抗肥胖用组合物及经口用组合物的制作方法

1.本发明涉及用于抗肥胖用、体脂减少用、脂肪代谢促进用、脂肪燃烧促进用、热产生促进用、能量消耗促进用、经口用的各组合物。另外，本发明涉及鸢尾黄素(tectorigenin)类及松醇在制造用于肥胖改善、体脂减少、脂肪代谢促进、脂肪燃烧促进、热产生促进或能量消耗促进的功能性食品中的用途。另外，本发明还涉及使用含有鸢尾黄素类及松醇的组合物的、用于肥胖改善、体脂减少、脂肪代谢促进、脂肪燃烧促进、热产生促进或能量消耗促进的方法。


背景技术：

2.肥胖与体内脂肪的消耗存在很大关系，脂肪的消耗具体地由以下的机理形成。
3.当分泌去甲肾上腺素等脂肪动员激素时，在分布于皮下或内脏的白色脂肪细胞中，作为脂肪分解酶的激素敏感性脂肪酶活化，白色脂肪细胞中蓄积的甘油三酯(中性脂肪)分解，变成甘油和游离脂肪酸而被释放到血液中。释放到血中的游离脂肪酸除了肝脏、肌肉之外，还被摄入到分布于锁骨附近、胸部一圈、肩等的褐色脂肪细胞的线粒体中，作为热而被消耗。这样，白色脂肪细胞起到将体内多余的能量以脂肪形式蓄积的作用，与此相对，褐色脂肪细胞发挥使脂肪燃烧而产生热的作用。
4.作为参与能量消耗的自主调节的候选分子之一，已知有ucp1和pgc1α。
5.ucp具有使线粒体内膜中的氧化性磷酸化反应解偶联并将能量以热的形式耗散的功能。关于最有代表性的褐色细胞脂肪的ucp1，已知有下述事实：1.在肥胖动物中ucp1的功能降低、2.即使多吃也不会肥胖的动物的ucp1增加、3.人为地使ucp1的基因表达降低的小鼠变胖、高表达的小鼠变瘦等。另外，已知pgc1α具有通过由褐色脂肪细胞的β肾上腺素受体刺激而引起ucp1活化、促进线粒体增生的作用(非专利文献1)。
6.因此，如果将ucp1、pgc1α活化，则可期待抗肥胖效果，因此探索了在ucp1、pgc1α活化方面优异的药物、食品。
7.另一方面，以往，作为以皮下脂肪等白色脂肪组织减少为课题的技术，已知包括专利文献1在内，有各种抗肥胖剂。
8.现有技术文献
9.专利文献
10.专利文献1：日本特开2017-171654号公报
11.专利文献2：日本特开2009-196931号公报
12.非专利文献
13.非专利文献1：第124回日本医学会
シンポジウム
記録集「肥満
の
科学」日本医学会、2003年、p62―70


技术实现要素：

14.消耗褐色脂肪细胞中的脂肪酸等能量而产生热的作用(以下也称为“能量消耗作
用”)对于脂质代谢是重要的，但如果能够使该作用活化，则可期待将体内更多的脂肪转换为热而更有效地得到抗肥胖作用。
15.然而，在上述各现有技术中，对于促进褐色脂肪细胞中的能量消耗作用尚未进行过研究。
16.另外，本发明人进行了研究，结果发现，被认为能够分别单独减少白色脂肪组织的以往的抗肥胖剂在促进褐色脂肪细胞中进行的能量消耗作用这一点上很难说是充分的。
17.本发明者们对通过研究与褐色脂肪细胞中的能量消耗作用相关的pgc1α和ucp1等蛋白的基因表达，对能够促进褐色脂肪细胞中的能量消耗作用的组合物的构成进行了深入研究。其结果发现，通过将特定的成分组合，令人惊讶的是，能够促进这些基因的表达，能够得到促进上述能量消耗的优异效果。
18.本发明是基于上述认知而完成的，其提供一种抗肥胖用组合物，其含有鸢尾黄素类及松醇。
19.本发明提供一种体脂减少用或脂肪代谢促进用组合物，其含有鸢尾黄素类及松醇。
20.本发明提供一种脂肪燃烧促进用、热产生促进用或能量消耗促进用组合物，其含有鸢尾黄素类及松醇。
21.另外，本发明还提供一种经口用组合物，其含有鸢尾黄素类及松醇。
22.另外，本发明还提供鸢尾黄素类及松醇在制造用于肥胖改善、体脂减少、脂肪代谢促进、脂肪燃烧促进、热产生促进或能量消耗促进的功能性食品中的用途。
23.另外，本发明还提供一种用于肥胖改善、体脂减少、脂肪代谢促进、脂肪燃烧促进、热产生促进或能量消耗促进的方法，其使用含有鸢尾黄素类及松醇的组合物。
24.发明效果
25.根据本发明，能够提供含有含鸢尾黄素类及松醇的组合物的有用的经口用组合物，特别是能够提供具有能够促进与褐色脂肪细胞中的能量消耗作用相关的pgc1α和ucp1等蛋白的基因表达、促进褐色脂肪细胞中的能量消耗作用的效果的有效的抗肥胖用组合物、体脂减少用组合物、脂肪代谢促进用组合物、脂肪燃烧促进用组合物、热产生促进用组合物及能量消耗促进用组合物。此外，还能够提供介由上述pgc1α和ucp1的基因的表达促进效果而具有促进褐色脂肪细胞中的能量消耗作用的效果，抗肥胖、体脂减少、脂肪代谢促进、脂肪燃烧促进、热产生促进和能量消耗促进的各作用有效的经口用组合物。另外，根据本发明，还能够提供能够促进pgc1α和ucp1的基因表达、能够促进褐色脂肪细胞中的能量消耗作用、有效的、用于肥胖改善的含有鸢尾黄素类及松醇的组合物的用途、以及使用鸢尾黄素类及松醇作为有效成分的用于改善肥胖的方法。
附图说明
26.图1是表示实施例及比较例中的pgc1α基因的表达量的图表。
27.图2是表示实施例及比较例中的ucp1基因的表达量的图表。
具体实施方式
28.以下，举出本发明的实施方式对本发明更详细地进行说明，但本发明并不限定于
这些实施方式。以下，将本发明的抗肥胖用组合物、体脂减少用组合物、脂肪代谢促进用组合物、脂肪燃烧促进用组合物、热产生促进用组合物、能量消耗促进用组合物及经口用组合物统合记载为“本发明的组合物”。
29.(鸢尾黄素类)
30.鸢尾黄素类是指鸢尾黄素、鸢尾黄素的糖苷以及它们的衍生物。
31.鸢尾黄素是存在于鸢尾科等植物中的类黄酮的一种，由分子式c
16h12
o6表示，有时也被称为5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)-6-甲氧基-4h-1-苯并呋喃-4-酮或6-甲氧基-5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)-4h-1-苯并呋喃-4-酮。在本说明书中，在简称为鸢尾黄素的情况下，是指这样的苷元形态的化合物。鸢尾黄素的化学式如下。
32.【化学式1】
[0033][0034]
本发明中的鸢尾黄素糖苷是指使选自单糖类中的1种或2种以上的糖和/或糖酸与上述的鸢尾黄素结合而成的化合物。作为单糖类，优选五碳糖、六碳糖，更优选选自葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、山梨糖、半乳糖、芹菜糖、鼠李糖中的1种或2种以上，特别优选选自葡萄糖、木糖中的1种或2种。另外，作为糖酸，优选糖醛酸，特别优选葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸。在糖苷中，这些糖和/或糖酸通常与鸢尾黄素的4’位和/或7位的羟基键合。在本发明中，优选与7位的羟基键合的糖苷。鸢尾黄素糖苷中的糖和/或糖酸的数量(也称为糖和/或糖酸的键合数)例如可举出1个以上且5个以下，优选1个以上且4个以下，特别优选1个以上且3个以下。糖和/或糖酸的数量是指糖和/或糖酸的总数。在此，在鸢尾黄素上键合有n个糖时，可以是键合有n个糖的连结体的结构，也可以是与鸢尾黄素的不同部位键合的糖的总数为n个。在糖苷包含糖酸的情况下也同样。
[0035]
作为鸢尾黄素或其糖苷的衍生物，例如可举出鸢尾黄素或其糖苷中的1个或2个以上的氢原子被取代基取代而得到的化合物。作为这样的取代基，可举出氨基、磺酸基、碳数为1以上且6以下的烷基、碳数为1以上且4以下的烷氧基等。鸢尾黄素类中的所述取代基的数量优选为8以下，更优选为4以下，最优选为0。
[0036]
本发明的组合物中，作为鸢尾黄素类，可以仅使用上述的鸢尾黄素、其糖苷和它们的衍生物中的任意1种，也可以使用它们中的2种以上的混合物。特别是在本发明的组合物中，从抗肥胖作用的角度出发，优选鸢尾黄素类为鸢尾黄素和/或其糖苷。从在褐色脂肪细胞中的能量消耗作用的促进效果优异的角度和获得容易性的角度出发，特别优选本发明的组合物含有鸢尾黄素作为鸢尾黄素类。在本发明的组合物中，鸢尾黄素类可以是有机合成品，也可以是从植物等中提取的。
[0037]
(松醇)
[0038]
松醇也被称为3-o-甲基-d-手性肌醇，是肌醇的一种。松醇包含于长角豆、三叶草等植物中。在本发明的组合物中，松醇可以是有机合成品，也可以是从植物等中提取的。
[0039]
在本发明中，鸢尾黄素类与松醇的含有比为特定范围时，pgc1α、ucp1的基因表达优异，褐色脂肪细胞中的能量消耗作用更高，因此优选。为了提高褐色脂肪细胞中的能量消
耗作用，鸢尾黄素类与松醇的含有比以质量比计，优选为鸢尾黄素类：松醇为1：0.01以上且50以下，更优选为1：0.05以上且30以下，特别优选为1：0.1以上且26以下。另外，基于同样的理由，在含有鸢尾黄素作为鸢尾黄素类的情况下，鸢尾黄素与松醇的含有比以质量比计，优选为鸢尾黄素：松醇为1：0.01以上且50以下，特别是由于基于ucp1基因表达促进的褐色脂肪细胞中的能量消耗作用优异，因此特别优选为1：超过0.5且30以下，进一步优选为1：0.7以上且30以下，最优选为1：1以上且26以下。
[0040]
本发明的组合物中的鸢尾黄素类的量的测定可以通过高效液相色谱法(hplc法)进行。
[0041]
例如可以设为：使用株式会社ymc制的ymc-pack ods am12s05-2546wt(φ4.6
×
250mm)，作为流动相的液体介质，使用乙腈/水/乙酸混合液(流动相a体积比＝15：85：0.1、流动相b体积比＝35：65：0.1)，柱温度为35℃、流量为1.0ml/分钟。
[0042]
梯度的条件可以如下表a所示。
[0043]
表a
[0044]
时间(分钟)a液(％)b液(％)01000500100550100571000701000
[0045]
本发明的组合物中的松醇的量的测定可以通过hplc法进行。
[0046]
例如可以设为：作为柱，使用gl sciences株式会社制的inertsustain nh2(3μm、φ3
×
250mm)，作为流动相的液体介质，使用1mm盐酸/色谱用乙腈(体积比＝30/70)，柱温度为40℃、流量为0.5ml/分钟。
[0047]
本发明的组合物除了鸢尾黄素类及松醇以外，还可以在不损害本发明效果的范围内含有通常使用的其他成分。作为这样的成分，可举出各种赋形剂、粘合剂、光泽剂、润滑剂、稳定剂、稀释剂、增量剂、增粘剂、乳化剂、抗氧化剂、ph调节剂、着色剂、香料、添加剂等。其他成分的含量可以根据本发明的组合物的形态等适当选择。
[0048]
本发明的组合物也可以用于经口用和非经口用的任意用途。作为非经口的制剂，例如可举出通过使用导管等直接给予胃的方法给予的制剂等。但是，本发明的组合物从简便地得到促进能量消耗的本发明的作用的角度出发，优选制成经口用。
[0049]
在作为经口剂使用的情况下，作为其形态，例如可举出片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、液剂、粒状剂、棒状剂、板状剂、块状剂、固体状制剂、丸状剂、糊状剂、霜状剂、囊状剂、凝胶状剂、咀嚼状剂、棒状剂等。其中，特别优选片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、液剂的形态。作为以片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、液剂的形态使用的经口用组合物的例子，可以例示出营养增补剂；食品添加剂：填充在塑料瓶、罐、瓶等中的容器装饮料：用于溶解在水(热水)、牛奶、果汁等中饮用的粉末饮料等。它们从食用时等容易轻松地饮食，并且能够提高嗜好性的角度出发是优选的。
[0050]
另外，作为本发明的经口用组合物的具体例，可以含有食品作为饮食用组合物。作为食品，还可举出袋泡茶、面包-点心类、面类等各种食品、烹调品等。作为面包-点心类，可
举出主食面包、甜面包、法式面包、英式面包、松饼、蒸制面包、甜甜圈、华夫饼等面包类；奶油蛋糕、海绵蛋糕、戚风蛋糕、薄煎饼等蛋糕类；巧克力、冰激凌、冰棍等冷冻点心、果冻、曲奇等。作为面类，可举出乌冬面、素面等。作为烹调品，可举出咖喱、炖菜、味噌汤、蔬菜汤等汤或它们的材料、调味料等。
[0051]
对于本发明的组合物而言，在其固体成分中含有总计0.001质量％以上且40质量％以下的松醇及鸢尾黄素类，从在褐色脂肪细胞中的能量消耗的促进作用的角度和在日常生活中容易持续地经口摄取的角度出发是优选的，更优选含有0.005质量％以上且35质量％以下，特别优选含有0.01质量％以上且30质量％以下。需要说明的是，固体成分是指从组合物中除去水后的量。
[0052]
在经口摄取本发明的组合物的情况下，从在褐色脂肪细胞中的能量消耗的促进作用的角度和在日常生活中容易持续地经口摄取的角度出发，关于其经口给药量，上述松醇及鸢尾黄素类以合计计，优选为成人每1日为约0.1mg以上且500mg以下，更优选为0.5mg以上且300mg以下。另外，本发明的组合物的1次摄取量以上述松醇及鸢尾黄素类的总量计，优选为成人每1日为约1mg以上且300mg以下。
[0053]
作为本发明的组合物的利用方式，具体而言，可举出药品(包括疗效性化妆品)、普通食品、营养功能食品、通过规定机构确认了疗效的特定保健用食品、功能性显示食品等所谓的健康食品。显示有疗效的食品有时被总称为“功能性食品”。
[0054]
如后述的实施例所示，本发明的组合物通过促进褐色脂肪细胞中与能量消耗关联的多个蛋白的基因表达，能够促进褐色脂肪细胞及包含其的褐色脂肪组织中的能量消耗。作为这样的基因，可举出pgc1α基因、ucp1基因。
[0055]
pgc1α基因所编码的蛋白pgc1α(pparγ共激活因子1α)是被鉴定为使基于核内受体pparγ的转录活化的转录辅助因子的蛋白。pgc1α使转录因子nrf(nuclear respiratory factor，核呼吸因子)1/nrf2活化，nrf促进tfam(mitochondria transcription factor，线粒体转录因子)的转录，由此使线粒体的生物合成活化。已知通过促进pgc1α的基因表达，线粒体增加。另外，pgc1α是约束褐色脂肪细胞的核内受体的因子，参与ucp1基因表达的促进。因此，通过促进pgc1α的基因表达，介由褐色脂肪细胞中的线粒体增加作用、ucp1基因表达促进作用可期待能量消耗促进作用等。pgc1α的基因有时也记为pgc1α。
[0056]
另外，ucp1基因是编码分子解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，ucp1)的基因，有时也记为ucp1。在褐色脂肪细胞中，在该细胞的线粒体中特异性地表达ucp1基因。ucp1基因具有使线粒体中的氧化磷酸化解偶联的活性，若其被活化，则通过脂肪酸或葡萄糖的氧化分解而产生的能量不会转向atp合成而直接转换为热而被耗散消耗。通过促进ucp1基因的表达，能够促进褐色脂肪细胞中的脂肪酸消耗，抑制或消除肥胖。
[0057]
本发明的作用可以是仅促进pgc1α基因、ucp1基因中的任一种的表达的作用，也可以是促进pgc1α基因、ucp1基因中的双方的表达的作用。本发明的组合物除了pgc1α基因、ucp1基因的表达促进用途以外，还可以用于脂肪燃烧促进用、热产生促进用、脂肪代谢促进用、体脂减少用、能量消耗促进用等各种用途。脂肪燃烧促进用是指促进褐色脂肪细胞将脂肪酸转换为热的作用。热产生促进是指例如促进褐色脂肪细胞从中性脂肪产生热。脂肪代谢促进作用是指例如将形成肥胖状态的脂肪细胞、脂肪组织在质方面变换成小型的正常的脂肪细胞的作用、或基于褐色脂肪细胞的脂肪酸的代谢作用。体脂减少作用是指例如通过
将脂肪酸变为热而使体脂减少的作用。另外，抗肥胖用途是指例如通过促进褐色脂肪细胞、褐色脂肪组织中的脂肪酸的代谢，减少体脂或抑制体脂的增加的作用。能量消耗促进用是指例如促进褐色脂肪细胞消耗脂肪酸等化学能量的作用。这些作用是介由褐色脂肪细胞中的pgc1α、ucp1的活化而进行的。
[0058]
另外，在本发明中，褐色脂肪细胞的位置除了肝脏、肌肉之外，还可举出锁骨附近、胸(胸周围)、肩(肩胛骨及其周边)等。
[0059]
另外，本发明的组合物在用于脂肪分解促进、抗肥胖、节食等用途方面，只要能够作为产品与其他产品区别即可，例如具有脂肪分解促进的功能的意思表示是指如下的表示：如对在意肥胖者、对在意腹围者、对在意体重者、对在意腹部脂肪(内脏脂肪和皮下脂肪等)者那样，对介意体脂的对象者所呼吁的表示，或表示如有助于减少体重、有助于减少腹部脂肪(内脏脂肪和皮下脂肪等)、有助于减少腰围直径、支持肥胖消除、支持节食、使脂肪易于消耗、使脂肪易于燃烧、有助于脂肪消耗、有助于脂肪燃烧、促进脂肪分解、使脂肪易于分解、有助于脂肪分解等那样对减少体脂有帮助的表示。
[0060]
实施例
[0061]
以下，举出实施例对本发明更详细地进行说明。但是，本发明的范围并不限定于这些实施例。以下，没有特别说明的情况下，“％”表示质量％，“份”表示质量份。
[0062]
pgc1α基因表达量的测定
[0063]
[实施例1以及比较例1和2]
[0064]
(1)作为受试物质，作为鸢尾黄素类，使用了鸢尾黄素(东京化成工业制)。另外作为松醇，使用了d-松醇(东京化成工业制)。
[0065]
(2)作为增殖培养基，使用了增殖用培养基；作为分化诱导培养基，使用了分化诱导用培养基；作为分化维持培养基，使用了脂肪细胞维持培养基。上述3种培养基全部使用了褐色脂肪细胞培养试剂盒f-8(大鼠)(cosmo bio制，肩胛骨间褐色脂肪组织来源)的培养基。其中，肩胛骨间褐色脂肪组织来源的褐色脂肪细胞在研究与脂肪燃烧相关的褐色脂肪细胞功能时被频繁使用。
[0066]
(3)含有受试物质的分化诱导培养基如下制备。即，将各受试物质溶解于dmso后，用分化诱导培养基稀释，按照dmso终浓度达到0.5vol％的方式进行制备，进行过滤器灭菌。灭菌后，使用含有0.5vol％dmso的分化诱导培养基，将鸢尾黄素和松醇稀释至下述表1的浓度。
[0067]
(4)含有受试物质的分化维持培养基如下制备。即，将各受试物质溶解于dmso后，用分化维持培养基稀释，按照dmso终浓度达到0.5vol％的方式进行制备，进行过滤器灭菌。灭菌后，使用含有0.5vol％dmso的分化维持培养基，将鸢尾黄素和松醇稀释至下述表1的浓度。
[0068]
(5)使用增殖培养基，将大鼠褐色脂肪前体细胞(cosmo bio制)按照达到3.0
×
104cells/孔的方式、以500μl/孔播种到经胶原涂布的24孔板中，在37℃、5(vol/vol)％co2培养箱内培养至细胞密度达到90％左右。
[0069]
(6)去除培养基后，添加含有受试物质的分化诱导培养基500μl/孔，在37℃、5(vol/vol)％co2培养箱内培养48小时，诱导向褐色脂肪细胞的分化。
[0070]
(7)去除培养基后，添加含有受试物质的分化维持培养基500μl/孔，在37℃、5
(vol/vol)％co2培养箱内培养72小时。
[0071]
(8)去除培养基后，添加含有受试物质的分化维持培养基500μl/孔，在37℃、5(vol/vol)％co2培养箱内进一步培养72小时。
[0072]
(9)去除培养基后，用pbs洗涤2次，使用rneasy mini kit(qiagen制)回收rna，使用revert raace(r)qpcr rt master mix(toyobo制)合成cdna。
[0073]
(10)将得到的cdna作为模板，使用pgc1α基因的引物(qiagen制)，通过quantinova sybr green pcr kit(qiagen制)进行定量实时pcr，测定pgc1α的mrna基因表达量。关于实施例1以及比较例1和2的pgc1α的mrna基因表达量，将把比较例1的值设为1时的相对值示于图1。
[0074]
表1
[0075][0076]
ucp1基因表达量的测定
[0077]
[实施例2～4以及比较例3和4]
[0078]
代替pgc1α使用了ucp1基因的引物(qiagen制)。另外，作为受试物质，使用了下述表2中记载的组成的受试物质。分化诱导培养基和分化维持培养基中的受试物质的浓度为50μm。除这点以外，与〔实施例1以及比较例1和2〕同样地测定ucp1的mrna基因表达量。关于实施例2～4以及比较例3和4的ucp1的mrna基因的表达量，将把比较例3的值设为1时的相对值示于图2。
[0079]
表2
[0080][0081]
如图1和图2所示，在组合了鸢尾黄素类及松醇的本发明的组合物的存在下，使所述褐色脂肪细胞分化诱导及分化维持的情况下，pgc1α基因、ucp1基因的表达量均大大超过了分别单独使用鸢尾黄素及松醇时的情况。特别是，对于在能量消耗方面中发挥重要作用的ucp1基因，通过组合使用鸢尾黄素及松醇表现出了协同的表达促进效果。
[0082]
因此可知，本发明的组合物显示促进褐色脂肪细胞中的能量消耗的优异作用，作为抗肥胖剂是优异的。
[0083]
制造由下述成分构成的颗粒剂(每1包为3000mg)。通过将得到的颗粒剂每1天2次、
每1次1包悬浮于水中进行摄取，可得到优异的抗肥胖效果。
[0084]
表3
[0085][0086]
制造由下述成分构成的颗粒剂(每1包为2000mg)。通过将得到的颗粒剂每1天3次、每1次1包悬浮于热水中进行摄取，可得到优异的抗肥胖效果。
[0087]
表4
[0088][0089]
制造由下述成分构成的片剂(每1粒为200mg)。通过将得到的片剂每1天2次、每1次4粒进行摄取，可得到优异的抗肥胖效果。
[0090]
表5
[0091][0092]
制造由下述成分构成的片剂(每1粒为300mg)。通过将得到的片剂每1日1次、每1次5粒进行摄取，可得到优异的抗肥胖效果。
[0093]
表6
[0094][0095]
制造由下述成分构成的胶囊剂(每1粒为300mg)。通过将得到的胶囊剂每1日2次、每1次2粒进行摄取，可得到优异的抗肥胖效果。
[0096]
表7
[0097]
[0098]
产业上的可利用性
[0099]
本发明的组合物可期待高度的抗肥胖效果，因此产业上的有用性高。