一种基于同化枝诱导的准噶尔无叶豆快速扩繁体系建立的方法

1.本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及到一种基于同化枝诱导的准噶尔无叶豆快速扩繁体系建立的方法。


背景技术：

2.准噶尔无叶豆(eremosparton songoricum(litv.)vass)是豆科、无叶豆属、超旱生、耐风蚀半灌木(张道远等，2008；张立远等，2002)，是新疆维吾尔自治区二级濒危植物。我国沙漠特有种，仅片断化分布于新疆古尔班通古特沙漠流动沙丘上(尹林克等，2006)；既能进行有性繁殖，又可进行无性克隆繁殖(shi et al.2010)。由于其长期在恶劣环境影响下的流沙上生长(liu et al.2011)，如：干旱少雨、大风、沙埋等，这些恶劣的环境塑造出准噶尔无叶豆抗逆性强的特点，因此其体内必定蕴含着丰富的抗逆基因资源，是沙漠植物抗逆分子机制研究的不可多得的好材料。该种也是风蚀沙地优良的固沙植物，在维护荒漠生态系统稳定性方面发挥了重要作用，同样也在区域中的能量流动、物质循环方面起着重要作用。同时该种也是珍稀濒危植物，对该种的保护和开发利用都有很重要的意义。
3.植物组织培养(tissue culture)又称离体培养或无菌培养，是指将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、未成熟的果实、花、种子等)、胚、组织(如表皮、形成层、花药组织、髓部细胞、皮层、胚乳等)、细胞(如体细胞、大孢子、小孢子等)以及原生质体在无菌及适宜的人工培养基和培养条件(温度、湿度、光照等)下，诱导产生愈伤组织、同化枝、不定根，最后获得完整植株的技术(张国强等，2006；卢思，2016；ogita s.2015)。组织培养技术已广泛应用于植物育种、扩繁及遗传转化工作中。目前组培技术不仅应用于拟南芥(arabidopsis thaliana)、烟草(nicotiana tabacum)、番茄等草本植物，还成功应用到杨树(populus)、银杏(ginkgo biloba)、牡丹(paeonia suffruticosa)等木本植物中。目前已成功进行组织培养的豆科植物、木本植物已经达到了两千多种，木本植物除了林木资源之外还有林果资源以及在市场上常见的木本观赏植物等，木本观赏植物例如主要有牡丹(高洁等，2019)、玫瑰(文书生等，2019)等。准噶尔无叶豆作为豆科、无叶豆属的植物并没有组培体系，同时多数木本植物野外生长周期普遍较长，体内富含酚类化合物和氧化酶(闫晓红等，2011))。因此，无菌培养时的材料褐化问题十分常见，这可能会影响木本植物离体组织的生长且降低再生效率。准噶尔无叶豆是沙漠环境极端耐旱的典型代表，具有抗旱、抗高温、抗风蚀沙埋等抵抗多种非生物胁迫的能力，显示出该种是挖掘优质抗旱基因的优良材料，尤其可作为豆科抗旱分子机制研究的模式种，但由于其种子存在物理和生理双层休眠限制，自然条件下种子萌发率极低(＜2％)(马文宝，2007)，主要以水平根克隆繁殖为主，随着全球气候变化加剧，其以克隆繁殖为主的种群受胁程度日益加剧，对该物种的保育和利用尤为重要和迫切。本发明建立了一整套完善的基于同化枝诱导的准噶尔无叶豆快速扩繁体系，且再生率较高，成苗效率高，为后续准噶尔无叶豆的快速扩繁及遗传转化体系的建立奠定坚实基础，对准噶尔无叶豆的保育及基因资源开发利用具有重要意义，也为其他沙漠豆科植物，尤其是
豆科木本植物的组织培养建立提供方法借鉴。本发明以同化枝为外植体，通过同化枝的再生、增殖、生根和移栽过程，首次建立了完整的基于同化枝诱导的准噶尔无叶豆快速扩繁体系，最短成苗时间为3个月。


技术实现要素：

4.本发明目的在于：为了保育濒危植物准噶尔无叶豆及为其深入基因资源挖掘奠定遗传转化体系基础，本发明提供了一种基于同化枝诱导的准噶尔无叶豆快速扩繁体系建立的方法，该方法是由外植体获得，同化枝的诱导，同化枝增殖，生根培养以及炼苗和移栽步骤完成，通过本发明提供的方法，同化枝诱导率为100％，生根率可达65％。本发明所述方法为准噶尔无叶豆的种质保存和遗传资源挖掘研究提供基础。本发明所述方法适用于多种环境，尤其是新疆，甘肃等空气湿度低的地方，大大提高了组培植物的存活率，省时省力。
5.本发明技术方案：一种基于同化枝诱导的准噶尔无叶豆快速扩繁体系建立的方法，该方法包括以下步骤：(一)同化枝的诱导：外植体的获得与处理：(1)采自新疆古尔班通古特沙漠的准噶尔无叶豆种子，剥除果荚，获得干净种子；使用分析纯浓硫酸浸泡种子4-5min，100℃水浴加热，期间用玻璃棒进行搅拌，加速种皮腐蚀，打破物理休眠，直到每个种壳表面出现3个及以上小黑点即可；随后取出浸泡后的种子用无菌水冲洗干净去除浓硫酸残留；(2)将种子倒入50ml离心管，再使用75％酒精浸泡5-10s后取出种子，用无菌水冲洗2-3遍并用无菌水浸泡3-4h；(3)将上述处理过的种子倒入无菌的离心管，在超净工作台上用75％的酒精消毒8-10s，接着用无菌水冲洗3-4次，期间不断晃动离心管；(4)将上一步的种子去除无菌水后倒入新的50ml无菌离心管中，用3％的次氯酸钠溶液中浸泡6min，期间不断搅动，之后用无菌水冲洗5次；(5)迅速将上述消毒完成的种子接种于植株培养基中，放入组培室培养，条件为25-27℃、光照时间16h/d、光照强度2000lx；(6)播种5-7天长出子叶，20天抽出同化枝，30-35天长出3-5cm同化枝作为下一步扩繁材料；(二)同化枝的增殖：将步骤(一)长出的同化枝切成1-2cm相同长度的同化枝茎段作为外植体插到不同的增殖培养基中进行增殖培养，培养条件为25-27℃、光照时间16h/d、光照强度2000lx，培养30天后长成1-4cm丛生芽，增值倍数最高达3-5倍；(三)生根培养：将步骤(二)得到的3cm同化枝，沿茎基部切下，接种到不同的生根培养基上，8-10d可在茎基部看到乳白色的根尖；(四)炼苗和移栽：选取步骤(三)中已生根20天的同化枝，在自然光照下，打开组培瓶炼苗3-4d，将同化枝从组培瓶中取出，仔细清洗根部后，移栽到不同基质中进行对比，将幼苗移栽进基质后，在移栽盆表面覆盖扎有小洞的保鲜膜，期间每天向膜内喷水，光照强度1000lx，光照时间为16h/d，培养温度为24
±
2℃，7d后揭开保鲜膜呈半开状态，正常光照下培养且每天向膜内喷水，10d后即可完全撤去保鲜膜，此后恢复正常浇水。
6.进一步优化设计，步骤(一)中所述的植株培养基中为ms基本培养基，并且附加30g/l蔗糖、6.0g/l琼脂，ph值调整为5.8-6.0，所述的ms基本培养基为(murashige and skoog medium)。
7.进一步优化设计，步骤(二)中所述增殖培养基为以ms为基础培养基，附加30g/l蔗糖，琼脂6g/l，激素为6-ba 0.4mg/l，naa 0.1mg/l，为最优增殖培养基，ms基础培养基灭菌前调ph至6.0，然后高温高压灭菌，温度为115℃，30min，备用，所述的激素为6-ba为6-苄氨
基嘌呤(6-benzylaminopurine)，naa为萘乙酸(1-naphthlcetic acid)。
8.进一步优化设计，步骤(三)中所述生根培养基为以wpm为基础培养基，附加蔗糖25g//l，琼脂6g/l时最优，wpm为基础培养基灭菌前调ph至6，然后高温高压灭菌，温度为115℃，30mmin，备用，所述的wpm基本培养基为(woody plant medium)。
9.进一步优化设计，步骤(四)中所述基质为三种不同基质，分别是纯沙土、营养土：蛭石：珍珠岩为3：1：1、和沙土：蛭石为1：1，其中最佳基质为沙土∶蛭石为1∶1。
10.本发明有益效果为：(1)本发明基于同化枝诱导的准噶尔无叶豆快速扩繁体系建立的方法进行了系统的研究。在ms基本培养基上同化枝生成率为100％。诱导的同化枝在移植到同化枝增殖培养基30d后，可实现3-5倍的增值倍数，丛生芽长至约1-4cm；3cm株高的幼苗可作为生根的材料，在生根培养基上培养约1个月后，生根率可达65％。同化枝颜色深绿，油亮，长势旺盛。本发明所用移栽方法适用于多种环境，尤其是新疆，甘肃等空气湿度低的地方，大大提高了组培植物的存活率。整个再生过程，最快只需3个月；(2)本发明对比了不同浓度的6-ba细胞分裂素在准噶尔无叶豆同化枝分化时影响；(3)本发明所用的生根培养基是ms和wpm培养基，同时添加iba和naa两种生长素作为对比，研究出最佳的生根培养基；(4)同化枝是植物转基因常用的浸染材料，本发明能高效的诱导同化枝的再生，为准噶尔无叶豆基因的挖掘，精准分子育种工作的实现提供了可能。
附图说明
11.图1为准噶尔无叶豆种子萌发后40天的幼苗(ms培养基)；图2为细胞分裂素6-ba对同化枝再生速率的影响，其中a：同化枝在0天、15天和35天的表型观察；b：每个同化枝从0-35天的新生侧芽数(每五天观察一次)；c：每个同化枝从0-35天的新生侧芽的平均高度(每五天观察一次)；图中不同字母表示经duncan
′
s法检验在0.05水平上差异显著，p≤0.05，显著性检验是基于25组数据的标准误差(se
±
25)；图3为不同培养基对35天同化枝生根的影响，其中a：同化枝根的生长表型；b：同化枝生根率的统计(％)；c：同化枝根长的统计；同化枝生根培养基选用了ms和wpm培养基，每种培养基选择三种不同的蔗糖浓度(30mg/l，25mg/l，15mg/l)；图中不同字母表示经duncan
′
s法检验在0.05水平上差异显著，p≤0.05，显著性检验是基于25组数据的标准误差(se
±
25)；图4为准噶尔无叶豆同化枝的移栽情况，其中a：同化枝移栽的生长情况；b：同化枝移栽后幼苗的成活率；图中不同字母表示经duncan
′
s法检验在0.05水平上差异显著，p≤0.05，显著性检验是基于25组数据的标准误差(se
±
25)。
具体实施方式
12.以下结合具体实施方法进一步说明本发明，而非限制本发明。
13.实施例1，本发明所述的一种基于同化枝诱导的准噶尔无叶豆快速扩繁体系建立的方法，该方法以同化枝为外植体，同化枝的诱导，同化枝的增殖，生根培养以及炼苗和移栽，具体操作按下列步骤进行：(一)外植体的获得与处理：(1)准噶尔无叶豆种子采自古尔班通古特沙漠，剥除果荚，获得干净种子；使用分析纯浓硫酸浸泡种子4-5min，100℃水浴加热，期间用玻璃棒进行搅拌，加速种皮腐蚀，打破物理休眠，直到每个种壳表面出现3个及以上小黑点即可；(2)随后取出浸泡后的种子用无菌水冲洗干净去除浓硫酸残留；将种子倒入50ml离心管，再使用75％酒精浸泡5-10秒后取出种子，用无菌水冲洗2-3遍并浸泡3-4h；(3)
将上述处理过的种子倒入无菌的离心管，在超净工作台上用75％的酒精消毒约10s，接着用无菌水冲洗3-4次，期间不断晃动离心管；(4)将上一步的种子倒入新的50ml离心管中，用3％的次氯酸钠溶液中浸泡6min，期间不断搅动，之后用无菌水冲洗5次；(5)迅速将上述消毒完成的种子接种于ms培养基，加入30g/l蔗糖、6.0g/l琼脂，ph值调整为5.8～6.0，放入组培室培养，25-27℃、光照时间16h/d、光照强度2000lx；(6)播种约7天长出子叶，20天抽出同化枝，30-35天长出3-5cm同化枝用于下一步扩繁材料；(二)同化枝的增殖：将步骤(一)长出的同化枝切成，1-2cm相同长度的同化枝茎段作为外植体插到增殖培养基中进行增殖培养，培养条件为25-27℃、光照时间16h/d、光照强度2000lx，培养30天后长成1-4cm丛生芽，增值倍数达3-5倍，其中同化枝增殖培养基为以ms为基础培养基，附加30g/l蔗糖，琼脂6g/l，激素为6-ba 0.4mg/l，naa 0.1mg/l，灭菌前调ph至6.0，高温高压灭菌115℃，30分钟。
14.表1：不同6-ba浓度对同化枝诱导的影响
15.表1包括5种不同激素浓度培养基下得到的同化枝诱导率的实验数据；在添加有0.4mg/l6-ba,0.1mg/lnaa的培养基中，外植体培养30天，可实现3-5倍的增值倍数(见图2)。(三)生根培养：将步骤b得到的3cm同化枝，沿茎基部切下，接种到生根培养基上，约10天可在茎基部看到乳白色的根尖，其中生根培养基为以wpm为基础培养基，蔗糖25g//l，琼脂6g/l，灭菌前调ph至6.0，高温高压灭菌115℃，30分钟。
16.表2：不同培养基对同化枝生根的影响
17.表2包括18种不同激素浓度培养基下得到的诱导生根的实验数据；在基本培养基为wpm培养基时不添加外源生长素时，生根率可达65％。ms作为基本培养基时，对同化枝诱导生根效果不是很好，添加适量生长素会提高同化枝生根率，见图3。
18.(四)炼苗和移栽：选取已生根20天的无叶豆同化枝，在自然光照下，打开组培瓶炼苗3～4d，将无叶豆同化枝从组培瓶中取出，仔细清洗根部后，移栽到不同的3种基质中，将幼苗移栽进基质后，在移栽盆表面覆盖扎有小洞的保鲜膜，期间每天向膜内喷水，光照强度减半，光照时间为16小时，培养温度为24
±
2℃，7天后揭开保鲜膜呈半开状态，正常光照下培养且仍需每天向膜内喷水，10天后即可完全撤去保鲜膜，此后恢复正常浇水，最佳基质为沙土:蛭石为1:1，见图4。