一种改良的冰冻组织油红O脂肪染色方法和应用与流程

一种改良的冰冻组织油红o脂肪染色方法和应用
技术领域
1.本发明属于脂滴检测技术领域，具体涉及一种改良的冰冻组织油红o脂肪染色方法和应用。


背景技术：

2.油红o染色法是指在病理诊断和科研工作中为了显示组织内的脂肪常采用油红o进行染色的方法。油红o属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，在脂肪内能高度溶解，可特异性的与甘油三酯结合呈小脂滴状使组织内中性脂肪着色。此方法先把油红o染料溶于有机溶剂中，这种染料在冰冻切片内脂质的溶解度较在原有溶剂中的溶解度更大，所以在染色时染料就从有机溶剂中转移入脂质中而使组织内的脂肪染色，以显示组织和细胞内脂滴的含量和大小。
3.目前小鼠肝脏组织内脂滴油红o染色并没有统一的技术标准，各种油红o染色的方法和操作步骤存在着差异，一些容易给染色结果造成错误判断，对病理诊断或科学研究均造成一定不良影响。申请号为201910740022.4的专利，公开了先采用10％福尔马林对小鼠肝脏进行固定3天-10天，固定的小鼠肝脏除了可以用于油红o染色外还可以用于其它病理学和组织形态学的实验，再采用15％蔗糖溶液和30％蔗糖溶液对小鼠肝脏进行梯度脱水，然后冰冻切片，并在2小时内染色、显微镜下观察，不会留下红色的结晶，虽然一定程度提高了染色结果判断的准确性，但是仍然会有油红o染色液在染色时脂滴易脱落和变形等现象，影响结果的判断。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种改良的冰冻组织油红o脂肪染色方法和应用，该染色方法具有新的染色程序，更换了一些染色试剂以及染色步骤，解决了现有的油红o染色方法在应用于冰冻切片油红o实验时脂滴脱落严重和变形的问题。
5.为实现上述目的，本发明一种改良的冰冻组织油红o脂肪染色方法，将冰冻脂肪组织切片先进行核染色，后进行脂肪染色，再用乙醇漂洗，封片，完成染色。
6.传统油红o染色方法一般为先染脂肪后染核，并且在染核后通过自来水清洗后用甘油封片，这样容易造成脂滴脱落严重和变形等问题。为解决以上问题，发明人尝试多种试验，最后发现，先对冰冻脂肪组织切片进行核染色，然后进行脂肪染色，在脂肪染色后减少用自来水清洗的步骤，可实现脂滴量留存率高和保持圆润形态的目的。
7.进一步的，所述脂肪染色方法包括以下具体步骤：
8.(1)配置试剂：分别配置油红o染色储存液、油红o工作液、60％异丙醇、4％多聚甲醛、70％乙醇、50％乙醇、苏木素、盐酸酒精、返蓝液、甘油明胶，备用；
9.(2)固定：用4％多聚甲醛浸泡冰冻脂肪组织切片4-6min，然后用纯水浸泡4-6min；
10.(3)核染色：用苏木素浸泡步骤(2)所得组织切片25-35s，然后用纯水浸泡1-1.5min；
11.(4)分化：用盐酸酒精快速浸泡步骤(3)所得组织切片，然后用纯水浸泡1-1.5min；
12.(5)返蓝：用返蓝液浸泡步骤(4)所得组织切片，然后用纯水浸泡1-1.5min；
13.(6)脂肪染色：将步骤(5)所得组织切片先用60％异丙醇浸泡8-12min，然后用油红o工作液浸泡8-12min；
14.(7)封片：先用70％乙醇浸泡步骤(6)所得组织切片1-1.5min，然后用50％乙醇漂洗后用甘油明胶封片。本技术方案中，在脂肪染色后不用自来水清洗，而是用50％酒精替代自来水漂洗，脂肪染色脂滴色泽鲜艳、脂滴保存率和形态良好，组织结构显示清晰。
15.进一步的，上述技术方案中，所述油红o染色储存液的配置方法为：将5g油红o加入到1000ml 98％异丙醇中，在磁力搅拌器上充分溶解后作为油红o染色储存液，所盛放容器塞紧和盖严。该溶液应在染色前一天配置，并在磁力搅拌器上一直搅拌至染色前，同时应盖严，防止溶液挥发而致使染液产生沉淀，而在染色时在组织上留下结晶，影响判断。
16.进一步的，上述技术方案中，所述油红o工作液的配置方法为：取所述油红o染色储存液180ml，加纯水120ml稀释，静置5-10min后过滤2-3遍，即得。该溶液应在使用前临时配置，并在2h内用完。
17.进一步的，上述技术方案中，所述4％多聚甲醛得配置方法为：取40g多聚甲醛粉末加入到1l pbs缓冲液中，然后在磁力搅拌器上加热搅拌至澄清存放。该溶液应在染色前一天配置。
18.进一步的，上述技术方案中，所述盐酸酒精为1％盐酸酒精，配置方法为：取70％乙醇1l，加入10ml浓盐酸，搅拌均匀获得；所述盐酸酒精浸泡的时间为0.5-1.5s。
19.进一步的，上述技术方案中，所述返蓝液的配置方法为：取20g七水硫酸镁、3.5g碳酸氢钠加入到1l纯水中混合均匀获得。
20.进一步的，上述技术方案中，在步骤(3)核染色完成后，用显微镜检查细胞核颜色；在步骤(7)用70％乙醇浸泡后，用显微镜检查细胞核颜色。
21.本发明还提供一种由上述改良的冰冻组织油红o脂肪染色方法在冰冻切片油红o染色实验上的应用。
22.本发明具有的有益效果是：
23.本发明通过先染核再染脂肪，减少染脂肪后过自来水的情况来达到保存脂滴量及其形态的目的，改进后的脂肪染色脂滴色泽鲜艳、脂滴保存率高和形态良好，组织结构显示清晰，并且可适用于大量冰冻切片油红o染色实验上，适用性广，对病理诊断或科学试验的研究具有重要意义。
附图说明
24.图1为本发明实施例1组织切片在200倍显微镜下的染色显微照片；
25.图2为本发明实施例2组织切片在200倍显微镜下的染色显微照片；
26.图3为对比例1组织切片在200倍显微镜下的染色显微照片；
27.图4为对比例2组织切片在200倍显微镜下的染色显微照片。
具体实施方式
28.下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例涉及的原料
若无特别说明，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。
29.下面结合实施例对本发明作进一步详细描述：
30.溶液配置：
31.油红o染色储存液(配置1l)：将5g油红o加入到异丙醇1000ml(含量98％以上)，在磁力搅拌器上充分溶解后作为油红o染色储存液(染色原液)，该溶液盛放容器必须塞紧和盖严，避免溶液挥发以致染色时发生沉淀，最好在染色前一天配置，并且在磁力搅拌器上一直搅拌至染色前取下。
32.油红o工作液(配置300ml)：取油红o染色储存液180ml，加纯水120ml稀释，静置5-10min后过滤，用2层口罩过滤2遍，该溶液应临时配置，保存不能超过1至2h。
33.60％异丙醇(配置1l)：将600ml异丙醇原液与400ml纯水混合均匀，即得。
34.4％多聚甲醛(配置1l)：取40g多聚甲醛粉末加入到1l(1
×
)pbs缓冲液中，在磁力搅拌器上加热搅拌至澄清存放，在染色前一天配置。
35.70％乙醇(配置1l)：将700ml无水乙醇与300ml纯水混合均匀，即得。
36.60％乙醇(配置1l)：将600ml无水乙醇与400ml纯水混合均匀，即得。
37.50％乙醇(配置1l)：将500ml无水乙醇与500ml纯水混合均匀，即得。
38.苏木素：将苏木素原液与纯水以体积比为1:1的比例混匀，可用有氧化膜过滤，重复使用。
39.1％盐酸酒精(配置1l)：将70％乙醇1l与10ml浓盐酸混合均匀，即得。
40.scott返蓝液(配置1l)：取20g七水硫酸镁、3.5g碳酸氢钠，加入到1l纯水中溶解后，即得。
41.甘油明胶：将20g明胶加入到50ml蒸馏水中搅拌均匀，然后加入50ml甘油，继续搅拌均匀，即得。
42.10％福尔马林-1％氯化钙：将10％福尔马林和1％氯化钙以体积比为1:1的比例混匀，即得。
43.冰冻脂肪组织切片：为预先常规冰冻切片方法制备的小鼠肝脏切片，切片厚度为8μm，-80℃冰箱保存。
44.实施例1
45.一种改良的冰冻组织油红o脂肪染色方法，包括以下具体步骤：
46.(1)准备各试剂：油红o工作液、60％异丙醇、4％多聚甲醛、70％乙醇、50％乙醇、苏木素、1％盐酸酒精、返蓝液、甘油明胶；
47.(2)固定：用4％多聚甲醛浸泡冰冻脂肪组织切片5min，然后用纯水浸泡5min；
48.(3)核染色：用苏木素浸泡步骤(2)所得组织切片30s，然后用纯水浸泡1min；
49.(4)分化：用1％盐酸酒精快速浸泡步骤(3)所得组织切片1s，然后用纯水浸泡1min；
50.(5)返蓝：用scott返蓝液浸泡步骤(4)所得组织切片，然后用纯水浸泡1min；
51.(6)脂肪染色：将步骤(5)所得组织切片先用60％异丙醇浸泡10min，然后用油红o工作液浸泡10min；
52.(7)封片：先用70％乙醇浸泡步骤(6)所得组织切片1min，然后用50％乙醇漂洗后用甘油明胶封片。
53.在200倍显微镜下观察并拍照，其照片如图1所示。从图1可以看出，经染色后的脂滴色泽鲜艳、脂滴留存率高和保持圆润形态，组织结构显示清晰。
54.实施例2
55.一种改良的冰冻组织油红o脂肪染色方法，包括以下具体步骤：
56.(1)准备各试剂：油红o工作液、60％异丙醇、4％多聚甲醛、70％乙醇、50％乙醇、苏木素、1％盐酸酒精、返蓝液、甘油明胶；
57.(2)固定：用4％多聚甲醛浸泡冰冻脂肪组织切片4min，然后用纯水浸泡6min；
58.(3)核染色：用苏木素浸泡步骤(2)所得组织切片35s，然后用纯水浸泡1.5min；
59.(4)分化：用1％盐酸酒精快速浸泡步骤(3)所得组织切片1s，然后用纯水浸泡1.5min；
60.(5)返蓝：用scott返蓝液浸泡步骤(4)所得组织切片，然后用纯水浸泡1.5min；
61.(6)脂肪染色：将步骤(5)所得组织切片先用60％异丙醇浸泡12min，然后用油红o工作液浸泡12min；
62.(7)封片：先用70％乙醇浸泡步骤(6)所得组织切片1.5min，然后用50％乙醇漂洗后用甘油明胶封片。
63.在200倍显微镜下观察并拍照，其照片如图2所示。从图2可以看出，经染色后的脂滴色泽鲜艳、脂滴留存率高和保持圆润形态，组织结构显示清晰。
64.对比例1
65.一种冰冻组织油红o脂肪染色方法，包括以下具体步骤：
66.(1)准备各试剂：油红o工作液、60％乙醇、苏木素、甘油明胶；
67.(2)用纯水充分清洗冰冻脂肪组织切片；
68.(3)用油红o工作液浸染10min；
69.(4)用60％乙醇浸泡10min至间质清晰；
70.(5)用纯水浸泡1min；
71.(6)用苏木素浸泡30s；
72.(7)用纯水浸泡1min；
73.(8)甘油明胶封片。
74.在200倍显微镜下观察并拍照，其照片如图3所示。从图3可以看出，经染色后的脂滴色泽鲜艳，但出现脂滴严重脱落和变形的现象，组织结构不清晰。
75.对比例2
76.一种冰冻组织油红o脂肪染色方法，包括以下具体步骤：
77.(1)准备各试剂：10％福尔马林-1％氯化钙，油红o工作液、50％乙醇、苏木素、甘油明胶；
78.(2)用10％福尔马林-1％氯化钙固定清洗冰冻脂肪组织切片15min；
79.(3)用油红o工作液浸染15min；
80.(4)用50％乙醇浸泡3min；
81.(5)用纯水浸泡1min；
82.(6)用苏木素浸泡1min；
83.(7)用纯水浸泡1min；
84.(8)甘油明胶封片。
85.在200倍显微镜下观察并拍照，其照片如图4所示。从图4可以看出，经染色后的脂滴色泽鲜艳，虽然有部分脂滴保持圆润形态，但仍有大部分出现脂滴脱落和变形的现象，组织结构不是很清晰。
86.综合上述结果表明，将经过本发明改进后的脂肪染色方法应用于小鼠肝脏组织切片染色后，脂滴色泽鲜艳、脂滴保存率高和形态良好，组织结构显示清晰，该改进的染色方法对病理诊断或科学试验的研究具有重要意义。
87.最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。