用于使用间充质谱系前体或干细胞治疗过度炎症的方法与流程

1.本公开涉及用于治疗或预防有需要的受试者的过度炎症的方法。


背景技术：

2.与如病毒性感染等多种病状相关的呼吸系统疾病在普通群体中是有问题的。在许多情况下，其伴有过度炎症，所述过度炎症使肺部的病状加重。
3.因此，患有过度炎症的患者，尤其是在继发于病毒性感染时仍然存在未满足的治疗需求，需要新的治疗选择。


技术实现要素：

4.本发明人已经惊奇地确定，可以通过施用间充质谱系前体细胞或干细胞(mlpsc)来治疗过度炎症。
5.因此，在第一实例中，本公开涉及一种治疗或预防有需要的人类受试者的过度炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质谱系前体或干细胞(mlpsc)的组合物。
6.在一实例中，所述过度炎症是由病毒性感染引起的。所述病毒性感染可以是例如由鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)或冠状病毒引起的。
7.在一实例中，所述过度炎症是由冠状病毒感染引起的。所述冠状病毒可以是例如严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、covid-19、229e、nl63、oc43或khu1。在一实例中，所述冠状病毒是sars-cov、mers-cov或covid-19(sars-cov-2)。
8.在另一个实例中，所述受试者还患有急性呼吸窘迫综合征(ards)。在另一个实例中，所述受试者患有多系统炎性综合征。在此实例中，所述受试者可以小于21岁。在一实例中，患有mis的所述受试者是儿童。在另一个实例中，所述受试者患有病毒性心肌炎。
9.因此，在一实例中，本公开涉及一种治疗有需要的人类受试者的ards的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质谱系前体或干细胞(mlpsc)的组合物。
10.在一实例中，所述mlpsc已经被冷冻保存和解冻。在一实例中，所述mlpsc是从中间冷冻保存的mlpsc群体培养扩增的。在另一个实例中，所述mlpsc被培养扩增至少约5次传代。在一实例中，所述mlpsc每百万mlpsc表达至少13pg tnfr1。在一实例中，所述mlpsc每百万mlpsc表达约13pg至约44pg tnfr1。在一实例中，培养扩增的mlpsc被培养扩增至少20次群体倍增。在另一个实例中，培养扩增的mlpsc被培养扩增至少30次群体倍增。在一实例中，所述mlpsc是间充质干细胞(msc)。在另一个实例中，所述mlpsc是同种异体的。例如，所述mlpsc可以是同种异体的msc。
11.在另一个实例中，所述mlpsc被修饰以携带或表达抗病毒药物或溶栓剂。在一实例中，所述抗病毒药物是瑞德西韦(remdesivir)。在一实例中，所述溶栓剂选自由以下组成的组：eminase(阿尼普酶(anistreplase))、retavase(瑞替普酶(reteplase))、streptase(链
激酶(streptokinase/kabikinase))。
12.在另一个实例中，所述mlpsc被基因修饰以表达抗病毒肽或编码所述抗病毒肽的核酸。
13.在一实例中，所述组合物是静脉内施用的。
14.在一实例中，本公开的方法涵盖施用介于1x107个与2x108个之间的细胞。例如，可以在第0天、第30天、第60天和第90天施用多剂量的介于1x107与2x108个之间的细胞。在一实例中，本公开的方法涵盖每剂量施用约1x108个细胞。在一实例中，向所述受试者施用两剂量。
15.在一实例中，所述受试者的循环crp水平在治疗后降低。在一实例中，所述受试者的白细胞水平在治疗后降低。在一实例中，所述受试者的d-二聚体水平在治疗后降低。在一实例中，所述受试者的d-二聚体水平在治疗后降低到5ug/ml以下。在一实例中，所述受试者的bnp水平在治疗后降低。在一实例中，所述受试者的fio2水平在治疗后降低。在一实例中，所述受试者的p/f比率在治疗后增加。在一实例中，所述受试者的lvef％在治疗后增加。
16.在另一个实例中，所述组合物进一步包括plasma-lyte a、二甲亚砜(dmso)、人血清白蛋白(hsa)。在一实例中，所述组合物进一步包括plasma-lyte a(70％)、dmso(10％)、hsa(25％)溶液，所述hsa溶液包括5％hsa和15％缓冲液。
17.在一实例中，所述组合物包括大于6.68
×
106个活细胞/ml。
18.在另一个实例中，本公开涉及一种治疗或预防有需要的人类受试者的多系统炎性综合征(mis)的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质谱系前体或干细胞(mlpsc)的组合物。在一实例中，所述受试者可以是儿童。
19.在另一个实例中，本公开涉及一种治疗或预防有需要的人类受试者的与d-二聚体水平升高相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质谱系前体或干细胞(mlpsc)的组合物。在一实例中，所述疾病是由静脉阻塞引起的。在一实例中，所述疾病是由动脉阻塞引起的。在一实例中，所述疾病是由血栓形成引起的。在一实例中，所述疾病是由肺栓塞引起的。在一实例中，治疗将所述受试者的d-二聚体水平降低到15μg/ml以下。在一实例中，所述受试者在治疗前的lvef小于55％。在一实例中，所述受试者在治疗前的lvef小于52％。在另一个实例中，所述受试者的bnp水平大于400pg/ml。在另一个实例中，所述受试者的bnp水平大于500pg/ml。
20.在另一个实例中，本公开涉及一种治疗或预防有需要的人类受试者的与d-二聚体水平升高相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质谱系前体或干细胞(mlpsc)的组合物。在一实例中，所述疾病是血栓形成或栓塞。在一实例中，所述血栓形成是动脉血栓形成。在一实例中，所述栓塞是肺栓塞。
21.在另一个实例中，本公开涉及一种治疗或预防有需要的人类受试者的血栓形成的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质谱系前体或干细胞(mlpsc)的组合物。在一实例中，所述血栓形成是静脉血栓形成。在另一个实例中，所述血栓形成是动脉血栓形成。在另一个实例中，本公开涉及一种治疗或预防有需要的人类受试者的肺栓塞的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质谱系前体或干细胞(mlpsc)的组合物。在一实例中，治疗将所述受试者的d-二聚体水平降低到15μg/ml以下。在一实例中，所述受试者在治疗前的lvef小于55％。在一实例中，所述受试者在治疗前的lvef小于52％。在另一个实例
中，所述受试者的bnp水平大于400pg/ml。在另一个实例中，所述受试者的bnp水平大于500pg/ml。在一实例中，所述血栓形成是动脉血栓形成。
22.在一实例中，所施用的mlpsc是间充质干细胞(msc)。在一实例中，所述mlpsc是同种异体的。
附图说明
23.图1：初步结果1
–
pao2/fio2；白细胞计数。
24.图2：初步结果1
–
crp；铁蛋白。
25.图3：初步结果3
–
pao2/fio2；白细胞计数。
26.图4：初步结果3
–
crp；铁蛋白。
27.图5：结果总结。
28.图6：最低点pao2/fio2比率(n＝5)。
29.图7：中值pao2/fio2比率(n＝5)。
30.图8：循环crp水平(n＝5)。
31.图9：肌酸酐水平(n＝5)。
32.图10：铁蛋白水平(n＝5)。
33.图11：根据从细胞疗法输注开始的时间的事件生存泳道图(swimmer plot)。左侧的数字表示如表2中所示的个体患者标识符。
34.图12：根据从细胞疗法输注开始的时间的中值p:f比率和四分位距。
35.图13：根据细胞疗法输注的时间的中值c反应蛋白水平和四分位距。
36.图14：详细的临床过程；患者1。
37.图15：详细的临床过程；患者2。
38.图16：lvef％、bnp(pg/ml)和d-二聚体(ug/ml)水平的比较。
具体实施方式
39.贯穿本说明书，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组的提及应被视为涵盖这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一个和多个(即一种或多种)。
40.本领域的技术人员将会了解，可对在此描述的本公开加以除具体所描述的那些之外的变化和修改。应当理解，本公开包含所有此类变化和修改。本公开还包含本说明书中个别或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
41.本公开的范围不受本文所述的具体实施例的限制，这仅出于例示的目的。如本文所描述的，功能等效的产物、组合物和方法显然在本公开的范围内。
42.除非另有明确说明，否则本文公开的任何实例在进行必要的修改后应被视为适用于任何其它实例。
43.除非另外特别说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、干细胞分化、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学)的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
44.除非另有说明，否则本公开中使用的外科手术技术是本领域技术人员熟知的标准程序。
45.获得和富集间充质谱系干细胞或前体细胞群体的方法是本领域已知的。例如，间充质谱系干细胞或前体细胞的富集群体可以通过使用流式细胞术和基于使用在间充质谱系干细胞或前体细胞上表达的细胞表面标志物的细胞分选程序来获得。
46.本文引用或参考的所有文件，以及本文引用的文件连同本文提及的任何产品的任何制造商说明书、说明、产品规范和产品表或通过引用并入本文的任何文件中引用或参考的所有文件都特此通过全文引用的方式并入本文。
47.所选定义
48.术语“和/或”，例如“x和/或y”应理解为意指“x和y”或“x或y”，并且应被视为对两种含义或任一含义提供明确的支持。
49.如本文所使用的，除非相反地说明，否则术语“约”是指指定值的 /-10％，更优选地 /-5％。
50.贯穿本说明书，词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体应当被理解为暗示包含所陈述要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组。
51.如本文所使用的，除非上下文明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包含单数和复数指示物。
[0052]“分离的”或“纯化的”意指已与其自然环境的至少一些组分分离的细胞。此术语包含细胞与其自然环境的总体物理分离(例如从供体去除)。术语“分离的”包含通过例如解离改变细胞与和其直接相关的相邻细胞的关系。术语“分离的”不是指组织切片中的细胞。当用于指细胞群体时，术语“分离的”包含由本公开的分离的细胞增殖产生的细胞群体。
[0053]
在本公开的上下文中使用的术语“传代(passage)”、“传代(passaging)”或“传代培养(sub-culture)”是指已知的细胞培养技术，所述技术用于使细胞在培养条件下长时间存活和生长，使得细胞数量可以持续增加。细胞系的传代培养程度通常表示为“传代数量”，一般用来指细胞被传代培养的次数。在一实例中，一次传代包括去除非粘附细胞并留下粘附间充质谱系前体或干细胞。然后可以将此类间充质谱系前体或干细胞从底物或烧瓶中解离(例如，通过使用如胰蛋白酶或胶原酶等蛋白酶)，可以添加培养基，可以进行任选的洗涤(例如，通过离心)，并且然后间充质谱系前体或干细胞可以重新铺板或重新接种到一个或多个总表面积更大的培养容器中。然后，间充质谱系前体或干细胞可以继续在培养物中扩增。在另一个实例中，去除非粘附细胞的方法包含非酶处理步骤(例如，用edta)。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在汇合处或附近传代(例如，约75％至约95％汇合)。在一实例中，以约10％、约15％或约20％细胞/ml培养基的浓度接种间充质谱系前体或干细胞。
[0054]
如在本公开的上下文中使用的术语“培养基”(“medium”或“media”)包含培养物中的细胞周围环境的组分。设想培养基有助于和/或提供适合于允许细胞生长的条件。培养基可以是固体、液体、气体或相和材料的混合物。培养基可以包含液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。示例性的气体培养基包含在培养皿或其它固相或半固相载体上生长的细胞所暴露的气相。
[0055]
如本文所使用的，术语“治疗”(treating)、“治疗”(treat)或“治疗”(treatment)
包含施用间充质谱系干细胞或前体细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子的群体，从而减少或消除过度炎症的至少一种症状。在一实例中，治疗包含施用培养扩增的间充质谱系干或前体细胞的群体。在一实例中，治疗反应是相对于基线确定的。
[0056]
在一实例中，治疗是基于受试者的crp水平确定的。在其它实例中，治疗是基于白细胞计数、p/f比率或铁蛋白水平中的一个或多个确定的。在一实例中，与基线相比，治疗使p/f提高了50。在另一个实例中，治疗使受试者的p/f增加到200以上。在另一个实例中，治疗使受试者的p/f增加到250以上。
[0057]“c反应蛋白”或“crp”是一种炎性介体，在急性炎性复发的条件下，所述炎性介体的水平会升高，并且一旦炎症消退，其水平会迅速正常化。
[0058]
在一实例中，治疗是基于crp、降钙素原(pct)和铁蛋白水平的降低来确定的。
[0059]
在一实例中，与基线相比，治疗使crp降低了至少100mg/dl。在另一个实例中，与基线相比，治疗使crp降低了至少150mg/dl。在一实例中，循环crp水平的降低是指crp降低到80mg/dl或更低。在一实例中，循环crp水平的降低是指crp降低到60mg/dl或更低。在另一个实例中，循环crp水平的降低是指crp降低到50mg/dl或更低。在另一个实例中，循环crp水平的降低是指crp降低到40mg/dl或更低。在另一个实例中，循环crp水平的降低是指crp降低到20mg/dl或更低。在另一个实例中，循环crp水平的降低是指crp降低到10mg/dl或更低。在另一个实例中，循环crp水平的降低是指crp降低到5mg/dl或更低。在另一个实例中，循环crp水平的降低是指crp降低到3mg/dl或更低。
[0060]
在另一个实例中，治疗使crp降低到0.5mg/dl与60mg/dl之间。在另一个实例中，治疗使crp降低到0.5mg/dl与30mg/dl之间。在另一个实例中，治疗使crp降低到0.5mg/dl与10mg/dl之间。
[0061]
在一实例中，治疗使铁蛋白水平降低到2000mg/dl以下。在另一个实例中，与基线相比，治疗使铁蛋白水平降低了至少500mg/dl。在另一个实例中，与基线相比，治疗使铁蛋白水平降低了至少750mg/ml。在另一个实例中，治疗使铁蛋白水平降低到700mg/dl以下。
[0062]
在另一个实例中，治疗使pct水平降低到0.12ng/ml以下。在另一个实例中，治疗使pct水平降低到0.1ng/ml以下。在另一个实例中，治疗使pct水平降低到0.08ng/ml以下。
[0063]
在一实例中，在患有ards的患者中，治疗使所述受试者的ards从中度改善为重度。在此实例中，与基线相比，治疗使受试者的p/f提高了至少50。在一实例中，治疗使受试者的p/f提高到200以上。
[0064]
在一实例中，治疗降低了il-6水平。在另一个实例中，治疗是基于甘油三酯水平的变化的。
[0065]
在一实例中，治疗是基于肺活量测定测量结果确定的。在一实例中，肺活量测定测量结果是基于美国呼吸护理协会(american association for respiratory care，aarc)肺活量测定临床实践指南(美国呼吸护理协会：aarc临床实践指南：肺活量测定(american association for respiratory care:aarc clinical practice guideline:spirometry),1996新版,《呼吸治疗(respir care.)》,41:629-638)。
[0066]
在一实例中，治疗改善了受试者的fev1。在一实例中，治疗改善了受试者的fvc。在另一个实例中，治疗改善了受试者的fev1/fvc。在另一个实例中，治疗改善了受试者的6分钟步行测试。
[0067]
在一实例中，6分钟步行测试结果是基于ats声明确定的：六分钟步行测试指南(2002)《美国呼吸与危症监护医学杂志(am j respir crit care med.)》,166:111-7。
[0068]“d-二聚体”是纤溶酶在凝块上作用后形成的纤维蛋白的循环末端分解产物之一。d-二聚体水平是主要血栓形成和凝血的标志物。在一实例中，根据本公开进行的治疗降低了受试者的d-二聚体水平并因此降低了血栓形成和凝血的风险。在一实例中，治疗降低了受试者的d-二聚体水平。在一实例中，治疗将受试者的d-二聚体水平降低到25μg/ml以下。在一实例中，治疗将受试者的d-二聚体水平降低到20μg/ml以下。在一实例中，治疗将受试者的d-二聚体水平降低到15μg/ml以下。在一实例中，治疗将受试者的d-二聚体水平降低到10μg/ml以下。在一实例中，治疗将受试者的d-二聚体水平降低到5μg/ml以下。在一实例中，治疗将受试者的d-二聚体水平降低到3μg/ml以下。在一实例中，治疗将受试者的d-二聚体水平降低到1μg/ml与15μg/ml之间。在一实例中，治疗将受试者的d-二聚体水平降低到1μg/ml与10μg/ml之间。
[0069]
在一实例中，根据本公开的方法进行的治疗降低了受试者血栓形成的风险。在一实例中，相对于未接受治疗的受试者，所述受试者的风险降低。在一实例中，治疗降低了血栓形成的风险，所述血栓形成是动脉血栓形成。因此，在一实例中，治疗降低了心脏病发作或中风的风险。
[0070]“b型利钠肽”或“bnp”是一种由心脏产生的激素，其响应于心脏内部压力的变化而释放。因此，bnp在心力衰竭的背景下是常用的评估标志物。相对于心脏正常的受试者，心功能减退的受试者的bnp水平通常较高。在一实例中，治疗改善了受试者的bnp水平。例如，使用本公开的方法，bnp水平可以从基线或治疗前观察到的水平降低。在一实例中，bnp水平降低到小于500pg/ml。在另一个实例中，bnp水平降低到小于400pg/ml。在另一个实例中，bnp水平降低到小于300pg/ml。在另一个实例中，bnp水平降低到小于200pg/ml。在另一个实例中，bnp水平降低到小于150pg/ml。在另一个实例中，bnp水平降低到100pg/ml与400pg/ml之间。在另一个实例中，bnp水平降低到100pg/ml与300pg/ml之间。
[0071]
在一实例中，治疗改善了受试者的左心室射血分数(lvef)百分比。例如，lvef％可以增加到大于55％。在一实例中，lvef％增加到大于58％。在另一个实例中，lvef％增加到大于60％。在另一个实例中，lvef％增加到大于65％。在一实例中，lvef通过超声心动图测量。
[0072]
如本文所使用的，术语“预防”(prevent)或“预防”(preventing)包含施用间充质谱系干细胞或前体细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子的群体，从而停止或抑制过度炎症的至少一种症状的发展。
[0073]
在本公开的上下文中所使用的术语“过度炎症”是指体内严重和持续的炎性过程。例如，过度炎症可以指气道和/或肺部、肾脏或肝脏中严重且持续的炎性过程。以此方式，过度炎症可能影响身体的多个器官以及其血管系统。在一实例中，过度炎症是由病毒性感染引发的。在一实例中，过度炎症与细胞因子风暴或细胞因子释放综合征(crs)相关。在一实例中，细胞因子风暴或crs涉及炎性细胞因子(如il-6)的显著释放。
[0074]
在一实例中，过度炎症导致继发性(或获得性)噬血细胞淋巴组织细胞增多症(shlh)。因此，在一实例中，本公开的方法涵盖治疗噬血细胞淋巴组织细胞增多症(shlh)。
[0075]
在另一个实例中，过度炎症与crp、pct、il-6和/或铁蛋白升高相关。例如，铁蛋白
可以大于2000mg/dl。在另一个实例中，铁蛋白大于2500mg/dl。在一实例中，过度炎症与细菌感染相关。在一实例中，根据本公开治疗的受试者的循环crp水平升高。例如，根据本公开治疗的受试者的循环crp水平可以大于100mg/dl。在另一个实例中，被治疗的受试者的循环crp水平大于120mg/dl。在另一个实例中，被治疗的受试者的循环crp水平大于150mg/dl。在另一个实例中，被治疗的受试者的循环crp水平介于90mg/dl与300mg/dl之间。
[0076]
在其它实例中，过度炎症与甘油三酯升高或纤维蛋白原降低相关。例如，根据本公开治疗的受试者的甘油三酯水平可以》1.5mmol/l。在另一个实例中，被治疗的受试者的甘油三酯水平》2、》3、》4mmol/l。在另一个实例中，被治疗的受试者的甘油三酯水平介于1.5与5mmol/l之间。在另一个实例中，被治疗的受试者的纤维蛋白原水平小于或等于2.5g/l。在另一个实例中，被治疗的受试者的纤维蛋白原水平小于2.5g/l。
[0077]
在一实例中，过度炎症导致多系统炎性综合征(mis)。例如，过度炎症可能导致儿童mis(mis-c)。
[0078]
在一实例中，过度炎症是由病毒性感染引起的。例如，过度炎症可以是由鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)或冠状病毒引起的。在一实例中，过度炎症可以是由冠状病毒引起的。例如，冠状病毒可以是冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)或covid-19。在一实例中，过度炎症是由爱泼斯坦巴尔病毒(epstein-barr virus，ebv)或单纯疱疹病毒(hsv)引起的。
[0079]
在一实例中，本公开的方法抑制受试者的疾病进展或疾病并发症。对受试者的疾病进展或疾病并发症的“抑制”意指预防或减少受试者的疾病进展和/或疾病并发症。因此，在一实例中，本公开的方法抑制过度炎症进展为shlh。
[0080]
如本文所使用的，术语“受试者”是指人类受试者。例如，受试者可以是成年人。在另一个实例中，受试者可以是儿童。在另一个实例中，受试者可以是青少年。如“受试者”、“患者”或“个体”等术语是可以在本公开的上下文中互换使用的术语。
[0081]
根据本公开治疗的受试者可能具有指示过度炎症的症状。示例性症状可以包含疲劳、呼吸困难、呼吸短促、无力运动或运动能力下降、有或无血液或粘液的咳嗽、吸气或呼气时疼痛、喘息、胸部紧迫感、不明原因的体重减轻和肌肉骨骼痛。
[0082]
在另一个实例中，所述受试者的年龄为18-75岁。在一实例中，所述受试者的年龄大于50岁。在另一个实例中，所述受试者患有ards。在另一个实例中，所述受试者患有肺炎。在一实例中，所述受试者小于30岁。在实例中，所述受试者小于21岁。
[0083]
在另一个实例中，所述受试者患有继发于病毒性感染的ards。在一实例中，所述受试者的ards继发于鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)或冠状病毒感染。在一实例中，所述受试者的ards继发于冠状病毒感染。例如，所述受试者的ards可能继发于sars-cov、mers-cov或covid-19感染。
[0084]
在一实例中，本公开的方法预防或治疗患有多系统炎性综合征(mis)的受试者。在一实例中，所述受试者是患有mis的儿童。例如，患有mis的受试者可以介于1个月与18岁之间。在一实例中，所述受试者患有急性心力衰竭。心力衰竭(hf)是一种临床综合征，其通常由一系列症状(呼吸困难、端坐呼吸、下肢肿胀)和体征(颈静脉压升高、肺充血)表征。急性心力衰竭被广泛定义为快速发作新的或恶化的心力衰竭体征和症状。在一实例中，所述受试者的左心室射血分数降低。例如，所述受试者的lvef可能小于45％。在一实例中，所述
lvef小于40％。在另一个实例中，所述lvef小于30％。
[0085]
在一实例中，患有mis的受试者满足以下标准：
[0086]-以下中的一种或多种：
[0087]
ο低血压或休克(心源性或血管源性)；
[0088]
ο严重心脏疾病的特征，包含但不限于心肌炎、心包炎或瓣膜炎、肌钙蛋白/probnp显著升高或冠状动脉异常；
[0089]
ο其它严重终末器官受累，包含但不限于神经系统或肾脏疾病(仅不包括严重呼吸道疾病)；
[0090]
或者
[0091]-以下中的两种或多种：
[0092]
ο斑丘疹；
[0093]
ο双侧非化脓性结膜炎；
[0094]
ο粘膜皮肤炎性体征(口、手或脚)；
[0095]
ο急性胃肠道症状(腹泻、呕吐或腹痛)。
[0096]
在一实例中，符合上述参考mis标准的受试者出现发烧(温度大于或等于38摄氏度)。
[0097]
在另一个实例中，患有mis的患者表现出炎性标志物升高。例如，受试者可能表现出以下中的一种或多种：嗜中性白血球增多症、淋巴细胞减少症、血小板减少症、低白蛋白血症、crp升高、红细胞沉降率(esr)、纤维蛋白原、d-二聚体、铁蛋白、乳酸脱氢酶(ldh)、白细胞介素6(il-6)、降钙素原升高。在一实例中，所述受试者具有以下中的两种或多种：嗜中性白血球增多症、淋巴细胞减少症、血小板减少症、低白蛋白血症、crp升高、esr、纤维蛋白原、d-二聚体、铁蛋白、ldh、il-6、降钙素原升高。
[0098]
在一实例中，所述受试者患有心肌炎、心包炎或瓣膜炎中的一种或多种。在一实例中，所述受试者患有病毒诱导的心肌炎、心包炎或瓣膜炎。例如，所述受试者可能患有病毒性心肌炎。
[0099]
在一实例中，所述mis继发于sars-cov、mers-cov或covid-19感染。
[0100]
在另一个实例中，本公开的方法预防或治疗患有轻度ards的受试者。在另一个实例中，本公开的方法预防或治疗患有中度ards的受试者。在另一个实例中，本公开的方法预防或治疗患有重度ards的受试者。在另一个实例中，本公开的方法预防或治疗患有中度或重度ards的受试者。在另一个实例中，本公开的方法预防或治疗患有中度、重度或非常重度ards的受试者。
[0101]
术语“血栓形成”在本文中用于指血栓或血凝块的形成。在一实例中，血栓形成是“动脉血栓形成”，其中在动脉中形成血凝块。此类血凝块对受试者尤其危险，因为其可能阻碍血液流向如心脏或脑等主要器官。在一实例中，血栓形成是“静脉血栓形成”，其中在静脉中形成血凝块。
[0102]
术语“溶栓剂”在本文中用于指本公开中分解血凝块的组合物。在一实例中，本公开的溶栓组合物降低了受试者血栓形成的风险。在一实例中，相对于没有接受所述组合物的受试者，所述受试者的风险降低。在一实例中，施用所述组合物降低了动脉血栓形成的风险。因此，在一实例中，施用所述组合物降低了心脏病发作或中风的风险。
[0103]
术语“肺栓塞”在本文中用于指通过血流从身体其它部位移动的物质阻塞肺部动脉。
[0104]
如本文所使用的，术语“未经基因修饰的”是指未通过用核酸转染修饰的细胞。为避免疑义，在本公开的上下文中，用编码ang1的核酸转染的间充质谱系前体或干细胞将被认为是经基因修饰的。
[0105]
术语“总剂量”在本公开的上下文中用于指根据本公开治疗的受试者接受的细胞总数。在一实例中，所述总剂量由细胞的一次施用组成。在另一个实例中，所述总剂量由细胞的两次施用组成。在另一个实例中，所述总剂量由细胞的三次施用组成。在另一个实例中，所述总剂量由细胞的四次或更多次施用组成。例如，所述总剂量可以由细胞的两次至四次施用组成。
[0106]
间充质谱系前体细胞
[0107]
如本文所使用的，术语“间充质谱系前体或干细胞(mlpsc)”是指未分化的多能细胞，所述多能细胞具有自我更新的能力同时保持多能性以及分化为许多间充质来源(例如，成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞和肌腱)或非中胚层来源(例如，肝细胞、神经细胞和上皮细胞)的细胞类型的能力。为避免疑义，“间充质谱系前体细胞”是指可以分化为如骨、软骨、肌肉和脂肪细胞以及纤维结缔组织等间充质细胞的细胞。
[0108]
术语“间充质谱系前体或干细胞”包含亲本细胞以及其未分化的后代。所述术语还包含间充质前体细胞、多能基质细胞、间充质干细胞(msc)、血管周围间充质前体细胞以及其未分化的后代。
[0109]
间充质谱系前体或干细胞可以是自体的、同种异体的、异种的、同源的(syngenic)或同基因的(isogenic)。自体细胞是从其将被重新植入的同一个体中分离的。同种异体细胞是从同一物种的供体中分离的。异种细胞是从另一物种的供体中分离的。同源或同基因细胞是从基因相同的生物体中分离的，如双胞胎、克隆或高度近交的研究动物模型。
[0110]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞是同种异体的。在一实例中，同种异体间充质谱系前体或干细胞被培养扩增并冷冻保存。
[0111]
间充质谱系前体或干细胞主要存在于骨髓中，但也显示存在于多种宿主组织中，包含例如脐带血和脐带、成人外周血、脂肪组织、小梁骨和牙髓。其也存在于皮肤、脾脏、胰腺、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中；并且能够分化成种系，如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，间充质谱系前体或干细胞能够分化成大量细胞类型，包含但不限于脂肪、骨、软骨、弹性组织、肌肉和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定谱系定型和分化途径取决于来自机械影响和/或如生长因子、细胞因子和/或宿主组织建立的局部微环境条件等内源性生物活性因子的各种影响。
[0112]
术语“富集的”、“富集”或其变体在本文中用于描述与未处理的细胞群体(例如，在其自然环境中的细胞)相比，一种特定细胞类型的比例或多种特定细胞类型的比例增加的细胞群体。在一实例中，富集间充质谱系前体或干细胞的群体包括至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％的间充质谱系前体或干细胞。在此方面，将采用术语“富集间充质谱系前体或干细胞的细胞群体”来明确支持术语“包括x％间充质谱系前体或干细胞的细胞群体”，其中x％是如本文叙述的百分比。在一些实例中，间充质谱系前体或干细胞可以形成克隆源性集落，例如cfu-f(成纤维细胞)或其子集
(例如，50％或60％或70％或70％或90％或95％)可以具有此活性。
[0113]
在本公开的一实例中，间充质谱系前体或干细胞是间充质干细胞(msc)。msc可以是均质组合物或可以是在msc中富集的混合细胞群体。可以通过培养粘附骨髓或骨膜细胞获得均质msc组合物，并且可以通过用独特的单克隆抗体鉴定的特定细胞表面标志物来鉴定msc。例如，在美国专利第5,486,359号中描述了一种用于获得在msc中富集的细胞群体的方法。msc的替代性来源包含但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨和软骨膜。在一实例中，msc是同种异体的。在一实例中，msc是冷冻保存的。在一实例中，msc是培养扩增且冷冻保存的。
[0114]
在另一个实例中，间充质谱系前体或干细胞是cd29 、cd54 、cd73 、cd90 、cd102 、cd105 、cd106 、cd166 、mhc1 msc。
[0115]
分离的或富集的间充质谱系前体或干细胞可以通过培养在体外扩增。分离的或富集的间充质谱系前体或干细胞可以冷冻保存、解冻，然后通过培养在体外扩增。
[0116]
在一个实例中，分离的或富集的间充质谱系前体或干细胞以50,000个活细胞/cm2接种于培养基(无血清或补充有血清)中，例如补充有5％胎牛血清(fbs)和谷氨酰胺的α最小必需培养基(αmem)，并且使其在37℃、20％o2下粘附在培养容器上过夜。随后根据需要更换和/或改变培养基，并且将细胞在37℃、5％o2下进一步培养68小时至72小时。
[0117]
如本领域技术人员将理解的，培养的间充质谱系前体或干细胞在表型上不同于体内细胞。例如，在一个实施例中，其表达以下标志物中的一种或多种：cd44、ng2、dc146和cd140b。培养的间充质谱系前体或干细胞在生物学上也与体内细胞不同，与体内大部分非循环(静态)细胞相比，具有更高的增殖率。
[0118]
在一个实例中，细胞群体从包括可选择形式的stro-1 细胞的细胞制剂富集。在此方面，术语“可选择形式”将被理解为意指细胞表达允许选择stro-1 细胞的标志物(例如，细胞表面标志物)。标志物可以是stro-1，但不一定是。例如，如本文所描述的和/或例示的，表达stro-2和/或stro-3(tnap)和/或stro-4和/或vcam-1和/或cd146和/或3g5的细胞(例如，间充质前体细胞)也表达stro-1(并且可以是stro-1bright)。因此，细胞为stro-1 的指示并不意味着细胞仅通过stro-1表达来选择。在一个实例中，至少基于stro-3表达来选择细胞，例如，其为stro-3 (tnap )。
[0119]
提及细胞或其群体的选择不一定需要从特定组织来源中选择。如本文所描述的，stro-1 细胞可以选自或分离自或富集自多种来源。也就是说，在一些实例中，这些术语为从包括stro-1 细胞(例如，间充质前体细胞)的任何组织或血管化组织或包括周细胞(例如，stro-1 周细胞)的组织或本文所述的组织中的任何一种或多种组织中选择提供了支持。
[0120]
在一个实例中，本公开中使用的细胞单独或共同表达一种或多种标志物，所述标志物选自由以下组成的组：tnap 、vcam-1 、thy-1 、stro-2 、stro-4 (hsp-90β)、cd45 、cd146 、3g5 或其任何组合。
[0121]“单独地”意指本公开单独涵盖所述标志物或标志物组，并且尽管本文中可能未单独列出单独的标志物或标志物组，但所附权利要求可以将此类标志物或标志物组彼此单独和分开定义。
[0122]“共同地”意指本公开涵盖所述标志物或标志物组的任何数量或组合，并且尽管标
志物或标志物组的此类数量或组合可能未在本文中具体列出，但所附权利要求可以将此类组合或子组合与任何其它标志物组合或标志物组单独和分开定义。
[0123]
如本文所使用的，术语“tnap”旨在涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。例如，所述术语涵盖肝脏同种型(lap)、骨同种型(bap)和肾脏同种型(kap)。在一个实例中，tnap是bap。在一个实例中，如本文所使用的tnap是指可以与由根据《布达佩斯条约(budapest treaty)》的规定以保藏登记号pta-7282于2005年12月19日保藏在atcc的杂交瘤细胞系产生的stro-3抗体结合的分子。
[0124]
此外，在一个实例中，stro-1 细胞能够产生克隆源性cfu-f。
[0125]
在一个实例中，显著比例的stro-1 细胞能够分化成至少两个不同的种系。stro-1 细胞可以定型为的谱系的非限制性实例包含骨前体细胞；肝细胞祖细胞，所述祖细胞对胆管上皮细胞和肝细胞具有多能性；神经受限细胞，所述神经受限细胞可以生成胶质细胞前体，所述胶质细胞前体进展为少突胶质细胞和星形胶质细胞；进展为神经元的神经元前体；心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖反应性胰岛素分泌胰腺β细胞系。其它谱系包含但不限于成牙质细胞、产生牙质的细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、如角质形成细胞等皮肤细胞、树突细胞、毛囊细胞、肾导管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮细胞、胶质细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
[0126]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞从单个供体或多个供体获得，其中供体样品或间充质谱系前体或干细胞随后被汇集，然后培养扩增。
[0127]
本公开所涵盖的间充质谱系前体或干细胞也可以在向受试者施用之前冷冻保存。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在向受试者施用之前进行培养扩增和冷冻保存。
[0128]
在一实例中，本公开涵盖间充质谱系前体或干细胞以及其后代、源自其的可溶性因子和/或从其分离的胞外囊泡。在另一个实例中，本公开涵盖间充质谱系前体或干细胞以及从其分离的胞外囊泡。例如，可以在适合将胞外囊泡分泌到细胞培养基中的条件下培养扩增本公开的间充质前体谱系或干细胞一段时间。随后可以从培养基中获得分泌的胞外囊泡用于疗法。
[0129]
如本文所使用的，术语“胞外囊泡”是指从细胞中自然释放的脂质颗粒，并且其大小范围从约30nm至大至10微米，尽管其大小通常小于200nm。其可以含有来自释放细胞(例如，间充质干细胞；stro-1

细胞)的蛋白质、核酸、脂质、代谢物或细胞器。
[0130]
如本文所使用的，术语“外泌体”是指一种类型的胞外囊泡，其大小通常在约30nm至约150nm的范围内，并且源自哺乳动物细胞的核内体区室，其从所述区室运输到细胞膜并且释放。其可以含有核酸(例如，rna；microrna)、蛋白质、脂质和代谢物，并且通过从一个细胞分泌并被其它细胞吸收以递送其货物而在细胞间通讯中发挥作用。
[0131]
细胞的培养扩增
[0132]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增。“培养扩增的”间充质谱系前体或干细胞培养基与新鲜分离的细胞的区别在于其已在细胞培养基中培养并传代(即传代培养)。在一实例中，培养扩增的间充质谱系前体或干细胞被培养扩增约4次传代至10次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增至少5次传代、至少6次传代、至少7次
传代、至少8次传代、至少9次传代、至少10次传代。例如，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至10次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至8次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至7次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增多于10次传代。在另一个实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增多于7次传代。在这些实例中，干细胞可在被冷冻保存之前进行培养扩增以提供中间冷冻保存的mlpsc群体。在一实例中，本公开的组合物由中间冷冻保存的mlpsc群体制备。例如，中间冷冻保存的mlpsc群体可以在施用之前进一步培养扩增，如下文进一步讨论的。因此，在一实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增并冷冻保存。在这些实例的一实施例中，间充质谱系前体或干细胞可以从单个供体或多个供体获得，其中供体样品或间充质谱系前体或干细胞随后被汇集，然后培养扩增。在一实例中，培养扩增过程包括：
[0133]-i.通过传代扩增来扩增多个活细胞以提供至少约10亿个活细胞的制剂，其中传代扩增包括建立分离的间充质谱系前体或干细胞的原代培养物，并且然后连续建立从先前培养物中分离的间充质谱系前体或干细胞的第一非原代(p1)培养物；
[0134]-ii.通过传代扩增将分离的间充质谱系前体或干细胞的p1培养物扩增至间充质谱系前体或干细胞的第二非原代(p2)培养物；以及，
[0135]-iii.制备和冷冻保存从间充质谱系前体或干细胞的p2培养物中获得的处理中的中间间充质谱系前体或干细胞制剂；以及，
[0136]-iv.将冷冻保存的处理中的中间间充质谱系前体或干细胞制剂解冻并通过传代扩增来扩增处理中的中间间充质谱系前体或干细胞制剂。
[0137]
在一实例中，扩增的间充质谱系前体或干细胞制剂具有抗原谱和活性谱，所述抗原谱和活性谱包括：
[0138]-i.少于约0.75％cd45 细胞；
[0139]-ii.至少约95％cd105 细胞；
[0140]-iii.至少约95％cd166 细胞。
[0141]
在一实例中，相对于对照，扩增的间充质谱系前体或干细胞制剂能够抑制cd3/cd28激活的pbmc的il2ra表达至少约30％。
[0142]
在一实例中，培养扩增的间充质谱系前体或干细胞被培养扩增约4次传代至10次传代，其中间充质谱系前体或干细胞在被进一步培养扩增之前在至少2次传代或3次传代后被冷冻保存。在一实例中，将间充质谱系前体或干细胞培养扩增至少1次传代、至少2次传代、至少3次传代、至少4次传代、至少5次传代，冷冻保存，然后在施用或进一步冷冻保存之前进一步培养扩增至少1次传代、至少2次传代、至少3次传代、至少4次传代、至少5次传代。
[0143]
在一实例中，本公开的组合物中的大多数间充质谱系前体或干细胞具有大约相同的传代数(即，其在彼此的约1次或约2次或约3次或约4次细胞倍增内)。在一实例中，本组合物中细胞倍增的平均次数为约20次倍增至约25次倍增。在一实例中，本组合物中的细胞倍增的平均次数为约9次至约13次(例如，约11次或约11.2次)来自原代培养物的倍增，加上每次传代约1次、约2次、约3次或约4次倍增(例如，每次传代约2.5次倍增)。当分别通过约1次、约2次、约3次、约4次、约5次、约6次、约7次、约8次、约9次和约10次传代产生时，本组合物中
的示例性平均细胞倍增为约13.5次、约16次、约18.5次、约21次、约23.5次、约26次、约28.5次、约31次、约33.5次和约36次中的任何一者。
[0144]
可以使用本领域已知的任何设备和细胞处理方法进行间充质谱系前体或干细胞分离和离体扩增的过程。本公开的各种培养扩增实施例采用需要对细胞进行操作的步骤，例如，接种、进料、解离粘附培养物或洗涤的步骤。任何操作细胞的步骤都有可能损伤细胞。尽管间充质谱系前体或干细胞在制备期间通常可以承受一定量的损伤，但细胞优选地通过充分执行给定步骤同时最小化对细胞的损伤的处理程序和/或设备进行操作。
[0145]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在包含细胞来源袋、洗涤溶液袋、再循环洗涤袋、具有入口和出口端口的旋转膜过滤器、滤液袋、混合区、用于洗涤的细胞的最终产物袋和适当的管道的设备中洗涤，例如，如us 6251295中所描述的，所述文献特此通过引用并入。
[0146]
在一实例中，根据本公开的间充质谱系前体或干细胞组合物在cd105阳性和cd166阳性和cd45阴性方面是95％均质的。在一实例中，此均质性通过离体扩增持续存在；即虽然多次群体倍增。在一实例中，所述组合物包括至少一个治疗剂量的间充质谱系前体或干细胞，并且所述间充质谱系前体或干细胞包括少于约1.25％的cd45 细胞、至少约95％的cd105 细胞和至少约95％的cd166 细胞。在一实例中，此均质性在冷冻储存和解冻后持续存在，其中细胞通常也具有约70％或更高的活力。
[0147]
在一实例中，本公开的组合物包括间充质谱系前体或干细胞，所述间充质谱系前体或干细胞表达大量tnfr1，例如每百万间充质谱系前体或干细胞中大于13pg的tnfr1。在一实例中，此表型在离体扩增和冷冻储存过程中是稳定的。在一实例中，每百万间充质谱系前体或干细胞中约13pg至约179pg(例如约13pg至约44pg)范围内的tnfr1水平的表达与期望的治疗潜力相关，所述治疗潜力也通过离体扩增和冷冻保存而持续存在。
[0148]
在一实例中，培养扩增的间充质谱系前体或干细胞以至少110pg/ml的量表达肿瘤坏死因子受体1(tnfr1)。例如，间充质谱系前体或干细胞可以以至少150pg/ml、或至少200pg/ml、或至少250pg/ml、或至少300pg/ml、或至少320pg/ml，或至少330pg/ml，或至少340pg/ml或至少350pg/ml的量表达tnfr1。
[0149]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞以至少13pg/106个细胞的量表达tnfr1。例如，间充质谱系前体或干细胞以至少15pg/106个细胞，或至少20pg/106个细胞、或至少25pg/106个细胞、或至少30pg/106个细胞、或至少35pg/106个细胞、或至少40pg/106个细胞、或至少45pg/106个细胞或至少50pg/106个细胞的量表达tnfr1。
[0150]
在另一个实例中，本文公开的间充质谱系前体或干细胞抑制t细胞上的il-2rα表达。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以抑制il-2rα表达至少约30％、可替代地至少约35％、可替代地至少约40％、可替代地至少约45％、可替代地至少约50％、可替代地至少约55％、可替代地至少约60％。
[0151]
在一实例中，本公开的组合物包括至少一个治疗剂量的间充质谱系前体或干细胞，所述间充质谱系前体或干细胞例如可以包括至少约1亿个细胞或约1.25亿个细胞。
[0152]
细胞的修饰
[0153]
在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞可以以此类方式改变，即在施用时，细胞的裂解被抑制。抗原的改变可以诱导免疫无应答或耐受性，从而预防诱导免疫应答
sciences)》,第16版,马克出版公司(mac publishing company)(1980))。载体还可以减少活性化合物的任何不期望的副作用。合适的载体是例如稳定的，例如不能与载体中的其它成分反应。在一个实例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下不会在接受者中产生显著的局部或全身副作用。
[0162]
本公开的合适载体包含常规使用的那些，例如水、盐水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(ringer's solution)、缓冲溶液、透明质酸和二醇是示例性的液体载体，特别是(当为等渗的时)对于溶液。合适的药物载体和赋形剂包含淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
[0163]
在另一个实例中，载体是培养基组合物，例如，细胞在其中生长或悬浮。例如，此类培养基组合物不会在将其施用到的受试者中引起任何副作用。
[0164]
示例性载体和赋形剂不会不利地影响细胞的活力和/或细胞减少、预防或延迟代谢综合征和/或肥胖症的能力。
[0165]
在一个实例中，载体或赋形剂提供缓冲活性以将细胞和/或可溶性因子维持在合适的ph，从而发挥生物活性，例如载体或赋形剂是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。pbs代表有吸引力的载体或赋形剂，因为其与细胞和因子的相互作用最小并且允许细胞和因子的快速释放，在此类情况下，本公开的组合物可以生产为用于直接应用到血流中或进入组织或组织周围或邻近组织的区域的液体，例如通过注射。
[0166]
间充质谱系前体或干细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子也可以掺入或包埋在与接受者相容且降解成对接受者无害的产物的支架内。这些支架为要移植到接受者受试者中的细胞提供支持和保护。天然和/或合成的可生物降解的支架是此类支架的实例。
[0167]
在本公开的实践中可以成功地使用多种不同的支架。示例性支架包含但不限于生物、可降解支架。天然可生物降解的支架包含胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白支架。用于细胞移植支架的合适的合成材料应该能够支持广泛的细胞生长和细胞功能。此类支架也可以是可再吸收的。合适的支架包含聚乙醇酸支架，(例如，如以下所描述的：vacanti等人《儿童外科杂志(j.ped.surg.)》23:3-9 1988；cima等人《生物技术与生物工程(biotechnol.bioeng.)》38:145 1991；vacanti等人《整形和重建外科手术(plast.reconstr.surg.)》88:753-9 1991)；或合成聚合物，如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。
[0168]
在另一个实例中，间充质谱系前体或干细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子可以在凝胶支架(如来自普强公司(upjohn company)的gelfoam)中施用。
[0169]
本文描述的组合物可以单独施用或作为与其它细胞的混合物施用。不同类型的细胞可以在施用前立即或不久与本公开的组合物混合，或者其可以在施用前一起共培养一段时间。
[0170]
在一个实例中，组合物包括有效量或治疗或预防有效量的间充质谱系前体或干细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子。例如，所述组合物包括约1x105个干细胞至约1x109个干细胞或约1.25x103个干细胞至约1.25x107个干细胞/kg(80kg受试者)。在一实例中，所述组合物包括2x106个细胞/kg。待施用的细胞的确切量取决于多种因素，包含受试者的年龄、体重和性别以及要治疗的病症的程度和严重程度。
[0171]
在一实例中，施用50x106个至200x107个细胞。在其它实例中，施用60x106个至
200x106个细胞或75x106个至150x106个细胞。在一实例中，施用75x106个细胞。在另一个实例中，施用150x106个细胞。
[0172]
在一实例中，所述组合物包括大于5.00x106个活细胞/ml。在另一个实例中，所述组合物包括大于5.50
×
106个活细胞/ml。在另一个实例中，所述组合物包括大于6.00
×
106个活细胞/ml。在另一个实例中，所述组合物包括大于6.50
×
106个活细胞/ml。在另一个实例中，所述组合物包括大于6.68
×
106个活细胞/ml。
[0173]
在一实例中，本公开的方法涵盖施用总剂量为6亿的细胞。例如，只要细胞的总剂量不超过6亿个细胞，根据本公开治疗的受试者就可以接受上述参考组合物的多剂量。例如，受试者可以接受3剂量的2亿个细胞。在一实例中，所述细胞的总剂量为5亿个细胞。在一实例中，所述细胞的总剂量为4亿个细胞。例如，受试者可以接受4剂量的1亿个细胞。在一实例中，所述受试者在基线时接受1剂量的1亿个细胞，随后在三个月内每月一次施用三剂量的1亿个细胞。在一实例中，剂量为2x106个细胞/kg。在一实例中，剂量为2x106个细胞/kg，并且所述受试者接受2剂量或3剂量。在一实例中，剂量为2x106个细胞/kg，并且所述受试者接受多于3剂量。
[0174]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞包括组合物的细胞群体的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％。
[0175]
本公开的组合物可以被冷冻保存。可以使用本领域已知的慢速冷却方法或
‘
快速’冷冻方案进行间充质谱系前体或干细胞的冷冻保存。优选地，与未冷冻细胞相比，冷冻保存的方法保持冷冻保存的细胞的相似表型、细胞表面标志物和生长速率。
[0176]
冷冻保存的组合物可以包括冷冻保存溶液。冷冻保存溶液的ph通常为6.5至8，优选地7.4。
[0177]
冷冻保存溶液可以包括无菌、无热原等渗溶液，例如plasmalyte a
tm
。100ml的plasmalyte a
tm
含有526mg氯化钠，usp(nacl)；502mg葡萄糖酸钠(c6h
11
nao7)；368mg三水乙酸钠，usp(c2h3nao2·
3h2o)；37mg氯化钾，usp(kcl)；以及30mg氯化镁，usp(mgcl2·
6h2o)。其不含抗微生物剂。用氢氧化钠调整ph。ph为7.4(6.5至8.0)。
[0178]
冷冻保存溶液可以包括profreeze
tm
。冷冻保存溶液可以另外或可替代地包括培养基，例如αmem。
[0179]
为了促进冷冻，通常将冷冻保护剂，例如二甲亚砜(dmso)添加到冷冻保存溶液中。理想地，冷冻保护剂应该对细胞和患者无毒、无抗原性、化学惰性，在解冻后提供高存活率并允许移植而无需洗涤。然而，最常用的冷冻保护剂dmso显示出一些细胞毒性。羟乙基淀粉(hes)可以用作替代品或与dmso结合使用，以降低冷冻保存溶液的细胞毒性。
[0180]
冷冻保存溶液可以包括dmso、羟乙基淀粉、人血清组分和其它蛋白质填充剂中的一种或多种。在一个实例中，冷冻保存的溶液包括约5％的人血清白蛋白(hsa)和约10％的dmso。冷冻保存溶液可以进一步包括甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和海藻糖中的一种或多种。
[0181]
在一个实施例中，将细胞悬浮在42.5％profreeze
tm
/50％αmem/7.5％dmso中并在受控速率的冰箱中冷却。
[0182]
冷冻保存的组合物可以解冻并直接向受试者施用或添加到例如包括ha的另一种溶液中。可替代地，在施用前可以将冷冻保存的组合物解冻并将间充质谱系前体或干细胞重悬于替代载体中。
[0183]
在一实例中，本公开的细胞组合物可以包括血浆-裂解物a、二甲亚砜(dmso)和人血清白蛋白(hsa)。例如，本公开的组合物可以包括血浆-裂解物a(70％)、dmso(10％)、hsa(25％)溶液，所述hsa溶液包括5％hsa和15％缓冲液。
[0184]
在一实例中，本文描述的组合物可以作为单剂量施用。
[0185]
在一些实例中，本文描述的组合物可以通过多剂量施用。例如，至少2剂量、至少3剂量、至少4剂量。在其它实例中，本文所述的组合物可以通过至少5剂量、至少6剂量、至少7剂量、至少8剂量、至少9剂量、至少10剂量施用。
[0186]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以在向受试者施用之前进行培养扩增。各种细胞培养方法是本领域已知的。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增约4次传代至10次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增至少4次传代、至少5次传代、至少6次传代、至少7次传代、至少8次传代、至少9次传代、至少10次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增至少5次传代。在这些实例中，干细胞可以在被冷冻保存之前被培养扩增。
[0187]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在施用前在无血清培养基中被培养扩增。
[0188]
在一些实例中，细胞包含在不允许细胞进入受试者的循环但允许细胞分泌的因子进入循环的室中。以此方式，可以通过允许细胞将因子分泌到受试者的循环中来向受试者施用可溶性因子。此类室同样可以植入受试者体内的部位以增加可溶性因子的局部水平。
[0189]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以全身施用。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以向受试者的气道施用。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以向受试者的肺部施用。在另一个实例中，本公开的组合物是静脉内施用的。在另一个实例中，组合物是静脉内施用的并且向受试者的气道施用。
[0190]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞每周施用一次。例如，间充质谱系前体或干细胞可以每两周每周施用一次。在另一个实例中，间充质谱系前体或干细胞每周施用两次。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以每月施用一次。在另一个实例中，两周每周一次施用两剂量的间充质谱系前体或干细胞。在另一个实例中，每两周每周一次施用两剂量的间充质谱系前体或干细胞。在另一个实例中，两周施用四剂量的间充质谱系前体或干细胞，然后再每月施用后续剂量。在一实例中，可以每两周每周一次施用两剂量的间充质谱系前体或干细胞，然后再每月施用一次后续剂量。在一实例中，每月施用四剂量。
[0191]
本领域技术人员将理解，在不脱离本公开广泛的一般范围的情况下，可以对上述实施例进行多种变化和/或修改。因此，本实施例应当在所有方面都被视为是说明性的而非限制性的。
[0192]
以下具体实例应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。无需进一步详细阐述，相信本领域的技术人员可以基于本文描述在最大程度上利用本发明。
[0193]
实例
[0194]
用于治疗过度炎症的离体培养扩增的成人同种异体骨髓源性间充质干细胞(msc)
[0195]
组合物
[0196]
组合物包含分离自健康成人供体的骨髓的培养扩增的间充质基质细胞(cemsc)。最终组合物包括在plasma-lyte a、二甲亚砜(dmso)和人血清白蛋白(hsa)中调配的cemsc。
[0197]
目的
[0198]
为了在以下中确定：
[0199]-安全性
[0200]-相对于基线的变化：
[0201]
ο白细胞计数；
[0202]
οp/f比率；
[0203]
ο循环crp水平；
[0204]
ο铁蛋白水平。
[0205]
测量
[0206]
基线测量被认为是在施用第一剂量前进行的测量(研究第0天)。每天测量白细胞计数、p/f比率、循环crp水平和铁蛋白水平。
[0207]
受试者
[0208]
特征为患有中度covid-19相关ards的患者(n＝5)接受静脉内输注间充质干细胞(200万个细胞/kg)。
[0209]
分析
[0210]
表1和图1至5中示出了经治疗的患者的初步数据。
[0211]
表1：
[0212][0213]
5名患者在msc输注后11天示出了p/f比率、crp、肌酸酐和铁蛋白水平(图6至10)。第0天紧接于第一剂量之前。所有患者在第2-5天接受第二剂量。p/f比率通常随着时间的推移而增加，并且在一些情况下表明ards等级有所改善。循环crp水平通常随着时间的推移而降低，表明炎症减少。
[0214]
扩增的群体
[0215]
患者群体扩增到11人，并且受试者(表2)以200万个细胞/kg/输注接受两剂量(静脉内)，间隔48-120小时。细胞活力范围在78-90％之间。
[0216]
表2：
[0217][0218]
临床结果
[0219]
图11中示出了临床结果。对所有患者进行随访直到死亡或icu出院为止，并且icu死亡率为18％(95％ci；2-52％)。在观察期间，十名(91％，95％ci；59-100％)患者被拔管。一名患者(患者7)在其拔管三天后被再次插管，由于假定的大规模肺栓塞导致突然失代偿。溶栓疗法使氧合和血液动力学得以改善，但患者在输注后第23天死于脓毒性休克，同时仍需要机械通气。在研究期结束时，九名(82％，95％ci；48-97％)患者解除机械通气，九名(82％、95％ci；48-97％)从重症监护室出院，并且七名(64％，95％ci；31-89)从医院出院。两名仍在医疗层住院，情况稳定。从首次输注开始的拔管的中值时间为十天(iqr：3-10天)。机械通气的中值持续时间为12天(iqr：7-12天)。
[0220]
生理数据
[0221]
从第0天至第3天，通过每日中值p:f比率(中值差异 78mmhg，p＝0.002)评估氧合有所改善(表3和表4；图12)。crp水平从第0天至第5天降低(中值219.2至36.5mg/l，p＝0.002，图13，表3和表4)。发热曲线或白细胞计数无变化。从第0天至第3天或第5天，铁蛋白水平和sofa评分没有显著变化。
[0222]
表3：*在插管24-48小时内获得的值。
[0223][0224]
*在插管24-48小时内获得的值。
[0225]
**弗里德曼氏试验(friedman's test)
[0226]
***动脉血中氧分压与吸入氧分数的p:f比率
[0227]
α
序贯器官衰竭评估评分
[0228]
表4：
[0229]
参数对比中值差异(iqr)p值*c反应蛋白从第0天至第3天的差异-141.8(-211.0，183.6)0.032 从第0天至第5天的差异-176.2(-240.0，-41.2)0.002**p:f比率***从第0天至第3天的差异78(3-154)0.002** 从第0天至第5天的差异49(30-166)0.004**sofa评分
α
从第0天至第3天的差异-1(-8，6)0.523 从第0天至第5天的差异-1(-8，4)0.438
[0230]
*威尔科克森符号秩检验(wilcoxon signed rank test)
[0231]
**在α《0.008时显著，使用邦费罗尼校正(bonferroni correction)进行多次对比
[0232]
***动脉血中氧分压与吸入氧分数的p:f比率
[0233]
α
序贯器官衰竭评估评分
[0234]
安全性
[0235]
没有与输注相关的不良事件。
[0236]
用于治疗多系统炎性综合征(mis)的离体培养扩增的成人同种异体骨髓源性间充质干细胞(msc)
[0237]
一名先前健康的男孩出现高烧，并且covid-19抗体呈阳性，但病毒不呈阳性。最初用高剂量类固醇、静脉内免疫球蛋白、血管加压药、高剂量阿司匹林和抗血小板药物治疗该男孩的mis。尽管采用了这些多种治疗剂，但该男孩仍经历了心脏泵血功能的恶化以及炎症、心脏充血和血管内血液凝结的生物标志物的持续升高。入院四天后，用一剂量的静脉内间充质干细胞(2x106个细胞/kg)治疗该男孩，随后两天后再接受第二静脉内剂量。
[0238]
在施用两种msc剂量的三天期间，crp、d-二聚体和bnp水平降低，而lvef％增加(表5；图14)。还观察到炎性生物标志物显著减少(图14)。如表5所示，主要血栓形成和凝血的标志物d-二聚体水平显著降低(从》20至2.6μg/ml)，并且心脏功能显著改善，射血分数从51％增加到68％。该儿童随后出院回家。
[0239]
表5：
[0240]
在2x106个细胞/kg下的msc剂量4岁男性；先前健康；18kg
[0241][0242][0243]
一名先前健康的女孩covid-19抗体呈阳性，但病毒不呈阳性。最初用iv类固醇、血管加压药、低剂量阿司匹林和插管作为预防措施治疗该女孩的mis。入院两天后，用一剂量的静脉内间充质干细胞(2x106个细胞/kg)治疗该男孩，随后两天后再接受第二静脉内剂量。
[0244]
在施用两种msc剂量的四天期间，crp、肌钙蛋白i、铁蛋白、肌酸酐、bun和bnp水平降低，而lvef％增加(表6；图15)。还观察到炎性生物标志物显著减少(图15)。在第二剂量的细胞后观察到纤维蛋白原水平降低。此外，如表6所示，心脏功能显著改善，射血分数从43.3％增加到61.8％。
[0245]
表6：
[0246]
在2x106个细胞/kg下的msc剂量10岁女性；先前健康；58kg
[0247]
ꢀꢀ
剂量#1 剂量#2
ꢀꢀꢀ
天-2012345hscrp23.0-7.24.52.51.490.86肌钙蛋白i13
‑‑‑
7.4
‑‑
lvef％43.348.149.2-61.8
‑‑
bnp65002900-227944316093铁蛋白17001250732782748814803肌酸酐4.31.5-1.10.80.80.6bun46
‑‑
44302721纤维蛋白原
‑‑
572532427384382
[0248]
如上表所示，在施用细胞疗法后，两名儿童的lv射血分数和b型利钠蛋白迅速正常化，并且与remestemcel-l治疗暂时相关的d-二聚体也得以改善(图16)。另外，连续超声心动图成像示出了泛瓣膜返流的严重程度降低以及lv收缩末期体积增加。后一个观察结果和与细胞疗法施用暂时相关的lv收缩状态的改善相一致。
[0249]
用于治疗移植接受者的过度炎症的离体培养扩增的成人同种异体骨髓源性间充质干细胞(msc)
[0250]
一名成年男性因严重的克罗恩氏病(crohn's disease)接受结肠切除和移植。该患者随后出现细菌性ards和指示移植排斥的症状。该患者还患有copd，其肺上叶的ct发现为小叶中心肺气肿。该患者对任何治疗均无应答，包含用口服万古霉素(vancomycin)(因复
发性艰难梭菌(clostridium difficile)感染史而开始)和口服奥格门汀(augmentin)(因肺炎而开始)治疗。结肠镜检查显示小肠粘膜具有斑片状活性炎症，架构扭曲，并且病灶的细胞凋亡活性增加(5/10个连续隐窝)，不确定是否存在急性细胞排斥。胸部ct示出了新发现的多灶性支气管周围结节和依赖性实变性阴影，主要位于下叶，怀疑为肺炎。另外的结肠镜检查示出回肠正常，并且结肠粘膜遍布红斑。病理学再次显示不确定急性细胞排斥，但存在炎性改变。
[0251]
该患者随后施用2次静脉内间充质干细胞输注(2x106个细胞)，随后直接(内窥镜)向结肠壁施用1.5亿个msc。该患者的呼吸性ards在细胞疗法后痊愈，并且该患者出院回家，停止氧气，每天排便3-4次。稠度为半固体。两周后的随访显示，临床体征明显改善，回肠炎症极微，结肠无背景炎症，并且无移植排斥迹象。无呼吸短促报告，腹泻恢复到基线(10
–
12x发生)，无发烧或sob报告，并且无需补充o2使用。支气管灌洗培养物对感染也呈阴性。另外的随访显示该专利在家并且感觉良好。
[0252]
本领域的技术人员将理解的是，在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如在特定实施例中示出的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施例应当在所有方面都被视为是说明性的而非限制性的。
[0253]
上文所讨论的所有出版物均以其全文并入本文中。
[0254]
已包含在本说明书中的文件、法令、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是出于为本公开提供上下文的目的。这不应视为承认任何或所有这些事项形成现有技术基础的一部分，或者是与本发明相关的领域中的公知常识，因为其在本技术的每个权利要求的优先权日期之前就已经存在。
[0255]
本技术要求于2020年4月3日提交的au2020901052、于2020年4月8日提交的au2020901124、于2020年7月6日提交的au2020902312、于2020年7月14日提交的au2020902425、于2020年8月25日提交的au2020903041、于2020年10月12日提交的au2020903694和于2020年11月23日提交的au2020904312的优先权，所述专利的公开内容通过引用并入本文。