一种含人参皂苷Rb组分的提取物及其在抗肿瘤方面的应用的制作方法

一种含人参皂苷rb组分的提取物及其在抗肿瘤方面的应用
技术领域
1.本发明涉及药物领域，具体而言，涉及一种含人参皂苷rb组分的提取物及其在抗肿瘤方面的应用。


背景技术：

2.近年来，随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，癌症的发生率逐年增高，癌症的致死率仅次于心脑血管疾病，是威胁人类健康的第二大“杀手”。目前临床上应用的抗癌药物种类繁多，但价格昂贵，且毒副作用大多都很严重，尚没有能够治疗癌症的特效药出现。2003年，人参皂苷rg3参一胶囊研制成功，在医学界和社会上引起了强烈反响，它是新中国成立以来，我国独立开发、完全拥有自主知识产权的第一个中药一类单体制剂的抗癌新药。自此之后，人参皂苷类成分成为抗癌领域的研究热点。
3.西洋参茎叶是西洋参庞大的地上资源，但目前这部分资源多被当作废弃物处理。然而有调查显示西洋参茎叶中的人参皂苷含量较高于其他药用部分，且种类与主根基本一致，部分皂苷单体的含量甚至高于根，因此西洋参茎叶能够作为人参皂苷的可靠来源，具有很高的开发利用价值。
4.人参皂苷rb是五加科植物人参、西洋参、三七等的主要药理活性成分，主要存在于人参的根、花蕾、茎叶和西洋参的根、茎叶以及三七的茎叶中。目前，国内外对于人参皂苷rb的药理活性的研究主要集中在心血管疾病和神经系统疾病方面。此外，人参皂苷rb还具有抗糖尿病、抗肥胖、抗抑郁等生物活性。但西洋参茎叶中含人参皂苷rb组分的提取物是否对于癌症治疗具有有利作用，目前国内外尚未见相关报道。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.基于背景技术中所述的状况，本技术提出了一种含人参皂苷rb组分的提取物及其在抗肿瘤方面的应用。从西洋参根茎中提取含有人参皂苷rb的组分，并将其联合顺铂应用于抗肿瘤方面。结果显示，联合应用后，能够明显降低顺铂的副作用。
7.为了实现上述目的，本技术采取的技术方案如下：
8.一种含人参皂苷rb组分的提取物，所述的提取物为从西洋参茎叶中提取而得。
9.所述的rb组分的提取物含有人参皂苷rb1、人参皂苷rb2、人参皂苷rb3三种组分(三种人参皂苷的结构式如图6所示)。
10.所述的人参皂苷rb1、人参皂苷rb2、人参皂苷rb3的质量分数分别为10％-20％，10％-20％，50％-60％。
11.所述的含人参皂苷rb组分的提取物的应用，在抗肿瘤方面的应用。
12.所述的含人参皂苷rb组分的提取物的应用，在对体外肝癌细胞bel-7402增殖抑制方面的应用。
13.所述的含人参皂苷rb组分的提取物的应用，在抗肿瘤方面的应用，应用方法为与
顺铂联合应用，顺铂：1mg/kg，0.2ml/只，组分m：14mg/kg，0.2ml/只；顺铂给药方式为腹腔注射，连续给药3天，停7天，再连续给药3天，停3天；组分m每日灌胃1次，连续用药16天。
14.所述的含人参皂苷rb组分的提取物的应用，在顺铂抗肿瘤药性增效方面的应用。
15.所述的含人参皂苷rb组分的提取物的应用，在抑制顺铂药物对机体毒性的抑毒药物中的应用
16.所述的含人参皂苷rb组分的提取物的应用，应用的作用机体为小鼠外周血。
17.所述的含人参皂苷rb组分的提取物的应用，所述肿瘤包括h
22
肝癌。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
19.本发明中，首次提出并证实了西洋参茎叶中一种含人参皂苷rb组分的提取物(命名为m)体外实验显示出显著的抗癌活性，并且组分m联合顺铂的体内实验表明m能够协同抗肿瘤并降低顺铂副作用。因而，本发明提供了将组分m在治疗癌症方面的应用，为开发和扩大组分m的药物应用提供了基础。
附图说明
20.图1是本发明具体实施方式中4组细胞用药24h后的显微成像
×
200(a：肝癌7402细胞正常形态；b：1mg/ml rg3组；c：0.1mg/ml顺铂组；d：1mg/ml m组)；
21.图2是本发明具体实施方式中0.05-1mg/ml组分m对肝癌7402细胞增殖的抑制作用；
22.图3是本发明实施例中各组小鼠体重随时间变化；
23.图4是本发明实施例中各组小鼠瘤体积随时间变化；
24.图5是本发明实施例中m对顺铂1mg
·
kg-1
·
d-1
i.p.引起的小鼠外周血象变化的影响。
25.图6是人参皂苷rb1、人参皂苷rb2、人参皂苷rb3的结构式。
具体实施方式
26.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
27.虽然有研究表明，人参皂苷rg3等具有一定的抗肿瘤作用，然而对于西洋参茎叶中一种含人参皂苷rb组分的提取物的药用研究，特别是在抗肿瘤方面的研究，还没有相关的研究报道。有鉴于在西洋参茎叶中一种含人参皂苷rb组分的提取物抗肿瘤领域的研究空白，特提出本发明。
28.本发明中，是以西洋参茎叶中一种含人参皂苷rb组分的提取物进行抗肿瘤治疗的应用性实验，并通过实验证明组分m具有抗肿瘤的潜在药用价值。
29.组分m的制备方法如下
30.薄层硅胶板的制备g薄层硅胶∶水按照2∶5(g/ml)的比例调和均匀，湿法铺板，自然晾干，使用前需105℃活化40min。
31.薄层色谱显色剂的配制10％硫酸乙醇溶液：取浓硫酸10.2ml，加无水乙醇稀释至
100ml，即得。
32.氯仿∶甲醇∶水＝13∶7∶2为展开剂，10％硫酸乙醇为显色剂。
33.按茎∶叶(g/g)1∶1比例的西洋参茎叶截成段，放进烘箱中烘干12h。将烘干的茎叶粉碎过20目筛，备用。采用蒸馏水浸提法对西洋参茎叶皂苷进行提取，称取西洋参茎叶干燥粉末1000g，适量蒸馏水浸泡30min后，按照料液比1∶16，提取温度100℃，提取时间3.2h，进行皂苷提取，煎煮3次，合并提取液，浓缩至皂苷浓度为60mg/ml，上样于d101大孔树脂(径高比1∶8)，吸附速度为1ml/min，5倍柱体积蒸馏水洗至无色，再用4倍柱体积的90％乙醇洗脱，浓缩醇洗脱部位得浸膏。蒸馏水溶解得到水溶液，同体积的水饱和正丁醇萃取4次，合并正丁醇部位，浓缩得到西洋参茎叶总皂苷粉末。取西洋参茎叶总皂苷20g，用甲醇溶解后倒入100-200目硅胶(1∶2)拌样，使样品完全吸附在硅胶上，烘干，备用。取200-300目硅胶湿法装柱，采用的洗脱剂比例(乙酸乙酯∶乙醇∶水＝6∶1∶2或5∶1∶2或9∶2∶4)，采用薄层色谱法(tcl)进行追踪，可收到组分m(主要含有10％-20％人参皂苷rb1，10％-20％人参皂苷rb2，50％-60％人参皂苷rb3)。
34.本发明选用人肝癌细胞株(bel-7402)进行组分m的体外抗肝癌活性实验：
35.加药观察细胞形态
36.胰酶消化对数生长期的bel-7402细胞，加入1640培养基终止消化后，离心，收集细胞，用含10％胎牛血清和1％双抗的1640培养基调整细胞计数至5
×
104个/ml左右。将5
×
104个/ml的单细胞悬液以每孔100μl的体积接种于96孔板中，培养箱中培养24h。
37.弃去培养基，分别加入100μl溶剂对照(终浓度0.1％dmso)、西药阳性对照顺铂(终浓度为0.1mg/ml)，中药阳性对照rg3(高浓度为1mg/ml；低浓度为0.5mg/ml)、组分m(高浓度为1mg/ml；低浓度为0.5mg/ml)，每组5复孔，置于培养箱中培养24h，倒置显微镜下观察细胞形态。
38.mtt实验测定细胞存活率
39.于培养结束前4h，各培养孔加入20μl的浓度为5mg/ml的mtt，37℃下孵育4h，取出。3000rmp离心5min，去孔内上清液，每孔加入100μl的dmso，震荡10min。用酶联免疫检测仪在490nm测定波长下测定各孔光密度值(od值)，并计算细胞抑制率。平行3次实验，计算平均值。
[0040][0041]
采用spss 17.0统计软件，单因素方差分析比较组间差异的显著性，以p＝0.05为检验水准。
[0042]
组分m的ic
50
测定
[0043]
取组分m配置0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.5mg/ml，0.8mg/ml，1mg/ml溶液，采用mtt实验测定对bel-7402细胞增殖的抑制率。
[0044]
以上bel-7402给药后所得的结果及结论：加药后观察细胞形态，如图1(a为肝癌7402细胞正常形态；b为1mg/ml rg3组肝癌细胞形态；c为0.1mg/ml顺铂组肝癌细胞形态；d为1mg/ml m组肝癌细胞形态)所示，bel-7402细胞的正常形态比较圆润饱满，呈现多角形，用药后，1mg/ml顺铂组及1mg/mlrg3组细胞均萎缩散落，另外，1mg/ml的m组细胞也呈现明显的萎缩状态，可以初步判断药物对肝癌细胞增殖的抑制作用。mtt实验测定细胞存活率，顺
铂抑瘤率为71.76％，其他药物在相同浓度(1mg/ml)下，rg3抑瘤率57.28％，组分m抑制作用最明显，m(1mg/ml)抑瘤率为99.41％，m(0.5mg/ml)抑瘤率为68.49％。组分m的ic
50
测定，如图2所示，组分m对肝癌细胞的抑制率存在明显的量-效关系。采用spss17.0统计软件分析，可知组分m的ic
50
为257μg/ml。
[0045]
本发明将健康昆明小鼠随机分组后，除了空白对照组，其它组别通过小鼠h22型肝癌瘤株接种于昆明小鼠右腋下制成荷瘤模型，并进行动物给药实验：
[0046]
空白对照组、荷瘤对照组：每日给以等量生理盐水灌胃；
[0047]
单独顺铂组：腹腔注射，连续给药3天，停7天，再连续给药3天，停3天，给药剂量(1mg/kg，0.2ml/只)；
[0048]
顺铂 参一胶囊组：参一胶囊每日灌胃，连续给药16天，给药剂量(70mg/kg，0.2ml/只)，顺铂给药方案与单独顺铂组相同；
[0049]
单独m组：每日灌胃，连续给药16天，给药剂量(14mg/kg，0.2ml/只)；
[0050]
顺铂 m组：顺铂给药方案与单独顺铂组相同，m给药方案与单独m组相同。
[0051]
治疗期间，每天观察小鼠基本状态并隔天测小鼠体重和肿瘤体积。治疗结束后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，腹主动脉取血进行血常规检测；取血后，剥瘤及胸腺、脾脏并称重，计算抑瘤率及脏器指数。
[0052]
以上动物给药实验后所得的结果表明：组分m与顺铂化疗联合后可以增强顺铂对于h22肝癌小鼠肿瘤生长的抑制作用，并且m可以在一定程度上降低顺铂引起副作用，起到“增效减毒”的作用。
[0053]
具体可见以下的实施例，通过实施例可以进一步的理解本发明。
[0054]
实施例1
[0055]
本实施例涉及的是组分m联合顺铂化疗抑制h
22
肝癌生长作用的研究。
[0056]
实验材料
[0057]
组分m(自制)；顺铂(sigma公司)；参一胶囊(吉林亚泰制药集团有限公司，每粒含有人参皂苷rg310mg)；碘酒、医用酒精、生理盐水(山东中医药大学校医务室)
[0058]
实验动物
[0059]
健康昆明小鼠60只，雌雄各半，体重18-22g，月龄1-1.5月(由山东大学实验动物中心提供)，动物合格证号：scxk鲁20130001，实验环境：温度20-22℃，相对湿度45％-50％。
[0060]
肝癌肿瘤瘤株
[0061]h22
型肝癌瘤株(由山东省医学科学院提供)，昆明小鼠腹腔内传代。
[0062]
仪器
[0063]
超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，电子天平(上海平轩科学仪器有限公司)；3k-18台式离心机(美国sigma公司)；xds-1b倒置显微镜(日本olympus公司)；移液枪(2-1000μl)(法国gilson公司)；-20℃低温冰箱(haier)。
[0064]
实验方法
[0065]
移植瘤液的制备
[0066]
在无菌条件下，于超净工作台上，从接种h22型肝癌瘤株8天的小鼠腹腔中抽取腹水，呈淡乳白色，经过生理盐水1∶2稀释，充分混匀后，将瘤细胞悬液置于冰盘上，在血细胞计数板上计算活细胞数，调整浓度至1
×
107个/ml，置于冰盘中保存。
[0067]
实验分组、造模及给药
[0068]
将60只健康昆明小鼠随机分为6组，每组10只。分别为：空白对照组(a组)，荷瘤对照组(b组)，单独顺铂组(c组)，顺铂 参一胶囊组(d组)，单独m组(e组)，顺铂 m组(f组)。
[0069]
碘酒和75％酒精消毒预接种的小鼠右腋部的皮肤，用1ml注射器抽取0.2ml瘤细胞悬液，然后注入b-f组昆明小鼠的右腋部皮下接种，接种24h后给药，接种成功率100％。
[0070]
24小时内禁食不禁水，24小时后称量各组小鼠体重，以一定剂量给药。a组：0.9％ns，0.2ml/只；b组：0.9％ns，0.2ml/只；c组顺铂：1mg/kg，0.2ml/只；d组顺铂：1mg/kg，0.2ml/只，参一胶囊：70mg/kg，0.2ml/只；e组单独m：14mg/kg，0.2ml/只；f组顺铂：1mg/kg，0.2ml/只，组分m：14mg/kg，0.2ml/只。顺铂给药方式为腹腔注射，连续给药3天，停7天，再连续给药3天，停3天。其他各组每日灌胃1次，连续用药16天。
[0071]
观测项目
[0072]
一般项目
[0073]
造模用药后，每天观察动物房气温、湿度、小鼠进食、饮水、活动、睡眠、精神状态、毛色变化及死亡等现象，并作详细记录。
[0074]
小鼠体重及瘤体积的动态变化
[0075]
采用游标卡尺测量每只小鼠肿瘤体积的长径(l)和短径(w)，按steel公式计算肿瘤体积：v＝lw2/2，每2天测定一次，计算每组小鼠瘤体积平均值，测算小鼠肿瘤体积的变化情况；同时测量小鼠体重变化。以时间为横轴、体重和瘤体积各自为纵轴，描绘肿瘤体积及小鼠体重动态变化曲线。
[0076]
计算抑瘤率和胸腺、脾脏指数
[0077]
取血后，解剖小鼠，完整剥离瘤组织，去除非瘤组织，称重后计算抑瘤率。随后摘取小鼠的胸腺、脾脏，称重后计算其脏器指数。其公式分别为：抑瘤率＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)
×
100％；脏器指数＝脏器重量mg/(小鼠体重-瘤重)g
[0078]
联合用药效果按金正均q值法判断：
[0079][0080]
q＜0.85为拮抗；0.85≤q＜1.15为相加；a≥1.15为协同
[0081]
血常规检测
[0082]
腹腔注射0.4ml 0.15％戊巴比妥钠麻醉小鼠，沿腹中线皮肤切开腹腔，使腹主动脉清除暴露，用1ml注射器快速吸取血液，存放于edta抗凝管中，采用血细胞分析仪检测红细胞计数(rbc)、白细胞计数(wbc)、血小板计数(plt)、淋巴细胞(ly)、中性粒细胞(gra)。
[0083]
实验结果
[0084]
一般情况
[0085]
由图3(a为空白对照组；b为荷瘤对照组；c为单独顺铂组；d为顺铂 参一胶囊组；e为单独m组；f为顺铂 m组)可以明显看出，顺铂组小鼠体重与正常组小鼠比较显著降低，体现了顺铂减轻体重的副作用。实验过程中荷瘤对照组小鼠死亡2只，单独顺铂组死亡1只，其他各组未出现死亡情况，体重变化如图3所示。用药后，(1)空白组小鼠进食、饮水良好，体重平稳增加，对刺激反应灵敏，毛色光泽；(2)荷瘤对照组小鼠精神萎靡，活动量明显减少，饮食饮水量较少，反应迟钝，毛色枯槁；(3)单独顺铂组小鼠体重增加不明显，进食、饮水量少，
毛色欠光泽，体态消瘦，精神状态欠佳；(4)顺铂 参一组小鼠体重有所增加，进食饮水量良好，毛色较光泽，对刺激反应稍微迟钝；(5)单独m组小鼠体重有所增加，饮食饮水量较少，精神欠佳，毛色较光泽，对刺激反应较灵敏；(6)顺铂 m组小鼠从第8天开始出现饮食、饮水量减少，体重有所增加，对刺激反应灵敏，毛色光泽，体态较消瘦。
[0086]
小鼠瘤体积的动态变化
[0087]
从图4(a为空白对照组；b为荷瘤对照组；c为单独顺铂组；d为顺铂 参一胶囊组；e为单独m组；f为顺铂 m组)瘤体积变化曲线可以看出，生理盐水组小鼠瘤体积增长迅速，最后达到3.2cm3，而其他组小鼠瘤体积和生理盐水组比较均较小，其中m联合顺铂组瘤体积增长最慢，瘤体积小于单独顺铂组合单独m组，提示m与顺铂合用可以起到增强抗癌效果。
[0088]
抑瘤率及联合抑瘤率
[0089]
由表1可以看出，顺铂在1mg/kg的给药剂量下，单独抑瘤率为49.52％，和参一胶囊联用，抑瘤率有所提高，达到53.36％。组分m在14mg/kg的给药剂量下，单独抑瘤率为33.65％，与对照组相比，并没有显著性差异。当顺铂与组分m联合使用时，抑癌效果最强，可达85.94％，且与顺铂联用组q值为1.29＞1.15，说明顺铂与组分m具有协同抗肿瘤作用。
[0090]
表1各组h
22
荷瘤小鼠抑瘤率
[0091][0092]
注：与荷瘤对照组比较，
δ
p＜0.05；与顺铂组比较，*p＜0.05
[0093]
脾脏指数与胸腺指数
[0094]
从表2中可以看出，顺铂组和顺铂-m联用组小鼠的脾脏、胸腺指数与对照组相比有显著的降低，说明顺铂能够造成免疫抑制，虽然联合组两项指数与单独顺铂组相比有所提高，但没有显著性差异，说明组分m并不能明显减轻该副作用。顺铂-参一胶囊联用组小鼠脾脏、胸腺指数与单独顺铂组相比，有显著提高，且胸腺指数与对照组相比没有显著性差异，体现了参一胶囊的“减毒”功效。
[0095]
表2各组h
22
荷瘤小鼠脾脏、胸腺指数
[0096]
[0097]
注：与荷瘤对照组比较，
δ
p＜0.05；与顺铂组比较，*p＜0.05
[0098]
血常规检测
[0099]
顺铂等化疗药物一般均会抑制机体的骨髓造血功能，促使造血干细胞凋亡，引起机体外周白细胞、血小板、淋巴细胞等的降低，产生化疗毒副作用。由表3可以看出，c、d、f组均为使用顺铂组小鼠，其白细胞、红细胞、血小板、淋巴细胞等与生理盐水组相比几乎均降低，但m与顺铂联合使用，会使白细胞和血小板数量与顺铂组相比，如图5(b为荷瘤对照组；c为单独顺铂组；d为顺铂 参一胶囊组；f为顺铂 m组)显著提高，说明m可以在一定程度上降低顺铂引起的造血功能障碍。
[0100]
表3 m对顺铂1mg
·
kg-1
·
d-1
i.p.引起的小鼠外周血象变化的影响(x
±
s，n＝8-10)
[0101][0102]
注：与荷瘤对照组比较，
δ
p＜0.05；与顺铂组比较，*p＜0.05
[0103]
结论
[0104]
顺铂组、顺铂 参一胶囊组和顺铂 m组对h
22
肝癌小鼠实体瘤均有抑制作用(p＜0.05)，其中以顺铂 m组最为显著，表明组分m能提高顺铂化疗对肿瘤细胞的杀伤能力。顺铂的使用能使小鼠血液中白细胞、红细胞、血小板、淋巴细胞数量均降低，但m与顺铂联合使用，会使白细胞、血小板数量与顺铂组相比显著提高，说明m在一定程度上降低顺铂引起的造血功能障碍、免疫缺陷等副作用。