一种复合微生物制剂及其制备方法和保存方法与流程

1.本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种复合微生物制剂及其制备方法和保存方法。


背景技术：

2.乳酸菌是一类能利用碳水化合物产生大量乳酸且无法形成芽孢的细菌的统称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。除极少数外，其绝大部分都是人体内必不可少的、且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中，所以乳酸菌也是目前益生菌行业应用最为广泛的一类菌。
3.乳杆菌属由于很早以来就被应用在发酵工业，其在乳酸菌类中应用极为广泛，其有着产酸能力强，扩培后菌量高的优点，能起到促消化、改善肠道功能的作用，但其具有抗逆性较差，竞争能力较一般等问题。而肠球菌属中的粪肠球菌、屎肠球菌虽然也属于乳酸菌，应用面却不如乳杆菌。
4.目前，乳杆菌属和肠球菌存在无法有效应用的问题，比如发酵时容易出现污染以及存活性差等问题，容易在保存、运输和应用的过程中出现菌量低和杂菌多等情况。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种复合微生物制剂及其制备方法和保存方法。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明实施例提供了一种复合微生物制剂的制备方法，其包括以下步骤：将乳杆菌的种子液和肠球菌的种子液混合后发酵；发酵过程中，按3个阶段对发酵培养基中的ph进行调控：第一阶段，调控ph为6.6～6.8；第二阶段，调控ph为5.9～6.1；第三阶段，调控ph为5.0～5.2；其中，第一阶段为发酵的第0～(6～10)小时，第二阶段为发酵的第(6～10)～(14～18)小时，第三阶段为发酵的第(14～18)～(28～32)小时。
9.第二方面，本发明实施例提供了一种复合微生物制剂，其由前述实施例所述的复合微生物制剂制备获得。
10.第三方面，本发明实施例提供了一种复合微生物制剂的试剂盒，其包括如前述实施例所述的复合微生物制剂。
11.第四方面，本发明实施例提供了一种复合微生物制剂的保存试剂，按重量份数计，所述保存试剂的主要成分包括：葡萄糖0.5～0.6份、玉米淀粉2～2.4份、抗坏血酸钠0.2～0.24份、七水硫酸亚铁0.48～0.5份、磷酸氢二钾0.4～0.48份、磷酸二氢钾0.08～0.1份、亚麻酸4～4.8份、单油酸甘油酯0.5～0.6份、羧甲基壳聚糖0.4～0.5份和氯化钠0.85～0.9份。
12.第五方面，本发明实施例提供了一种复合微生物制剂，其包括：前述实施例所述的复合微生物制剂和前述实施例所述的复合微生物制剂的保存试剂。
13.第六方面，本发明实施例提供了一种复合微生物制剂的保存方法，其包括：将前述实施例所述的复合微生物制剂与前述实施例所述的复合微生物制剂的保存试剂混合。
14.本发明具有以下有益效果：
15.本发明发现，通过对发酵过程中的ph进行分阶段调控，能够提高乳杆菌和肠球菌的混合发酵效果，平衡两种菌种数量与活性，提高菌剂质量，解决乳杆菌抗逆性弱的短板，有效避免或减少混合发酵中出现杂菌，为复合菌剂的应用提供了途径。
具体实施方式
16.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
17.本发明实施例提供了一种复合微生物制剂的制备方法，其包括以下步骤：将乳杆菌的种子液和肠球菌的种子液混合后发酵；发酵过程中，按3个阶段对发酵培养基中的ph进行调控：
18.第一阶段，调控ph为6.6～6.8；
19.第二阶段，调控ph为5.9～6.1；
20.第三阶段，调控ph为5.0～5.2；
21.其中，第一阶段为发酵的第0～(6～10)小时；第二阶段为发酵的第(6～10)～(14～18)小时；第三阶段为发酵的第(14～18)～(28～32)小时。
22.虽然乳杆菌的生长速度比肠球菌慢，但乳杆菌对于低ph的耐受能力更强；其中，在发酵的第一阶段，ph控制为6.6-6.8，主要是为了让肠球菌大量扩增以起到抑制杂菌的作用；第二阶段，ph控制为5.9-6.1，主要是因为本阶段肠球菌、乳杆菌均已形成规模，通过降低ph，来减缓肠球菌的生长，同时，该ph对乳杆菌的生长无影响，乳杆菌在此阶段可以大量扩培；第三阶段，ph控制为5.0-5.2，主要是该ph下虽然乳杆菌的生长也会受到一定的抑制，但肠球菌在此ph下几乎不生长，通过此阶段的发酵，来调节发酵液中肠球菌/乳杆菌的比例，提升乳杆菌的比例。
23.本发明实施例提供的乳杆菌和肠球菌复合微生态制剂的制备方法操作简单，发酵过程中不易染菌，发酵后乳杆菌、肠球菌的比例接近，总菌量高，易于应用。
24.可选地，第一阶段为发酵的第0～(6、7、8、9和10中的任意一种或任意两种之间的范围)小时。第二阶段为发酵的第(6、7、8、9和10中的任意一种或任意两种之间的范围)～(14、15、16、17和18中的任意一种或任意两种之间的范围)小时。第三阶段为发酵的第(14、15、16、17和18中的任意一种或任意两种之间的范围)～(28、29、30、31和32中的任意一种或任意两种之间的范围)小时。
25.在一些优选实施例中，第一阶段为发酵的第0～(7～9)小时；第二阶段为发酵的第(7～9)～(15～17)小时；第三阶段为发酵的第(15～17)～(29～31)小时。
26.在一些优选实施例中，第一阶段为发酵的第0～8小时，第二阶段为发酵的第8～16小时，第三阶段为发酵的第16～30小时。
27.在一些实施例中，所述制备方法包括采用ph调控剂对发酵培养基中的ph进行调
控。
28.在一些实施例中，所述ph调控剂包括：体积分数为1％～20％的氢氧化钠和/或体积分数为1％～20％的盐酸。可选地，盐酸和氢氧化钠的体积分数可以独立地为1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％中的任意一种或任意两种之间的范围。
29.在一些实施例中，乳杆菌的种子液和肠球菌的种子液的活菌数比为：(0.5～2)：(0.5～2)，具体可以为(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中的任意一种或任意两种之间的范围):(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中的任意一种或任意两种之间的范围)。
30.在一些实施例中，所述乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌中的至少一种。
31.在一些实施例中，所述肠球菌包括粪肠球菌和屎肠球菌中的至少一种。
32.在一些实施例中，所述发酵的条件还包括：36～38℃，转速为40～50rpm，不通气；该温度具体可以为36℃、37℃和38℃中的任意一种或任意两种之间的范围。
33.在一些实施例中，所述发酵培养基的初始ph为7.0～7.2。该ph具体可以为7.0、7.1和7.2中的任意一种或任意两种之间的范围。
34.在一些实施例中，按重量分数计，所述发酵采用的发酵培养基包括以下组分：葡萄糖2％～2.4％，麦芽糖1％～1.2％，麸皮1％～1.2％，蛋白胨1％～1.2％，酵母浸粉1％～1.2％，乙酸钠0.5％～0.6％，一水硫酸镁0.02％～0.24％，一水硫酸锰0.02％～0.24％，磷酸氢二钾0.2％～0.24％和余量水。
35.在一些实施例中，所述制备方法还包括对发酵后的菌液进行过滤。
36.在一些实施例中，所述过滤的步骤包括：将所述发酵后的菌液经振荡筛过滤，得到的滤液与水按体积比为(1～3)：(1～3)混合，然后经陶瓷膜过滤器浓缩至与原菌液相同的体积。该体积比具体可以为1:1、1:2、2:1、1:3和3:1中的任意一种或任意两种之间的范围。
37.优选地，所述复合微生物制剂中，乳杆菌的活菌数与肠球菌的活菌数比为(1～1.5)：1。
38.本发明实施例还提供了一种复合微生物制剂，其由前述任意实施例所述的复合微生物制剂制备获得。
39.本发明实施例还提供了一种复合微生物制剂的试剂盒，其包括如前述任意实施例所述的复合微生物制剂。
40.本发明实施例还提供了一种复合微生物制剂的保存试剂，按重量份数计，所述保存试剂的主要成分包括：葡萄糖0.5～0.6份、玉米淀粉2～2.4份、抗坏血酸钠0.2～0.24份、七水硫酸亚铁0.48～0.5份、磷酸氢二钾0.4～0.48份、磷酸二氢钾0.08～0.1份、亚麻酸4～4.8份、单油酸甘油酯0.5～0.6份、羧甲基壳聚糖0.4～0.5份和氯化钠0.85～0.9份。
41.葡萄糖作为单糖，是微生物最容易利用的速效碳源之一，而玉米淀粉是由玉米经过多段工序处理而成的产物，主要由大量淀粉及少量脂肪、蛋白质构成，能提供大量的迟效碳源，在酶的作用下缓慢分解以提供微生物营养，同时也能提供部分迟效氮源，葡萄糖和玉米淀粉共同生效能在初期及长期保存过程中保证微生物的活性；抗坏血酸钠作为抗氧化剂，其相比抗坏血酸在水中的溶解性更好，对于氧自由基有较高的清除率，能降低其对乳杆菌和肠球菌的危害，同时也能降低液态菌剂中部分有效成分的氧化，提高保存时限；七水硫
酸亚铁则起到降低液态菌剂氧化还原电位的作用，乳杆菌和肠球菌均为兼性厌氧菌，高氧化还原电位下会抑制乳杆菌和肠球菌，且容易导致好氧菌滋生；磷酸氢二钾和磷酸二氢钾作为ph缓冲对，起到稳定液体菌剂ph的作用，防止在保存过程中ph发生大的变化；亚麻酸是一种多元不饱和脂肪酸，其作用是形成油质保护膜以包裹乳酸菌和保护剂的复合体，而单油酸甘油酯作为乳化剂，能使亚麻酸与水性的液态菌剂形成均匀的乳状液，其在过量水中与亚麻酸共同作用，形成一种外层为油质保护膜，内部为乳酸菌、保护剂复合体的均匀微滴结构；羧甲基壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物，水溶性较好，主要起到增稠、成膜的左右，使乳酸与保护剂形成稳定的复合体，使得亚麻酸和单油酸甘油酯形成的均匀微滴结构更为稳定，同时，作为壳聚糖的衍生物，其具有广谱抑菌作用，一方面能减缓乳酸菌的代谢，提高其存活时间，另一方面也能抑制杂菌的滋生；氯化钠浓度控制为生理盐水的浓度，主要作用是维持溶液的渗透压。
42.上述特定组分及特定配比下的保存试剂能够有效延长乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的保存期限，在30天和90天的保存时限内，菌量均没有明显的下降，保存效果优于现如今的乳杆菌和肠球菌复合微生态制剂，大大促进了生产活动。
43.本发明实施例还提供了一种复合微生物制剂，其包括：前述任意实施例所述的复合微生物制剂和前述任意实施例所述的复合微生物制剂的保存试剂。
44.在一些实施例中，复合微生物制剂和保存试剂的质量比为100：(1～30)。该质量比具体可以为100:1、100:5、100:10、100:15、100:20、100:25和100:30中的任意一种或任意两种之间的范围。
45.优选地，复合微生物制剂和保存试剂的质量比为100：(11.56～15.12)。具体可以为100:11.56、100:12、100:13、100:14、100:15和100:15.12中的任意一种或任意两种之间的范围。
46.此外，本发明实施例还提供了一种复合微生物制剂的保存方法，其包括：将前述任意实施例所述的复合微生物制剂与前述任意实施例所述的复合微生物制剂的保存试剂混合。
47.在一些实施例中，复合微生物制剂和保存试剂的质量比同前述任意实施例所述。
48.在一些实施例中，混合后的保存条件为：常温(5～30℃)，避光。
49.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
50.实施例1
51.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，其包括以下步骤。
52.(1)菌种复壮活化
53.将保存于斜面的乳杆菌(鼠李糖乳杆菌atcc7469，来自于广东环凯微生物科技有限公司)和肠球菌(粪肠球菌atcc29212，来自于广东环凯微生物科技有限公司)分别接种到摇瓶培养基中，培养20～24小时(稀释5倍之后，od660＝0.4～0.6)，培养完毕后划线至琼脂平板上，用于种子液制备。
54.其中，摇瓶培养条件为36～38℃，静置培养，培养基为mrs肉汤，平板为mrs琼脂平板；
55.(2)制备种子液
56.种子液采取二级种子液培养，先将复壮后的平板上的菌落接种至一级种子液摇
瓶，培养后从一级种子液吸取菌液转接至二级种子液摇瓶，培养后用作车间种子液；
57.其中，一级种子液体积为100ml，培养时间为24小时；二级种子液体积为1500ml，培养时间为30小时(培养至培养液稀释5倍之后，od660＝0.4～0.6)；一级种子液转接二级种子液时转接菌液量为10ml。
58.其中，摇瓶培养条件均为37℃静置培养，培养基为mrs肉汤；
59.(3)发酵罐发酵
60.将2瓶种子液(活菌数约为1：1)接种至灭菌后的发酵罐中，发酵30个小时后结束发酵。
61.其中，初始参数为：ph为7.2，温度为37℃，转速为40～50rpm，不通气。
62.发酵培养基配方为：葡萄糖2％，麦芽糖1.2％，麸皮1％，蛋白胨1％，酵母浸粉1.2％，乙酸钠0.5％，一水硫酸镁0.024％，一水硫酸锰0.02％，磷酸氢二钾0.24％，余量水。
63.发酵工艺中，ph的调控过程如下：
64.0-8小时，ph控制为6.8；
65.8-16小时，ph控制为5.9；
66.16-30小时，ph控制为5.2。
67.(4)保存
68.结束发酵后，将得到的菌液经振荡筛过滤，得到的滤液加同体积自来水混合，然后经陶瓷膜过滤器浓缩至与原菌液相同的体积，然后将得到的过滤液转至储液罐，在储液罐中添加保护剂。
69.其中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、亚麻酸4.8％、单油酸甘油酯0.5％、羧甲基壳聚糖0.5％和氯化钠0.85％。
70.需要说明的是，组分的添加量中的“％”是指：某一组分的质量/过滤液(添加保护剂前)的质量，后续实施例以此类推。
71.其中，调节ph使用10％氢氧化钠和10％盐酸。
72.实施例2
73.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(2)中，二级种子液体积为1200ml。
74.实施例3
75.本实施例与实施例1的区别在于，步骤三中，发酵培养基配方为：葡萄糖1％，麦芽糖2.4％，麸皮1.2％，蛋白胨1.2％，酵母浸粉1％，乙酸钠0.6％，一水硫酸镁0.02％，一水硫酸锰0.24％，磷酸氢二钾0.2％，余量水。
76.实施例4
77.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(3)中，发酵工艺中，ph的调控过程如下：
78.0-8小时，ph控制为6.6；
79.8-16小时，ph控制为5.9；
80.16-30小时，ph控制为5.2。
81.实施例5
82.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(3)中，发酵工艺中，ph的调控过程如下：
83.0-8小时，ph控制为6.8；
84.8-16小时，ph控制为6.1；
85.16-30小时，ph控制为5.2。
86.实施例6
87.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(3)中，发酵工艺中，ph的调控过程如下：
88.0-8小时，ph控制为6.8；
89.8-16小时，ph控制为5.9；
90.16-30小时，ph控制为5.0。
91.实施例7
92.种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，所述乳杆菌为嗜酸乳杆菌，所述肠球菌为屎肠球菌。
93.实施例8
94.种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，所述乳杆菌为植物乳杆菌，所述肠球菌为粪肠球菌。
95.实施例9
96.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.6％、玉米淀粉2％、抗坏血酸钠0.24％、七水硫酸亚铁0.48％、磷酸氢二钾0.4％、磷酸二氢钾0.1％、亚麻酸4％、单油酸甘油酯0.6％、羧甲基壳聚糖0.4％和氯化钠0.9％。
97.对比例1
98.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(3)中，发酵工艺中，ph的调控过程如下：
99.0-16小时，ph控制为5.9；
100.16-30小时，ph控制为5.2。
101.对比例2
102.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(3)中，发酵工艺中，ph的调控过程如下：
103.0-16小时，ph控制为6.8；
104.16-30小时，ph控制为5.2。
105.对比例4
106.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(3)中，发酵工艺中，ph的调控过程如下：
107.0-30小时，ph控制为6.8。
108.对比例5
109.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚
铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、亚麻酸4.8％、单油酸甘油酯0.5％、羧甲基壳聚糖0.5％和氯化钠0.85％。
110.对比例6
111.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、亚麻酸4.8％、单油酸甘油酯0.5％、羧甲基壳聚糖0.5％、氯化钠0.85％。
112.对比例7
113.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％和氯化钠0.85％。
114.对比例8
115.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、亚麻酸4.8％、单油酸甘油酯0.5％和氯化钠0.85％。
116.对比例9
117.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、亚麻酸4.8％和氯化钠0.85％。
118.对比例10
119.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、单油酸甘油酯0.5％和氯化钠0.85％。
120.对比例11
121.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、羧甲基壳聚糖0.5％和氯化钠0.85％。
122.对比例12
123.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、亚麻酸3.0％、单油酸甘油酯0.5％、羧甲基壳聚糖0.5％和氯化钠0.85％。
124.对比例13
125.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠
0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、亚麻酸6.0％、单油酸甘油酯0.5％、羧甲基壳聚糖0.5％和氯化钠0.85％。
126.对比例14
127.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、亚麻酸4.8％、单油酸甘油酯0.4％、羧甲基壳聚糖0.5％和氯化钠0.85％。
128.对比例15
129.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、亚麻酸4.8％、单油酸甘油酯0.7％、羧甲基壳聚糖0.5％和氯化钠0.85％。
130.对比例16
131.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、亚麻酸4.8％、单油酸甘油酯0.5％、羧甲基壳聚糖0.3％和氯化钠0.85％。
132.对比例17
133.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.5％、玉米淀粉2.4％、抗坏血酸钠0.2％、七水硫酸亚铁0.5％、磷酸氢二钾0.48％、磷酸二氢钾0.08％、亚麻酸4.8％、单油酸甘油酯0.5％、羧甲基壳聚糖0.6％和氯化钠0.85％。
134.对比例18
135.一种乳杆菌和肠球菌的复合微生物制剂的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于，步骤(4)中，保护剂的各组分的添加量为：葡萄糖0.6％、磷酸氢二钾0.4％、磷酸二氢钾0.1％、甘油15％和氯化钠0.85％。
136.试验例1
137.采用稀释平板计数法对实施例1-4以及对比例1-4发酵后的菌量进行测定，其结果如表1所示。
138.表1 菌量的测定结果
139.[0140][0141]
由实施例1～8可以看出，实施例1的制备方法效果最佳，实施例2～8的配方或工艺变动幅度，以及菌种的变动，对于发酵结果变化不大。由对比例1可以看出，发酵初期ph较低的情况下，会导致发酵后肠球菌的菌量大幅度降低；由对比例2、3、4可以看出，发酵中期或后期不降低ph的情况下，均会导致发酵后乳杆菌的菌量有明显的降低，尤其是发酵中期不降低ph影响更为显著，而发酵中期和后期均不对ph进行降低的情况下，会导致发酵后乳杆菌的菌量极大幅度的降低。
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试验例2
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按试验例1相同的方法，分别于30天和90天取样测乳酸菌总菌量，检测结果如表2所示。
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表2 检测结果
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[0147][0148]
由实验例1和实施例7-9可以看出，实施例1的保存方法效果最佳，实施例7-9的变动幅度，对于保存效果变化不大。由对比例5和对比例6可以看出，保护剂中缺乏玉米淀粉或者缺乏抗坏血酸钠和七水硫酸亚铁，均会导致微生态菌剂的保存效果有明显的下降；由对比例7可以看出，保护剂中缺乏亚麻酸、单油酸甘油酯和羧甲基壳聚糖，会对保存效果造成极大的影响；由对比例7、9、10间的比较可以看出，亚麻酸、单油酸甘油酯均能使保存效果有一定的提升，且亚麻酸对于保存效果的提升更明显；同时，由对比例7与对比例8、对比例7与对比例9、对比例7与对比例10的比较可以看出，亚麻酸和单油酸甘油酯同时加入微生态菌剂中时，保存效果的提升远大于单独加入时的效果，这是由于单油酸甘油酯作为乳化剂，能使亚麻酸与水性的液态菌剂形成稳定的乳状液；由对比例7、11间的比较可以看出，羧甲基壳聚糖能使保存效果有一定的提升，而由对比例7与对比例8、对比例7与对比例11、对比例7与实验例1的比较可以看出，羧甲基壳聚糖作为增稠剂与亚麻酸、单油酸甘油酯共同作用时，保存效果能得到巨大的提升，这是由于羧甲基壳聚糖作为增稠剂，可使乳酸与保护剂之间形成均匀的复合体，使得亚麻酸和单油酸甘油酯形成的均匀微滴结构更为稳定；由对比例12-17可以看出，亚麻酸、单油酸甘油酯和羧甲基壳聚糖的添加比例过多或过少均会对明显的下降，尤其是添加比例过少时下降更为显著；由对比例18可以看出，本发明的保护剂相比较常规的保护剂，对于乳酸菌的保存效果有巨大的提升。
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综上所述，本发明的乳杆菌和肠球菌的复合微生态制剂的制备方法操作简单，发酵过程中不易染菌，发酵后乳杆菌和肠球菌的比例接近，总菌量高，发酵后制备的乳杆菌、肠球菌复合微生态制剂在30天、90天的保存时限内，菌量均没有明显的下降，保存效果优于于现如今的乳杆菌、肠球菌复合微生态制剂，大大促进了生产活动。
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以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。