一种具有美白功效的珍珠贝酪氨酸酶抑制肽及其应用

1.本发明涉及活性肽技术领域，更具体地，涉及一种具有美白功效的珍珠贝酪氨酸酶抑制肽及其应用。


背景技术：

2.近年来，基于肽的皮肤美白剂研究备受关注。研究发现，部分天然蛋白的水解物具有美白功能，可抑制酪氨酸酶活性并抑制黑色素生成。grazia luisi等发现一些小肽和氨基酸具有抗氧化和酪氨酸酶抑制双重活力，经典抗氧化肽谷胱甘肽(gsh)也被报道具有皮肤美白和抗衰老作用。生物活性肽由多种氨基酸组成，营养价值和功能活性并存，具有性质稳定和安全低敏的优点。食源性美白活性肽兼具抗氧化和美白活性，可口服和外用，比如名称为一种多功能马氏珠母贝源美白肽的制备方法及应用提供了一种具有酪氨酸酶抑制活性的多功能马氏珠母贝源美白肽，但相关研究还较少，因此继续开展相关研究具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的首要目的是克服上述现有具有酪氨酸酶抑制活性的食源性肽仍然较少的问题，提供一种具有美白功效的珍珠贝酪氨酸酶抑制肽。该珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在分子层面、细胞层面和生物层面都具有良好的酪氨酸酶抑制活性，可抑制黑色素的合成，表现出良好的美白活性。
4.本发明的进一步目的是提供上述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。
5.本发明的进一步目的是提供上述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备美白药物中的应用。
6.本发明的进一步目的是提供上述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备功能性食品中的应用。
7.本发明的进一步目的是提供上述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备化妆品中的应用。
8.本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
9.一种具有美白功效的珍珠贝酪氨酸酶抑制肽，所述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽的序列为：wll。
10.该珍珠贝酪氨酸酶抑制肽序列为：wll，即trp-leu-leu。
11.本发明的发明人从珍珠贝肉(马氏珠母贝)中获得了该特定序列的珍珠贝酪氨酸酶抑制肽，分子量为430.2580da。经实验发现，该珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在分子层面和生物层面都具有良好的酪氨酸酶抑制活性，可抑制黑色素的合成，表现出良好的美白活性。
12.上述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用也在本发明的保护范围内。
13.优选地，所述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备具有酪氨酸酶单酚酶抑制活性和/或
酪氨酸酶二酚酶抑制活性的抑制剂中的应用。
14.研究发现，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶的氨基酸残基通过氢键、静电相互作用和疏水互相作用结合，可有效抑制酪氨酸酶的活性。
15.一方面，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶的asp353、glu356、lys376、gln307形成7个氢键，与酪氨酸酶的活性中心稳定结合，可以抑制酪氨酸酶活力。
16.优选地，所述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备与酪氨酸酶的氨基酸残基asp353、glu356、lys376、gln307通过氢键结合的酪氨酸酶抑制剂中的应用。
17.另一方面，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶形成了6个疏水相互作用，3个静电相互作用。疏水相互作用形成的疏水环境有助于氢键的形成，静电相互作用形成的引力有助于提高氨基酸之间结合的稳定性。
18.优选地，所述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备与酪氨酸酶的氨基酸残基lys379、trp358、tyr311、lys376通过疏水相互作用结合的酪氨酸酶抑制剂中的应用。
19.优选地，所述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备与酪氨酸酶的氨基酸残基asp354、glu356、asp357通过静电相互作用结合的酪氨酸酶抑制剂中的应用。
20.上述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备美白药物中的应用也在本发明的保护范围内。
21.优选地，所述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备抑制黑色素合成的药物中的应用。
22.上述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备功能性食品中的应用也在本发明的保护范围内。
23.上述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在制备化妆品中的应用也在本发明的保护范围内。
24.优选地，所述珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在酪氨酸酶抑制剂、美白药物、功能性食品或化妆品中的添加量为0.01～1.00mg/ml。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
26.该珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在分子层面、细胞层面和生物层面都具有良好的酪氨酸酶抑制活性，可抑制黑色素的合成，表现出良好的美白活性。
附图说明
27.图1为实施例1的体外酪氨酸酶抑制活性评价结果图。
28.图2为珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的3d和2d可视化图，其中，图2a是珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的3d可视化图，图2b是珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的2d可视化图。
29.图3为实施例2的体外酪氨酸酶抑制活性结果图。
30.图4为实施例3的珍珠贝酪氨酸酶抑制肽对斑马鱼存活率影响的实验结果图。
31.图5为实施例3的珍珠贝酪氨酸酶抑制肽对斑马鱼黑色素含量的影响的实验结果图。
32.图6为实施例3珍珠贝酪氨酸酶抑制肽对酪氨酸酶活力的影响的实验结果图。
具体实施方式
33.为了更清楚、完整的描述本发明的技术方案，以下通过具体实施例进一步详细说明本发明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明，
可以在本发明权利限定的范围内进行各种改变。
34.各实施例中使用的主要材料与试剂说明如下：
35.珍珠贝肉(马氏珠母贝肉)由北海黑珍珠海洋生物科技有限公司(中国广西)提供。中性蛋白酶(10ku/g)购自南宁庞博生物工程有限公司(中国南京)。l-酪氨酸、l-多巴、酪氨酸酶(br，蘑菇，500u/mg，25ku)购自上海源叶生物科技有限公司(中国南京)。western及ip细胞裂解液、苯甲基磺酰氟(pmsf)购自上海碧云天生物技术有限公司(中国上海)。其他试剂均为分析纯，超纯水为实验室自制。
36.实施例1珍珠贝酪氨酸酶抑制肽的制备
37.将珍珠贝肉搅碎成肉糜，加超纯水(料液比1:1，w/w)并调整ph为7.25，加入中性蛋白酶(酶底比0.4％，w/w)，50℃下酶解3h，酶解结束后立即在90℃下灭酶15min，冷却室温后在4000r/min下离心15min获得珍珠贝肉酶解液，并保存于-20℃用于进一步分析。
38.采用超滤膜(3kda)按照分子量大小分离珍珠贝肉酶解液，获得分子量≥3kda和＜3kda两个组分。分别将珍珠贝肉酶解液、≥3kda组分和＜3kda组分作为样液，进行体外酪氨酸酶抑制活性评价。
39.体外酪氨酸酶抑制活性实验的具体过程如下：
40.分别以l-酪氨酸和l-多巴作为单酚底物和二酚底物，取40μl l-酪氨酸溶液(0.5mm)或l-多巴溶液(0.5mm)，加入40μl样液和80μl磷酸缓冲溶液(0.05m，ph 6.8)，在37℃保温10min后加入40μl酪氨酸酶溶液(250u/ml)启动反应，在酶标仪(enspire xenon light module,200perkin
–
elmer,beaconsfield,u.k.)波长475nm下分别测0min和30min吸光值。根据公式(1)计算酪氨酸酶抑制率(包括酪氨酸酶的单酚酶抑制率和酪氨酸酶的二酚酶抑制率)。
41.酪氨酸酶抑制率/％＝[1-(δa
1-δa2)/(δa
3-δa4)]
×
100％
ꢀꢀ
(1)
[0042]
式中：a1为底物、样液、酪氨酸酶和pbs体系的吸光值；a2为样液、酪氨酸酶和pbs体系的吸光值；a3为底物、酪氨酸酶和pbs体系的吸光值；a4为酪氨酸酶和pbs体系的吸光值。
[0043]
珍珠贝肉酶解液、≥3kda组分和＜3kda组分的体外酪氨酸酶抑制活性评价结果如图1所示，其中，图1a为酪氨酸酶的单酚酶抑制活性结果图，图1b为酪氨酸酶的二酚酶抑制活性结果图。从图1可知，珍珠贝肉酶解物、≥3kda组分和＜3kda组分都具有酪氨酸酶单酚酶抑制活性和酪氨酸酶单酚酶抑制活性；在0.5mg/ml和1mg/ml下，＜3kda组分的活性都优于酶解物和≥3kda组分，其中在0.5mg/ml下具有显著性(p＜0.05)，这表明，活性更好的肽组分主要集中于＜3kda组分中。在1mg/ml下，＜3kda组分的二酚酶抑制活性为15.96％，略高于木瓜籽活性肽的＜1kda组分(约15％)及1-3kda组分(约5％)(木瓜籽活性肽的数据来源于文献：skin-care functions of peptides prepared from chinese quince seed protein:sequences analysis,tyrosinase inhibition and molecular docking study，yejundeng etc.industrial crops and products,volume 148,june 2020,112331)，说明＜3kda组分具有更好的酪氨酸酶抑制能力。将以＜3kda组分作为进一步研究对象，进行肽段分析。
[0044]
采用lc-ms/ms对＜3kda组分进行结构鉴定，＜3kda组分鉴定出404个肽段，再以氨基酸残基≤10，置信度≥30为条件初步筛选，获得117个肽段。lc-ms/ms鉴定的具体过程为：经脱盐处理后的《3kda加载在液相为easy nlc1200纳升液相系统(thermofisher,usa)中，
经分析柱c18反相色谱柱(2μm，75μm
×
25cm，acclaim pepmap rslc)洗脱。洗脱程序为b液(80％乙腈，0.1％甲酸)0～60min：5％～38％。采用thermofisher q exactive系统(thermofisher,usa)结合纳升喷雾nano flex离子源(thermofisher,usa)进行质谱，喷雾电压为1.9kv，离子传输管加热温度为275℃。通过一级和二级质谱先后确定肽段分子质量和氨基酸序列，ms/ms原始文件通过使用pfind搜索引擎进行分析。通过检索uniprot中pinctada martensi物种蛋白数据库，对肽序列进行匹配，确定肽段的一级结构。
[0045]
将117个肽段分别与酪氨酸酶(pdb id：2y9x)进行分子对接，筛选结合能低较低的肽段。分子对接的过程为：将鉴定所得的肽段和酪氨酸酶(pdb id：2y9x)在autodock vina软件上进行分子对接，模拟肽与酪氨酸酶的可能结合方式，筛选具有最优酪氨酸酶抑制潜力的肽序列。酪氨酸酶的三维坐标从蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)中下载。肽的三维结构采用marvinsketch设计，并导出能量最小化的三维构象，随后将酪氨酸酶和肽分别导入autodocktools(adt)进行去水加氢等预处理。设置对接盒子中心为center_x：-7.384、center_y：-23.549和center_z：-19.8，尺寸为size_x：47.25，size_y：47.25，size_z：47.25。为了提高对接准确度，将穷举数为20，其他为默认参数。运行autodock vina对接程序，根据内置打分函数选取最优对接构象并使用discovery studio visualizer进行可视化分析。
[0046]
其中，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽(序列为：wll，即trp-leu-leu)与酪氨酸酶(2y9x)对接结果如表1所示。珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)的结合能为-8.2kcal/mol，与酪氨酸酶(2y9x)具有很好的结合作用，理论上表明珍珠贝酪氨酸酶抑制肽具有和酪氨酸酶活性中心紧密结合的能力。
[0047]
表1珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)分子对接结果
[0048][0049][0050]
珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)形成不同的分子间作用力，其作用类型及数量如表2所示。
[0051]
表2珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)分子对接位点
[0052][0053]
珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的3d和2d可视化结果如图2所示，其中，图2a是珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的3d可视化图，图2b是珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的2d可视化图。从图2可知，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽，与酪氨酸酶(2y9x)的氨基酸残基asp353、glu356、lys376和gln307形成7个氢键(包括
conventional hydrogen bond和carbon hydrogen bond)，键长范围为珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)的氨基酸残基lys379、trp358、tyr311、lys376形成了6个疏水相互作用(包括alkyl和pi-alkyl)，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽与酪氨酸酶(2y9x)的氨基酸残基asp354、glu356、asp357形成了3个静电相互作用(包括salt bridge、attractive charge和pi-anion)。疏水相互作用形成的疏水环境有助于氢键的形成，静电相互作用形成的引力有助于提高氨基酸之间结合的稳定性。这表明分子机制上珍珠贝酪氨酸酶抑制肽能与酪氨酸酶(2y9x)活性中心稳定结合，可以抑制酪氨酸酶活力。
[0054]
珍珠贝酪氨酸酶抑制肽的合成：采用固相合成法，由南京杰肽生物技术公司合成，合成的珍珠贝酪氨酸酶抑制肽的纯度＞98％，在-20℃下保存，用于后续的测试实验。
[0055]
实施例2珍珠贝酪氨酸酶抑制肽的体外酪氨酸酶抑制活性评价
[0056]
以珍珠贝酪氨酸酶抑制肽作为样液，按前述提及的体外酪氨酸酶抑制活性实验对珍珠贝酪氨酸酶抑制肽进行体外酪氨酸酶抑制活性评价，结果如图3所示，在1mg/ml下，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽对酪氨酸酶的单酚酶抑制率为57.50％，对酪氨酸酶的二酚酶抑制率为15.96％，表明珍珠贝酪氨酸酶抑制肽具有良好的酪氨酸酶单酚酶抑制活性和酪氨酸酶二酚酶抑制活性。
[0057]
珍珠贝酪氨酸酶抑制肽中疏水性氨基酸残基比例为100％，氨基酸残基trp和leu的疏水侧链可直接与酪氨酸酶的疏水区域相互作用，抑制酪氨酸酶活性。同时含苯环的氨基酸残基trp和重复的氨基酸残基leu-leu都可以增强珍珠贝酪氨酸酶抑制肽的酪氨酸酶抑制能力。
[0058]
实施例3基于斑马鱼模型研究珍珠贝酪氨酸酶抑制肽的美白功效
[0059]
3.1斑马鱼的培养
[0060]
将野生型斑马鱼饲养于水温28.5℃、ph 7.5～8.5环境中，将10组斑马鱼按雌雄1:2的配种比例置于带隔板的配种缸中，雌雄分开，暗处理12h后恢复光照处理并抽出隔板使斑马鱼交配获得鱼卵，其中健康斑马鱼卵受精率达≥80％即可选择用于实验。
[0061]
3.2珍珠贝酪氨酸酶抑制肽对斑马鱼存活率影响
[0062]
斑马鱼卵敏感性高，活性实验前先进行毒性验证。收集健康斑马鱼卵在96孔板中，以每孔1尾的密度铺板，每孔加入180μl含珍珠贝酪氨酸酶抑制肽(25、50、100、150、200、250和500μg/ml)的斑马鱼培养水，每24h观察胚胎死亡情况及致畸情况，连续观察5d，观察不同浓度珍珠贝酪氨酸酶抑制肽对斑马鱼发育的影响，结果如图4所示。从图4可知，在25～500μg/ml浓度范围内，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽处理的斑马鱼均全部存活，生理状态正常。将在此基础上进行珍珠贝酪氨酸酶抑制肽的美白功效研究。
[0063]
3.3珍珠贝酪氨酸酶抑制肽对斑马鱼黑色素含量的影响
[0064]
刚产的斑马鱼卵通体透明，随着受精卵的发育，斑马鱼卵体表和体内的黑色素逐步生成，最终鱼卵发育成鱼，可直接观察到斑马鱼体表黑色生成情况，反映样品对斑马鱼中黑色素合成的影响，进而评估美白效果。谷胱甘肽(gsh)是具有抗氧化效果和美白效果的短段，常被应用于功能性食品或化妆品中，可作为美白活性肽的阳性对照。
[0065]
黑色素含量测定的具体过程为：收集受精24h后的健康斑马鱼卵，在12孔板中以每孔20尾的密度铺板，分别加入2ml含珍珠贝酪氨酸酶抑制肽(10、50和200μg/ml)的斑马鱼培养水，分别设置空白组(仅含培养水)、阳性对照组(含10、50和200μg/ml gsh的培养水)。在
28.5℃下恒温处理48h后，取斑马鱼于体视镜(nikon smz460，nikon corporation，japan)下观察形态及黑色素分布情况并拍摄背视图和侧视图，结果如图5a所示。收集其余斑马鱼用蒸馏水洗涤后冰冻(-80℃)处死，加入冰浴后的200μl western及ip细胞裂解液(含1％(体积分数)1mm pmsf)并反复冻融3次破碎鱼体，4000r/min离心10min，得上清液和沉淀。取沉淀用于测定黑色素含量，沉淀加入250μl naoh溶液(1m，10％dmso)，85℃水浴2h，取100μl加入96孔板中，在405nm下测定吸光值。每个样品均以bca试剂盒(碧云天)进行归一化处理。根据公式(2)分别计算相对黑色素含量。
[0066]
相对黑色素含量/％＝(a
t
/ao)
×
100％
ꢀꢀ
(2)
[0067]
式中：a
t
为珍珠贝酪氨酸酶抑制肽处理组或阳性对照(gsh)组的吸光值；a0为空白组的吸光值。
[0068]
相对黑色素含量的测试结果如图5所示。从图5a可知，与空白组对比，在200μg/ml下，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽处理的斑马鱼在背视图中头部黑色“v”字型斑点区域明显减少，在侧视图中腹部的黑色斑点减淡，鱼体比空白组透明的现象。
[0069]
从图5b可知，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽处理的马鱼黑色素含量都比空白组显著降低(p＜0.05)。在浓度为10、50和200μg/ml的珍珠贝酪氨酸酶抑制肽处理下，斑马鱼中黑色素相比空白组分别降低了13.23％、36.51％和40.39％。这表明了珍珠贝酪氨酸酶抑制肽表现出良好的黑色素抑制能力。当浓度为50和200μg/ml时，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽处理组比相同浓度的阳性对照组(gsh)分别降低了13.96％和16.45％的黑色素，表明珍珠贝酪氨酸酶抑制肽表现出比阳性对照(gsh)更强的黑色素抑制作用。
[0070]
3.4珍珠贝酪氨酸酶抑制肽对斑马鱼酪氨酸酶活力的影响
[0071]
对酪氨酸酶活力的影响的具体过程为：取步骤3.3中黑色素含量测定的具体过程中离心后得到的上清液，在96孔板中将20μl上清液和180μl l-多巴(1mg/ml)混匀后避光37℃孵育2h，475nm下测定吸光值，根据公式(3)分别计算相对酪氨酸酶活力。
[0072]
相对酪氨酸酶活力/％＝(a
t’/a
o’)
×
100％
ꢀꢀ
(3)
[0073]
式中：a
t’为珍珠贝酪氨酸酶抑制肽处理组或阳性对照(gsh)组的吸光值；a0’
为空白组的吸光值。
[0074]
从图6可知，与空白组相比，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽可显著降低斑马鱼体内的酪氨酸酶活力(p＜0.05)。在浓度为10、50和200μg/ml的珍珠贝酪氨酸酶抑制肽处理下，斑马鱼酪氨酸酶活力相比空白组分别降低了39.36％、50.33％和64.99％，同时分别比相同浓度的阳性对照组(gsh)降低8.68％、15.30％和28.55％。这表明，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽表现出良好的酪氨酸酶抑制能力，且珍珠贝酪氨酸酶抑制肽的酪氨酸酶抑制能力显著优于gsh(p＜0.05)。以上结果表明，珍珠贝酪氨酸酶抑制肽在斑马鱼模型上具有良好的酪氨酸酶抑制活力，可通过抑制酶活力降低黑色素生成量，达到美白效果。
[0075]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。