一种利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的检测方法与流程

1.本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的检测方法。


背景技术：

2.利奈唑胺葡萄糖注射液可用于治疗由特定微生物敏感株引起的下列感染：耐万古霉素的屎肠球菌引起的感染，包括并发的菌血症；院内获得性肺炎，致病菌为金黄色葡萄球菌(甲氧西林敏感或耐甲氧西林的菌株)或肺炎链球菌(包括多药耐药的菌株[mdrsp]))。但是，利奈唑胺葡萄糖注射液存在基因毒性杂质，比如：(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺、4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉和3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺；会影响利奈唑胺葡萄糖注射液的使用效果。所以，需要对利奈唑胺葡萄糖注射液中的三种基因毒性杂质进行定量研究。常用的分析方法为高效液相色谱法，但是液相色谱法灵敏度低，不能满足检测要求。


技术实现要素：

[0003]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的检测方法。本发明提供的检测方法灵敏度高，满足检测要求。
[0004]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0005]
本发明提供了一种利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的检测方法，包括以下步骤：
[0006]
将待测利奈唑胺葡萄糖注射液进行三重四极杆液质联用检测，得到待测利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的色谱图；
[0007]
将所述待测利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的色谱图与预定的基因毒性杂质的标准谱图进行对比，采用外标法计算得到待测样品中基因毒性杂质的含量；
[0008]
所述基因毒性杂质包括：(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺、4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉和3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺；
[0009]
所述三重四极杆液质联用检测包括液相检测和质谱检测；
[0010]
所述质谱检测的参数包括：
[0011]
离子源类型为esi

；
[0012]
检测模式为正离子；
[0013]
监测模式为多反应监测模式；
[0014]
气帘气压力为30～35psi；
[0015]
碰撞气压力为9～11psi；
[0016]
喷雾电压为5500v；
[0017]
温度为650℃；
[0018]
喷雾气压力为55～70psi；
[0019]
干燥气压力为50～70psi；
[0020]
阀事件如表1所示：
[0021]
表1阀事件
[0022][0023]
化合物离子对信息如表2所示：
[0024]
表2化合物离子对信息
[0025][0026]
优选地，所述液相检测的参数包括：
[0027]
色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
[0028]
流动相体系包括流动相a和流动相b；
[0029]
所述流动相a为甲酸体积分数为0.09～0.11％的水溶液；
[0030]
所述流动相b为甲酸体积分数为0.09～0.11％的甲醇溶液；
[0031]
洗脱方式为梯度洗脱；
[0032]
所述梯度洗脱的程序如表3所示：
[0033]
表3梯度洗脱的程序
[0034]
[0035]
流速为0.8ml/min；
[0036]
进样量为1μl；
[0037]
柱温为40℃；
[0038]
样品室的温度为15℃。
[0039]
优选地，所述预定的基因毒性杂质的标准谱图为基因毒性杂质对照品浓度-色谱信息线性曲线。
[0040]
优选地，所述预定的基因毒性杂质的标准谱图的获取方法包括以下步骤：
[0041]
将基因毒性杂质对照品溶解，得到基因毒性杂质对照品贮备液；
[0042]
将所述基因毒性杂质对照品贮备液稀释制成5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml和400ng/ml的系列线性溶液；
[0043]
对所述系列线性溶液进行所述三重四极杆液质联用检测，得到系列线性溶液的色谱信息；
[0044]
基于所述系列线性溶液的浓度和色谱信息，建立线性标准曲线，得到所述的预定的基因毒性杂质的标准谱图。
[0045]
优选地，所述色谱信息包括色谱峰面积。
[0046]
本发明提供了一种利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的检测方法，包括以下步骤：将待测利奈唑胺葡萄糖注射液进行三重四极杆液质联用检测，得到待测利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的色谱图；将所述待测利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的色谱图与预定的基因毒性杂质的标准谱图进行对比，采用外标法计算得到待测样品中基因毒性杂质的含量；所述基因毒性杂质包括：(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺、4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉和3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺；所述三重四极杆液质联用检测包括液相检测和质谱检测；所述质谱检测的参数包括：离子源类型为esi

；检测模式为正离子；监测模式：多反应监测模式；气帘气压力为30～35psi；碰撞气压力为9～11psi；喷雾电压为5500v；温度为650℃；喷雾气压力为55～70psi；干燥气压力为50～70psi；阀事件如表1所示：化合物离子对信息如表2所示。
[0047]
本发明采用三重四极杆液质联用方法定量检测利奈唑胺葡萄糖注射液中三种基因毒性杂质(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺、4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉和3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的含量，质谱检测采用多反应监测(mrm)模式，通过化合物离子对两级离子的选择，排除大量干扰离子，使质谱的化学背景降低，目标检测物的信噪比显著提高，从而实现检测的高特异性和高灵敏度。
附图说明
[0048]
图1为预定的基因毒性杂质(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺的标准谱图；
[0049]
图2为预定的基因毒性杂质(4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉的标准谱图；
[0050]
图3为预定的基因毒性杂质3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的标准谱图。
具体实施方式
[0051]
本发明提供了一种利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的检测方法，包括以下步骤：
[0052]
将待测利奈唑胺葡萄糖注射液进行三重四极杆液质联用检测，得到待测利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的色谱图；
[0053]
将所述待测利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的色谱图与预定的基因毒性杂质的标准谱图进行对比，采用外标法计算得到待测样品中基因毒性杂质的含量。
[0054]
在本发明中，如无特殊说明，本发明所用物料均优选为市售产品。
[0055]
本发明将待测利奈唑胺葡萄糖注射液进行三重四极杆液质联用检测，得到待测利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的色谱图。
[0056]
在本发明中，所述所述三重四极杆液质联用检测包括液相检测和质谱检测。
[0057]
在本发明中，所述质谱检测的参数包括：离子源类型为esi

；检测模式为正离子；监测模式：多反应监测模式；气帘气压力为30～35psi，具体优选为30psi，所述气帘气优选为氮气；碰撞气压力为9～11psi，优选为10psi，所述碰撞气优选为氮气；喷雾电压为5500v；温度为650℃；喷雾气压力为55～70psi，优选为60psi；所述喷雾气优选为氮气；干燥气压力为50～70psi，优选为60psi；所述干燥气优选为氮气；阀事件如表1所示；化合物离子对信息如表2所示。
[0058]
在本发明中，所述液相检测的参数包括：色谱柱的填料优选为十八烷基硅烷键合硅胶，所述填料的粒径优选为3μm；所述色谱柱的型号优选为ace excel 3c18。在本发明中，所述色谱柱的尺寸优选为4.6
×
100mm。
[0059]
在本发明中，所述液相检测的流动相体系优选包括流动相a和流动相b；所述流动相a优选为甲酸体积分数为0.09～0.11％的水溶液，进一步优选为甲酸体积分数为0.1％的水溶液；所述流动相b优选为甲酸体积分数为0.09～0.11％的甲醇溶液，进一步优选为甲酸体积分数为0.1％的甲醇溶液；洗脱方式优选为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序优选如表3所示：流速优选为0.8ml/min；进样量优选为1μl；柱温优选为40℃；样品室的温度优选为15℃。
[0060]
在本发明中，所述基因毒性杂质包括：(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺、4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉和3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺。
[0061]
得到待测利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的色谱图后，本发明将所述待测利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的色谱图与预定的基因毒性杂质的标准谱图进行对比，采用外标法计算得到待测样品中基因毒性杂质的含量。
[0062]
在本发明中，所述预定的基因毒性杂质的标准谱图优选为基因毒性杂质对照品浓度-色谱信息线性曲线。
[0063]
在本发明中，所述预定的基因毒性杂质的标准谱图的获取方法优选包括以下步骤：
[0064]
将基因毒性杂质对照品溶解，得到基因毒性杂质对照品贮备液；
[0065]
将所述基因毒性杂质对照品贮备液稀释制成5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml和400ng/ml的系列线性溶液；
[0066]
对所述系列线性溶液进行所述三重四极杆液质联用检测，得到系列线性溶液的色谱信息；
[0067]
基于所述系列线性溶液的浓度和色谱信息，建立线性标准曲线，得到所述的预定的基因毒性杂质的标准谱图。
[0068]
本发明将基因毒性杂质对照品溶解，得到基因毒性杂质对照品贮备液。在本发明中，当基因毒性杂质对照品为(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺对照品和3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺对照品，所述溶解的试剂优选为乙腈体积分数为10％的水溶液。在本发明中，当基因毒性杂质对照品为4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉对照品，所述溶解的试剂优选为乙腈体积分数为50％的水溶液。在本发明中，所述基因毒性杂质对照品贮备液的浓度优选为0.05mg/ml。
[0069]
得到基因毒性杂质对照品贮备液后，本发明将所述基因毒性杂质对照品贮备液稀释制成5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml和400ng/ml的系列线性溶液。在本发明中，所述稀释的试剂优选为空白辅料溶液。在本发明中，所述空白辅料溶液的制备方法优选包括：精密称定枸橼酸钠0.164g，无水枸橼酸0.085g，无水葡萄糖4.57g，加注射用水100ml，121℃灭菌12分钟，得到所述空白辅料溶液。
[0070]
得到系列浓度的线性溶液后，本发明对所述系列线性溶液进行所述三重四极杆液质联用检测，得到系列线性溶液的色谱信息。在本发明中，所述三重四极杆液质联用检测的参数优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。在本发明中，所述色谱信息优选为色谱峰面积。
[0071]
得到系列线性溶液的色谱信息后，本发明基于所述系列线性溶液的浓度和色谱信息，建立线性标准曲线，得到所述的预定的基因毒性杂质的标准谱图。本发明对所述建立线性标准曲线的参数不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的常规技术手段即可。
[0072]
下面结合实施例对本发明提供的利奈唑胺葡萄糖注射液中基因毒性杂质的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0073]
实施例
[0074]
(1)仪器与试药
[0075]
仪器：三重四极杆液质联用仪(型号triple quad 4500)；ace excel3c18-ar 3μm，4.6
×
100mm色谱柱；电子分析天平。
[0076]
试药：甲酸(质谱级)、乙腈(质谱级或色谱纯)、甲醇(质谱级或色谱纯)、纯化水、杂质(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺、4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉和3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺对照品。
[0077]
(2)色谱检测的条件
[0078]
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ace excel 3c18-ar 3μm，4.6
×
100mm)；
[0079]
流动相a：水(0.1％甲酸)(甲酸体积分数为0.1％的水溶液)；
[0080]
流动相b：甲醇(0.1％甲酸)(甲酸体积分数为0.1％的甲醇溶液)；
[0081]
流动相梯度程序如表3所示；
[0082]
流速：0.8ml/min；
[0083]
进样量：1μl；
[0084]
柱温：40℃；
[0085]
样品室：15℃；
[0086]
(3)质谱检测的条件
[0087]
离子源类型：esi

；
[0088]
检测模式：正离子；
[0089]
监测模式：多反应监测(mrm)模式；
[0090]
气帘气(curtain gas)压力：30psi；
[0091]
碰撞气(collision gas)压力：10psi；
[0092]
喷雾电压(ionsprayvoltage)：5500v；
[0093]
温度(temperature)：650℃；
[0094]
喷雾气(ion source gas 1)压力：60psi；
[0095]
干燥气(ion source gas 2)压力：60psi；
[0096]
阀事件表如表1所示；化合物离子对信息如表2所示。
[0097]
(4)溶液配制
[0098]
10％乙腈溶液：v
乙腈
：v
水
＝10：90；
[0099]
50％乙腈溶液：v
乙腈
：v
水
＝50：50；
[0100]
空白辅料溶液：精密称定取枸橼酸钠0.164g，无水枸橼酸0.085g和无水葡萄糖4.57g，加注射用水100ml，121℃灭菌12分钟。
[0101]
(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺对照品贮备液：精密称定(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺对照品2.5mg，置50ml量瓶中，加10％乙腈溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0102]
4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉对照品贮备液：精密称定4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉对照品2.5mg，置50ml量瓶中，加50％乙腈溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0103]
3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺对照品贮备液：精密称定3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺对照品2.5mg，置50ml量瓶中，加10％乙腈溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0104]
(5)专属性
[0105]
分别精密量取“(4)”项下的对照品贮备溶液，用空白辅料进行稀释制成每1ml分别含200ng的杂质定位溶液、混合对照品溶液及加标供试品溶液，分别取各溶液1μl进样，按“(2)和(3)”项下方法测定。
[0106]
结果显示空白辅料溶液和空白溶剂的测定不干扰杂质(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺、4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉、3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的测定，表明该方法专属性较好。
[0107]
(6)定量限与检测限
[0108]
分别精密量取“(4)”项下的各对照品贮备溶液，用空白辅料进行稀释制成信噪比约为10的定量限溶液及信噪比为3的检测限溶液，分别取各定量限溶液及检测限溶液1μl进样，按“(2)和(3)”项下方法测定。
[0109]
结果显示(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺的定量限浓度为0.5048ng/ml，检测限浓度为0.1514ng/ml；4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉的定量限浓度为0.9970ng/ml，检测限浓度为0.2991ng/ml；3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的定量限浓度为0.3959ng/ml，检测限浓度为0.1188ng/ml；表明该方法的检测灵敏度较高。
[0110]
(7)线性和范围
[0111]
分别精密量取“(4)”项下的对照品贮备溶液，用空白辅料进行稀释制成目标浓度为5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml和400ng/
ml的线性溶液，分别取各线性溶液1μl进样，按“(2)和(3)”项下方法测定。结果如图1～图3所示。
[0112]
图1为预定的基因毒性杂质(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺的标准谱图；利用图1所示的标准谱图得到计算浓度，如表4所示。
[0113]
表4(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺线性溶液的实际浓度和计算浓度
[0114]
实际浓度/ng/ml进样次数计算浓度/ng/ml准确度％4.8214.7598.4719.3120.29105.1448.2149.48102.6596.4194.7798.301451153.37105.771931187.0496.912411236.0197.932891284.798.513861369.2595.66
[0115]
从图1和表4可以看出：(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺的线性方程为y＝7.42e 003x 93(r＝0.9992)，表明(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺在4.82ng/ml～386ng/ml浓度范围内线性良好。
[0116]
图2为预定的基因毒性杂质(4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉的标准谱图，利用图2所示的标准谱图得到计算浓度，如表5所示。
[0117]
表5(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺线性溶液的实际浓度和计算浓度
[0118][0119][0120]
从图2和表5可以看出：4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉的线性方程为y＝7.64e 003x 1.8e 003(r＝0.9999)，表明4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉在5.08ng/ml～406ng/ml浓度范围内线性良好。
[0121]
图3为预定的基因毒性杂质3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的标准谱图；利用图3所示的标准谱图得到计算浓度，如表6所示。
[0122]
表63-氟-4-(4-吗啉基)苯胺线性溶液的实际浓度和计算浓度
[0123]
实际浓度/ng/ml进样次数计算浓度/ng/ml准确度％5.1215.0999.5020.5120.87101.8151.2151.97101.511021100.4998.521541153.1099.422051202.7098.882561255.9599.983071304.5999.224101414.21101.03
[0124]
从图3和表6可以看出：3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的线性方程为y＝8.74e 003x-2.33e 003(r＝0.9999)，表明3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺在5.12ng/ml～410ng/ml浓度范围内线性良好。
[0125]
(8)准确度
[0126]
分别精密量取“(4)”项下的对照品贮备溶液，用利奈唑胺葡萄糖注射液配制成杂质浓度分别为100ng/ml、200ng/ml和300ng/ml的回收率溶液，分别取各溶液1μl进样，按“(2)和(3)”项下方法测定。
[0127]
结果显示：(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺的回收率在73.33％～81.82％之间，rsd为4.0％；4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉的回收率在100.6％～103.1％之间，rsd为0.94％；3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的回收率在78.17％～86.22％之间，rsd为3.5％。表明该方法准确度较好。
[0128]
(9)精密度
[0129]
由不同分析人员，于不同日期，分别精密量取“(4)”项下的对照品贮备溶液，用利奈唑胺葡萄糖注射液配制成杂质浓度为200ng/ml的100％回收率溶液12份，分别取各溶液1μl进样，按“(2)和(3)”项下方法测定。
[0130]
结果显示：(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺的6个重复性溶液的回收率均在77.01％～81.82％之间，回收率的rsd为2.2％；(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺的6个中间精密度溶液的回收率均在74.26％～82.67％之间，6份rsd为4.9％，与重复性计算12份回收率的rsd为3.7％。4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉的6个重复性溶液的回收率均在101.0％～104.6％之间，回收率的rsd为1.4％；4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉的6个中间精密度溶液的回收率均在99.50％～101.5％之间，6份rsd为0.68％，与重复性计算12份回收率的rsd为1.8％。3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的6个重复性溶液的回收率均在81.63％～86.22％之间，回收率的rsd为2.0％；3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的6个中间精密度溶液回收率均在77.23％～80.69％之间，6份rsd为2.1％，与重复性计算12份回收率的rsd为3.8％。表明该方法精密度较好。
[0131]
(10)样品测定
[0132]
以所建方法对所生产的3批样品进行检测，(s)-n-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺和4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉结果均低于检出限，3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺检测结果在线性范围内。
[0133]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。