中，armh组药物为：浓度为20μg/ml的鹿茸间充质组织脱细胞基质水凝胶(armh)，具体配置方式为将实施例1所制备的armh用1
×
pbs稀释至20μg/ml。
48.给药方式为：
49.在前15天内，通过伤口周围局部注射(100μl)及伤口表面涂抹(100μl)armh组药物进行治疗，每5天一次；后15天内，只通过局部注射(100μl)armh组药物进行治疗。
50.阴性对照组(n-ctrl)药物为：1
×
pbs混合hydromatrix(sigma-aldrich，usa)；
51.给药方式为：在前15天内，通过伤口周围局部注射(100μl)及伤口表面涂抹(100μl)阴性对照组药物进行治疗，每5天一次；后15天内，只通过局部注射(100μl)阴性对照组药物进行治疗。
52.阳性对照组(p-ctrl)药物为：表皮生长因子(egf；beyotime，中国)(20μg/ml)混合hydromatrix(sigma-aldrich，usa)。
53.给药方式为：在前15天内，通过伤口周围局部注射(100μl)及伤口表面涂抹(100μl)阳性对照组药物进行治疗，每5天一次；后15天内，只通过局部注射(100μl)阳性对照组药物进行治疗。
54.实验结果
55.(1)armh加速伤口愈合速度，减少疤痕形成
56.结果显示(图3b，3c)，伤后5天或10天，armh组的伤口和疤痕面积明显小于n-ctrl和p-ctrl组(p《0.001)；伤后20天时，armh组的伤口愈合完成，但n-ctrl和p-ctrl组的伤口仍处在愈合期；伤后30天时，n-ctrl和p-ctrl组创面愈合均完成，但是，与armh组相比，疤痕更为明显。
57.结果表明：armh可以提高大鼠全层皮肤创伤的愈合速度，减少疤痕形成。
58.(2)armh增加皮肤附属器的再生数量，减少胶原纤维的异常聚集
59.组织学研究发现，在伤后15天时(图4a，4b，4c)，armh组皮肤损伤大鼠的愈合组织显示出比n-ctrl和p-ctrl组更多的皮肤附属器以及更少的胶原纤维水平(p《0.001)，在伤后30天时(图4a，4d，4e)，与n-ctrl和p-ctr组相比，armh组的皮肤也显示出更多的附属物和更少的胶原纤维水平(p《0.01)。
60.结果表明：在全层皮肤缺损大鼠的伤口愈合过程中，armh能促进皮肤附属器的再生，并减少异常胶原积累。
61.(3)armh促进伤口愈合中的血管生成
62.血管生成对伤口愈合至关重要，通过免疫荧光染色，检测了armh对损伤皮肤血管生成的影响。
63.结果显示，在伤后15或30天时(图5)，与n-ctrl和p-ctr组相比，armh组的皮肤显示出了更多的cd31(血管内皮细胞的经典标记物)和fgf-2(一种非常有效的促血管生成有丝分裂原和生长因子)表达水平。
64.结果表明，在全层皮肤缺损大鼠的伤口愈合过程中，armh能促进血管网络的重建。
65.以上仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。