一种负电性小分子调控的表面在蛋白差异性黏附上的应用

1.本发明属于医用材料的制备技术领域，涉及一种负电性小分子调控的表面在蛋白差异性黏附上的应用。


背景技术：

2.在组织工程领域，材料表面的细胞选择性黏附具有十分重要的意义，这种选择性黏附有利于模仿/重塑机体原有复杂组织中多类型细胞有序组合的组织结构。然而，现有材料制备技术中，细胞选择性黏附多依赖于制备生物功能分子修饰的材料表面(如rgd、vegf等，noel s.,et al.acta biomater.2016,37,69)，作用机制在于生物功能分子可以介导与不同细胞表面蛋白受体的差异性黏附，但这种方法不仅依赖于价格昂贵的生物功能分子制备以及不利于规模化生产的生物功能分子表面固定过程，还只能解决靶点明确的少数细胞的选择性黏附。与此同时，高分子材料由于结构设计灵活多样，在组织工程、药物载体等多领域研究广泛，通过精细的结构设计可以实现蛋白差异性黏附、也有望进一步优化材料结构、进而实现细胞的选择性黏附。但是目前高分子材料制备技术主要集中于阳离子聚合物(广谱性增强蛋白/细胞黏附)，以及聚乙二醇、负电性聚合物、两性离子聚合物(显著降低蛋白/细胞黏附)这两类材料的研究。因此，仍然缺乏可以简便制备蛋白差异性黏附材料的制备技术，严重制约了组织工程领域中细胞选择性黏附材料的开发。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明提供一种负电性小分子调控的表面在蛋白差异性黏附上的应用。具体提供如下技术方案：一种负电性小分子调控的表面在蛋白差异性黏附上的应用，将表面具备阳离子的基材通过浸泡负电性小分子溶液进行调控，可以实现基材表面对不同蛋白的差异性黏附，具体步骤为：
4.1)配制负电性小分子溶液；
5.2)将表面具备阳离子的基材浸入步骤1)的溶液中；
6.3)洗涤、干燥，得到改性基材；
7.4)基材对蛋白进行差异性黏附。
8.进一步，步骤1)所述的负电性小分子为甲基硫酸钠、甲基磺酸钠、n-环己基氨基磺酸钠、吗啉乙磺酸钠盐一水合物、3-n(-吗啉基)丙磺酸钠、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠、葡萄糖酸的一种或多种混合，负电性小分子溶液的浓度为0.5-50mg/ml。
9.进一步，所述的蛋白为白蛋白、球蛋白和纤维蛋白。
10.进一步，所述的表面具备阳离子的基材有三种：
11.基材a为本身表面不含有阳离子的基材与阳离子聚合物经自组装得到的阳离子固定化基材；
12.基材b为本身表面不含有阳离子的基材与正电性小分子经化学反应得到的表面阳离子固定化基材；
13.基材c为本身表面含有大量阳离子基团的基材，阳离子基团为胍基、伯胺、季铵或叔胺的一种或多种组合。
14.进一步，基材a中所述的自组装为将阳离子聚合物和负电性聚合物通过层层自组装方法包覆在表面，并控制最外层是阳离子聚合物。
15.进一步，基材a中所述的本身表面不含有阳离子的基材为304不锈钢、金属钛钉、硅片、明胶海绵、聚乙烯醇海绵或医用胶原蛋白海绵。
16.进一步，基材a中所述的阳离子聚合物为聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚甲基丙烯酸n,n-二甲基氨基乙酯、聚赖氨酸、聚六亚甲基双胍盐酸盐、聚六亚甲基单胍盐酸盐中的一种或多种混合，所述的负电性聚合物为聚(4-苯乙烯磺酸钠)、聚甲基丙烯酸中的一种或多种混合。
17.进一步，基材b中所述的本身表面不含有阳离子的基材为明胶海绵、聚乙烯醇海绵、医用胶原蛋白海绵或纱布。
18.进一步，基材b中所述的化学反应为季铵化反应，通过本身表面不含有阳离子的基材表面的羟基、氨基或羧基与含环氧基的季铵盐发生开环反应；所述的含环氧基的季铵盐为2,3-环氧丙基三甲基氯化铵或由环氧氯丙烷和n,n-二甲基x胺反应得到的产物，所述的x为乙、丙、丁。
19.进一步，其特征在于，2，3-环氧丙基三甲基季铵盐改性的明胶和甲基硫酸钠进行浸泡后，可以对纤维蛋白原的高黏附，对白蛋白和球蛋白中等黏附；聚(4-苯乙烯磺酸钠)和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)交替自组装改性得到的阳离子固定化304不锈钢表面和甲基硫酸钠进行浸泡后，可以对球蛋白高黏附，对纤维蛋白低黏附。
20.本发明的有益效果在于：本发明制备了一种负电性小分子调控的蛋白差异性黏附表面材料，通过负电性小分子与阳离子聚合物原有抗衡阴离子的竞争作用，将一部分抗衡阴离子(如氢氧根、氯离子等)转变为新引入的负电性小分子，从而调控基材表面阳离子聚合物的强正电性(以及伴随的与负电性蛋白的强结合能力/黏附作用力)，最终实现对蛋白黏附量的调控及不同蛋白的差异性黏附。因此，本发明相对于直接化学合成实现了聚合物结构设计以及蛋白黏附调控(这些化学合成常常是精细但繁琐的)，提供了一种更简便的制备蛋白差异性黏附材料的方法。
具体实施方式
21.对本发明的优选实施例进行详细的描述。
22.实施例1
23.1)300mg氢氧化钠溶于10ml去离子水，1200mg 2，3-环氧丙基三甲基季铵盐(gta)溶于40ml去离子水，二者混合浸泡明胶海绵24h，去离子水洗3次，每次10min，冷冻干燥得到季铵化明胶海绵(qgs)。
24.2)将1)中的季铵化明胶海绵浸泡在10mg/ml的甲基硫酸钠水溶液中2h，去离子水洗3次，每次30min，冷冻干燥得到止血海绵x1。
25.本实施例中，表面具备阳离子基材为季铵化明胶海绵，阳离子聚合物为季铵化明胶，负电性小分子甲基硫酸钠。
26.实施例2
27.将实施例1中步骤1)中的季铵化明胶海绵浸泡在21mg/ml的甲基硫酸钠水溶液中2h，去离子水洗3次，每次30min，冷冻干燥得到止血海绵x2。
28.本实施例中，负电性小分子甲基硫酸钠的浓度与实施例1不同。
29.实施例3
30.1)304不锈钢片(简称s)裁成1
×
1cm2，用异丙醇、乙醇、水连续超声清洗，干燥后用氧等离子体处理。用去离子水配制1mg/ml聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pdadmac)溶液，1mg/ml聚(4-苯乙烯磺酸钠)(pss)溶液。交替浸泡pdadmac和pss溶液，每次20min，去离子水洗1min，氮气吹2min，得到s-pp
4.5
(s-pp
4.5
最外层是阳离子聚合物聚二烯丙基二甲基氯化铵)
31.2)将1)中的s-pp
4.5
浸泡在0.1mg/ml的甲基硫酸钠水溶液中1h，去离子水洗1次，每次1min，氮气吹干得到止血材料x3。
32.本实施例中，表面具备阳离子基材是304不锈钢片与聚(4-苯乙烯磺酸钠)和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)交替自组装得到的阳离子固定化基材s-pp
4.5
，阳离子聚合物为聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，负电性小分子为甲基硫酸钠。
33.对比例1
34.实施例1中步骤1)得到的季铵化明胶海绵，命名为y1。
35.对比例2
36.未改性明胶海绵，命名为y2。
37.对比例3
38.未改性304不锈钢片，命名为y3。
39.测试例1蛋白黏附测试
40.制备的蛋白差异性黏附表面材料x1～x3，对比例y1～y3进行白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原的黏附测试对比实验。
41.测试方法：以人源白蛋白的测试方法为例，取3mg明胶海绵系列材料加入2ml离心管，改性前后的不锈钢片取1
×
1cm2放入6孔板。将人源白蛋白配制为10mg/ml的pbs溶液，取50μl蛋白溶液加在材料上，37℃的恒温水浴锅中孵育30分钟。吸出多余液体，用200μl pbs溶液轻洗1洗，洗涤液定容至500μl，取50μl洗涤液于2ml离心管中，加入提前配置好的1ml bca工作液(试剂a：试剂b＝50:1(v/v))，置于37℃的恒温水浴锅中孵育30分钟，取100μl加入96孔板，测试562nm处的吸光度abs。
42.空白组为50μl蛋白溶液加入2ml离心管。对照组为材料加50μl pbs。
43.蛋白黏附率η％＝(1-(abs样品-abs对照)/abs空白)
×
100％
44.实施例及对比例的白蛋白黏附率如表1所示：
45.表1白蛋白黏附率测试结果
46.样品x1x2y1y2η(％)8.96.88.12.0
47.实施例及对比例的球蛋白黏附率如表2所示：
48.表2球蛋白黏附率测试结果
49.样品x1x2x3y1y2y3η(％)9.511.17.98.63.16.0
50.实施例及对比例的纤维蛋白原黏附率如表3所示：
51.表3纤维蛋白原黏附率测试结果
52.样品x1x2x3y1y2y3η(％)31.014.63.910.56.010.1
53.蛋白黏附率是表征材料表面蛋白黏附作用的重要指标，黏附百分率越大，表明材料的蛋白黏附性能越好。
54.从表1-3的数据可以看出，本发明实施例1-2的明胶海绵(明胶海绵材料以12％蛋白黏附率作为高蛋白黏附性能)，x1实现了对纤维蛋白原的高黏附，同时对白蛋白和球蛋白的中等黏附；x2实现了对纤维蛋白原的高黏附，同时对白蛋白和球蛋白的中等黏附。
55.从表1-3的数据可以看出，发明实施例3的不锈钢片(金属材料表面以6％蛋白黏附率作为中等/合格蛋白黏附性能)，x3实现了对球蛋白的高黏附，同时对纤维蛋白原的黏附较低。
56.由此可见，采用本发明的制备方法，通过浸泡不同浓度的负电性小分子，可有效调节阳离子聚合物的正电性，通过调控正电性对负电蛋白的强黏附作用力，实现对蛋白粘附量的调控以及不同蛋白的选择性黏附。具体分析如下：
57.对比例1是表面经阳离子聚合物固定的明胶海绵，相比于对比例2(未改性的明胶海绵)，对三种蛋白的黏附率都提高，表明是阳离子由于正电性黏附了负电蛋白，对比例得到的海绵y1对蛋白是广谱性高黏附没有选择性。
58.实施例1-2以及对比例1(表面经阳离子聚合物固定的明胶海绵)的蛋白黏附率数据可以看出，当加入小分子、形成复合体系后，海绵x1对白蛋白和球蛋白的黏附率基本不变(黏附率分别从8.1％到8.9％、从8.6％到9.5％)，对纤维蛋白原的黏附率变高了(黏附率从10.5％升高到31.0％)；海绵x2对白蛋白的黏附率变低了(黏附率从8.1％降低到6.8％)，对球蛋白和维蛋白原的黏附率变高了(黏附率分别从8.6％升高到11.1％、从10.5％升高到14.6％)。由此可见，本发明制备的海绵可以实现对蛋白的差异性黏附。
59.实施例3以及对比例3(未改性的304不锈钢片)的蛋白黏附率数据可以看出，当加入小分子和阳离子聚合物形成复合体系后，不锈钢片x3对球蛋白的黏附率变高了(黏附率从6.0％升高到7.9％)，对纤维蛋白原的黏附率降低了(黏附率从10.1％降低到3.9％)。由此可见，本发明制备的膜可以实现对蛋白的差异性黏附。
60.最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。