一种神经酸钙纳米颗粒的制备方法及其在制备骨缺损修复材料中的应用

1.本发明涉及一种神经酸钙纳米颗粒的制备方法及其在制备骨缺损修复材料中的应用，属于生物医学领域。


背景技术：

2.由术后骨损伤、创伤性骨折、先天性疾病等造成的骨缺损是骨科最常见的治疗难题之一。基于干细胞的组织工程被认为是治疗骨缺损的一种可行方案。其基本思路是在体内或体外诱导干细胞向成骨细胞分化，逐渐形成的新生骨组织填补缺损处，从而实现骨缺损的修复。因此，人们开发了很多骨生物材料，这些骨生物材料的传统生物学原理是直接刺激干细胞的成骨分化以促进骨组织修复。这一策略在骨生物材料的研发上取得了一定的成功，然而，同一材料在体外和体内表现出的效果往往不一致，这意味着控制材料介导干细胞成骨能力的机制尚不清楚。
3.近年来，研究表明，骨缺损的愈合并非只涉及成骨细胞再生，还与缺损部位的免疫细胞有关。在骨组织缺损处或者外源性材料植入处，会发生机体的免疫反应，大量的巨噬细胞会被募集到组织缺损处或者外源性材料植入处，从而调节免疫微环境并介导骨再生。如文献accelerated bone regeneration by gold-nanoparticle-loaded mesoporous silica through stimulating immunomodulation.hang liang等，acs appl.mater.interfaces 2019,11,41758-41769；以及文献a biomimetic hierarchical nanointerface orchestrates macrophage polarization and mesenchymal stem cell recruitment to promote endogenous bone regeneration.shan-shan jin等，acs nano 2019,13,6581-6595.介绍了刺激免疫调节加速骨再生；因此，骨免疫学揭示了免疫细胞在调节骨动力学中起的重要作用，而传统的骨缺损治疗往往忽视了免疫反应的重要性，因此，人们提出了骨免疫调节这一概念，骨免疫调节主要突出了生物材料介导的成骨过程中免疫反应的重要性，并提出新一代骨生物材料应该能同时调节局部免疫环境，这样才更有利于骨生成。
4.目前的骨免疫调节药物价格较为昂贵，且代谢较快，不能有效的调节免疫微环境并介导骨再生；骨生物材料在免疫微环境中的作用已成为组织工程研究的热点，开发骨免疫调节药物在干细胞治疗骨缺损领域受到越来越多的关注。
5.针对目前骨免疫调节药物价格较为昂贵，且代谢较快的缺陷，特提出本发明。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供一种神经酸钙纳米颗粒的制备方法及其在制备骨缺损修复材料中的应用。
7.本发明是通过如下技术方案实现的：
8.一种神经酸钙纳米颗粒的制备方法，包括步骤如下：
9.1)在超声条件下，将醋酸钙水溶液加入神经酸溶液中，得混合液，将混合液加热至30℃-90℃，持续超声30～60分钟；
10.2)反应生成的沉淀物继续在30℃-90℃下持续搅拌100～150分钟；
11.3)反应生成的沉淀物降温前，立刻用超声破碎仪超声2～10分钟，然后用超声清洗器超声30～90分钟，用乙醇和水离心洗涤，以去除未反应的原料，得到神经酸钙纳米颗粒。
12.根据本发明优选的，步骤1)中，醋酸钙水溶液的浓度为0.2mol/l～20mol/l。
13.根据本发明优选的，步骤1)中，神经酸溶液的浓度为0.5mol/l～50mol/l，溶剂为体积分数为95％的乙醇-水溶液。
14.根据本发明优选的，步骤1)中，醋酸钙水溶液与神经酸溶液混合的体积1：(2～5)。
15.根据本发明优选的，步骤1)中，加热温度为40℃-70℃，持续搅拌时间为40～50分钟。
16.根据本发明优选的，步骤1)中，超声功率为40-70w。
17.根据本发明优选的，步骤2)中，搅拌温度为40℃-70℃，持续搅拌时间为110～130分钟。
18.根据本发明优选的，步骤3)中，超声破碎仪的功率为220-260w。
19.根据本发明优选的，步骤3)中，超声清洗器的功率为40-70w。
20.本发明采用容易实现的沉淀法，并采用超声辅助，利用简易的纳米沉淀方法制得了颗粒粒径较小，分散性好，具有良好的生物相容性的神经酸钙纳米颗粒，制备过程无需高温高压，且制备周期较短，易于批量生产。
21.一种神经酸钙纳米颗粒，采用上述方法制备得到。
22.本发明制备的神经酸钙纳米颗粒粒径较小，粒径为150-200nm，具有良好的生物相容性。
23.上述神经酸钙纳米颗粒在制备骨缺损修复材料中的应用，所述的骨缺损修复材料为神经酸钙纳米颗粒。
24.本发明的神经酸钙纳米颗粒可以直接作为骨缺损修复材料。
25.根据本发明优选的，神经酸钙纳米颗粒促进间充质干细胞的成骨分化或抑制巨噬细胞向m1型极化。
26.根据本发明优选的，具体应用为，在体外，将神经酸钙纳米颗粒加入间充质干细胞分化培养基中，进行细胞培养1～7d，神经酸钙纳米颗粒加入量为0.01～100mmol/l，促进间充质干细胞的成骨分化。
27.根据本发明优选的，间充质干细胞分化培养基为含10％新生牛血清或胎牛血清，10mmol/l β-甘油磷酸钠，50mg/l抗坏血酸和10nmol/l地塞米松的α-mem培养基。
28.根据本发明优选的，具体应用为，在体外，将神经酸钙纳米颗粒加入巨噬细胞培养基中，进行细胞培养10～24h，神经酸钙纳米颗粒加入量为0.01～100mmol/l，抑制巨噬细胞向m1型极化。
29.根据本发明优选的，巨噬细胞培养基为含10％新生牛血清或胎牛血清和1％双抗的高糖dmem培养基。
30.本发明具有以下技术特点及优点：
31.1、本发明采用容易实现的沉淀法，并采用超声辅助，利用简易的纳米沉淀方法制
得了颗粒粒径较小，分散性好，具有良好的生物相容性的神经酸钙纳米颗粒，制备过程无需高温高压，且制备周期较短，易于批量生产。
32.2、本发明采用容易实现的沉淀法，并采用超声辅助成功得到了粒径为150-200nm的纳米颗粒，粒径均匀，经过活死染色，证明了本发明制得的神经酸钙纳米颗粒细胞相容性良好，可以直接用于细胞培养。
33.3、本发明制备的神经酸钙纳米颗粒可以显著促进间充质干细胞的成骨分化，可以显著抑制巨噬细胞向m1型极化。
34.4、本发明用简单的方法批量生产得到神经酸钙纳米颗粒，成本低，能有效的调节免疫微环境并介导骨再生，不仅提高了神经酸钙纳米颗粒的应用价值，同时为治疗肢体大段骨缺损提供了新的方向，对肢体大段骨缺损的治疗具有重要的临床意义。
附图说明
35.图1为实施例1制得的神经酸钙纳米颗粒的扫描电子显微镜(sem)图；
36.图2为实施例1制得的神经酸钙纳米颗粒的红外谱图；
37.图3为对比例1制得的神经酸钙纳米颗粒的扫描电子显微镜(sem)图；
38.图4为有或没有神经酸钙纳米颗粒介导的间充质干细胞的活死染色图；
39.图5为有或没有神经酸钙纳米颗粒介导的间充质干细胞成骨分化标记物bmp2的免疫荧光染色图；
40.图6为有或没有神经酸钙纳米颗粒介导的间充质干细胞成骨分化标记物opn的mrna表达水平的柱状图；
41.图7为有或没有神经酸钙纳米颗粒介导的巨噬细胞m1型标记物inos的免疫荧光染色图；
42.图8为有或没有神经酸钙纳米颗粒介导的巨噬细胞m1型标记物cox2的mrna表达水平的柱状图；
43.图9为大鼠颅骨缺损部位的微计算机断层扫描图；
44.图10为大鼠颅骨缺损部位opn和cox2的免疫组化染色图。
具体实施方式
45.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
46.同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
47.实施例中神经酸是元宝枫来源的植物神经酸，陕西亿康龙生物科技有限公司有售。
48.间充质干细胞分化培养基为含10％胎牛血清，10mmol/lβ-甘油磷酸钠，50mg/l抗坏血酸和10nmol/l地塞米松的α-mem培养基。
49.巨噬细胞培养基为含10％胎牛血清和1％双抗的高糖dmem培养基。
50.α-mem培养基、高糖dmem培养基按现有技术进行。
51.间充质干细胞来源：骨髓间充质干细胞从3周龄的wistar大鼠(雄鼠)胫骨和股骨
骨髓中分离，分离得到的mscs在添加10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基中培养到第三代。
52.raw264.7巨噬细胞来源：raw264.7巨噬细胞购买自中国科学院细胞库，在添加10％胎牛血清和1％双抗的高糖dmem中培养。
53.实施例1
54.神经酸钙纳米颗粒的制备：
55.1)将醋酸钙分散于超纯水中，搅拌均匀，配制成浓度为0.3mol/l的醋酸钙水溶液；
56.2)将神经酸溶解于乙醇-水(95％，v/v)溶液中，配置成0.6mol/l的神经酸溶液，在超声环境中，将醋酸钙水溶液加入神经酸溶液中，醋酸钙水溶液与神经酸溶液混合的体积1：2，得混合液，将混合液加热至65℃，持续超声40分钟，超声功率为45w；
57.3)反应生成的沉淀物继续在65℃下持续搅拌120分钟；
58.4)反应生成的沉淀物降温前，立刻用超声破碎仪超声5分钟，超声破碎仪的功率为230w，然后用超声清洗器超声40分钟，超声清洗器的功率为45w，然后用乙醇和水离心洗涤，以去除未反应的原料，得到神经酸钙纳米颗粒。
59.该实施例制得的神经酸钙纳米颗粒电子显微镜照片如图1所示，从图中可以看出，神经酸钙纳米颗粒呈纳米颗粒状，均匀且尺寸较小。
60.红外光谱如图2所示，本发明采用沉淀法，并采用超声辅助，成功制得了神经酸钙纳米颗粒。
61.对比例1
62.同实施例1所述的神经酸钙的制备，去掉超声条件，具体如下：
63.1)将醋酸钙分散于超纯水中，搅拌均匀，配制成浓度为0.3mol/l的醋酸钙水溶液；
64.2)将神经酸溶解于乙醇-水(95％，v/v)溶液中，配置成0.6mol/l的神经酸溶液，将醋酸钙水溶液加入神经酸溶液中，醋酸钙水溶液与神经酸溶液混合的体积1：2，得混合液，将混合液加热至65℃保持40分钟；
65.3)反应生成的沉淀物继续在65℃下保持120分钟；
66.4)反应生成的沉淀物用乙醇和水离心洗涤，以去除未反应的原料，得到神经酸钙。
67.该对比例制得的神经酸钙纳米颗粒电子显微镜照片如图3所示，从图中可以看出，神经酸钙呈块状，而不是纳米颗粒状。
68.实施例2
69.同实施例1所述的神经酸钙纳米颗粒的制备，不同之处在于：
70.醋酸钙水溶液的浓度为1mol/l；神经酸溶液的浓度为5mol/l，醋酸钙水溶液与神经酸溶液混合的体积1：2。其他条件和参数按实施例1进行。
71.实施例3
72.同实施例1所述的神经酸钙纳米颗粒的制备，不同之处在于：
73.醋酸钙水溶液的浓度为5mol/l；神经酸溶液的浓度为10mol/l，醋酸钙水溶液与神经酸溶液混合的体积1：2。其他条件和参数按实施例1进行。
74.实施例4
75.同实施例1所述的神经酸钙纳米颗粒的制备，不同之处在于：
76.醋酸钙水溶液的浓度为5mol/l；神经酸溶液的浓度为10mol/l，醋酸钙水溶液与神
经酸溶液混合的体积1：4。其他条件和参数按实施例1进行。
77.实施例5
78.同实施例1所述的神经酸钙纳米颗粒的制备，不同之处在于：
79.步骤2)中，持续超声时间为40分钟，超声功率为55w，其他条件和参数按实施例1进行。
80.实施例6
81.同实施例1所述的神经酸钙纳米颗粒的制备，不同之处在于：
82.步骤4)中，反应生成的沉淀物降温前，立刻用超声破碎仪超声5分钟，超声破碎仪的功率为250w，然后用超声清洗器超声40分钟，超声清洗器的功率为60w。
83.实验例
84.将实施例1制备的神经酸钙纳米颗粒用于培养间充质干细胞和巨噬细胞，验证其促进干细胞成骨分化和调控巨噬细胞极化的能力，并且将材料用于大鼠颅骨缺损模型，进行体内效果的验证。
85.实验例1
86.用于促进间充质干细胞的成骨分化，步骤如下：
87.1)将实施例1的神经酸钙纳米颗粒分散在75％酒精中，浸泡2小时，同时在无菌操作台中用紫外灯照射12小时，进行灭菌消毒，将材料分散在无菌超纯水中备用；
88.2)将间充质干细胞用胰酶消化后，用α-mem培养基分散得到细胞悬液，将间充质干细胞接种在12孔板中，每孔接种的细胞悬液为1ml,包含的细胞个数为2
×
104个；
89.3)将孔板置于37℃含5％co2的饱和湿度环境下体外贴壁培养24小时，吸出培养基，然后每孔加入1ml间充质干细胞分化培养基；
90.4)向孔板中加入神经酸钙纳米颗粒，神经酸钙纳米颗粒加入量为0.05mmol/l，将细胞置于37℃含5％co2的饱和湿度环境下体外培养1-7天，每两天更换一次培养基，并在相同实验条件下设置不加神经酸钙纳米颗粒的细胞培养板组为对照组。
91.将上述培养3天的间充质干细胞进行活死染色，染色结果如图4所示，通过图4可以看出，有很少的死细胞，说明神经酸钙纳米颗粒细胞相容性良好。将上述培养7天的间充质干细胞进行免疫荧光染色，结果如图5所示，显示用神经酸钙纳米颗粒培养的间充质干细胞表达的成骨细胞标记物bmp2与对照组相比明显提高。将上述培养7天的间充质干细胞进行基因检测，检测成骨细胞标记物opn的mrna表达水平，结果如图6所示，发现用神经酸钙纳米颗粒培养的间充质干细胞的mrna表达水平与对照组相比明显提高，大概提高了6倍，说明神经酸钙纳米颗粒可以显著促进间充质干细胞的成骨分化。
92.实验例2用于调控巨噬细胞的极化，步骤如下：
93.1)将实施例1的神经酸钙纳米颗粒分散在75％酒精中，浸泡2小时，同时在无菌操作台中用紫外灯照射12小时，进行灭菌消毒，将材料分散在无菌超纯水中备用；
94.2)将raw264.7巨噬细胞在高糖dmem培养基中分散，得到细胞悬液，将细胞接种在12孔板中，每孔接种的细胞悬液为1ml,包含的细胞个数为1
×
105个；
95.3)将孔板置于37℃含5％co2的饱和湿度环境下体外贴壁培养6小时，吸出培养基，每孔加入1ml巨噬细胞培养基；
96.4)将细胞置于37℃含5％co2的饱和湿度环境下体外培养两个小时后，加入神经酸
钙纳米颗粒，神经酸钙纳米颗粒加入量为0.05mmol/l，体外培养12小时，并在相同实验条件下设置不加神经酸钙纳米颗粒的lps组为对照组。
97.将上述raw264.7进行免疫荧光染色，结果如图7所示，显示用神经酸钙纳米颗粒培养的细胞表达的m1型巨噬细胞标记物inos与对照组相比明显降低。将上述raw264.7进行基因检测，检测m1型巨噬细胞标记物cox2的mrna表达水平，结果如图8所示，发现利用神经酸钙纳米颗粒培养的raw264.7细胞的cox2的mrna表达水平与只加了lps的对照组相比有显著降低，降低了84.6％，说明这种神经酸钙纳米颗粒可以显著抑制巨噬细胞向m1型极化。
98.实验例3用于大鼠颅骨缺损的修复，步骤如下：
99.1)将间充质干细胞胰酶消化后，用α-mem培养基分散得到细胞悬液，将间充质干细胞接种在12孔板中，每孔接种的细胞悬液为1ml,包含的细胞个数为2
×
104个；
100.2)将孔板置于37℃含5％co2的饱和湿度环境下体外培养24小时，吸出原培养基，每孔加入1ml的间充质干细胞分化培养基；
101.3)向孔板中加入0.05mm神经酸钙纳米颗粒，将细胞置于37℃含5％co2的饱和湿度环境下体外培养24小时；
102.4)将用神经酸钙纳米颗粒培养的间充质干细胞和0.25mm的神经酸钙纳米颗粒与100μl基质胶混合，注射到老鼠的颅骨缺损部位，此组称为一组，并将在颅骨缺损处注射100μl基质胶的大鼠作为对照组，称为二组。
103.利用微计算机断层扫描技术和免疫组化染色技术对上述两组的颅骨进行扫描，结果如图9所示，发现一组大鼠的颅骨缺损有明显的愈合现象，而对照组中的骨缺损处基本没有新骨生成，此外，如图10所示，一组中颅骨缺损处成骨因子opn的分泌明显高于二组，炎症因子cox2的分泌低于二组，体内实验证明了神经酸钙纳米颗粒优异的体内骨修复效果。
104.综上本发明制备的神经酸钙纳米颗粒可以显著促进间充质干细胞的成骨分化，可以显著抑制巨噬细胞向m1型极化，能有效的调节免疫微环境并介导骨再生，对骨缺损的治疗具有重要的临床意义。