一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用

1.本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒近年来肆虐全球，为全世界人民的健康、经济等带来沉重打击，虽然针对新型冠状病毒的疫苗研发响应较快、成果较好，但由于新型冠状病毒的突变率高、潜伏期长等特点，造成了病毒逃逸的现状，事实上也因此造成了世界各地均有新冠疫情的散发状况。然而，目前并没有针对新型冠状病毒感染的特效药物，所以针对新型冠状病毒的药物研发迫在眉睫。
3.新型冠状病毒包膜蛋白(e蛋白)是新型冠状病毒的结构蛋白之一，具有帮助病毒出芽的作用。除此之外，e蛋白还被报道具有诱导宿主细胞产生炎性因子风暴的作用，进而加剧病人的临床症状。由于e蛋白在病毒复制和致病性两方面都有如此重要的作用，因此e蛋白作为药物的设计靶点是十分理想的。
4.不仅如此，本发明在前期研究中发现人体内rnf5蛋白作为e3泛素连接酶，具有通过对e蛋白进行多聚泛素化，进而诱导e蛋白降解的作用，最终达到抑制新型冠状病毒复制的效果。进一步研究显示，rnf5靶向e蛋白的63位赖氨酸，进行多聚泛素化。而e蛋白的63位赖氨酸被报道是高度保守，并具有劫持宿主抗病毒因子brd4作用的。因此，e蛋白的63位赖氨酸一旦发生突变，则会极大的影响病毒在宿主中的复制环境。而该位点不发生突变，则会被本发明所发现的e3泛素连接酶——rnf5靶向，并被降解。因此，上调rnf5的表达量或上调其功能活性将成为抑制新型冠状病毒的有效治疗手段。
5.因此，针对以上现状，迫切需要开发一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用，以克服当前实际应用中的不足。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用，旨在解决上述背景中提到的问题。
7.本发明是这样实现的，一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用，所述小分子化合物选自化合物analog-1及其类似物和/或衍生物，其应用包括制备抗病毒产品、制备抑制病毒产品和制备预防病毒感染产品中的一种或多种组合；
8.所述化合物analog-1的化学结构式如下式所示：
[0009][0010]
进一步的技术方案，所述病毒为新型冠状病毒(sars-cov-2)，新型冠状包括但不限于wuhan-hu-1毒株(genbank：mn908947.3)，或与该毒株中e蛋白具有95％以上相似度的新型冠状病毒。
[0011]
进一步的技术方案，所述抑制病毒产品用于抑制新型冠状病毒复制。
[0012]
进一步的技术方案，所述产品为试剂盒、食品、保健品和药品中的一种或多种组合，所述产品中analog-1的含量不低于10μmol/l或1.5mg/kg。
[0013]
进一步的技术方案，所述试剂盒为包含analog-1及其类似物和/或衍生物成分的试剂，以及含有analog-1及其类似物和/或衍生物成分并配合其他试剂组成整套的试剂盒。
[0014]
进一步的技术方案，所述食品为包含analog-1及其类似物和/或衍生物成分的可食用物品。
[0015]
进一步的技术方案，所述保健品为包含analog-1及其类似物和/或衍生物成分的具有预防或保健作用的食品。
[0016]
进一步的技术方案，所述药品为包含analog-1及其类似物和/或衍生物成分的药物制剂。
[0017]
进一步的技术方案，所述的药物制剂剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、分散剂、注射剂和喷雾剂中的一种或多种组合。
[0018]
本发明提供的一种小分子化合物在抗病毒感染中的应用，通过揭示人rn f5蛋白降解新型冠状病毒包膜蛋白(e蛋白)的作用，进而明确了rnf5激活剂——analog-1具有抑制新型冠状病毒(sars-cov-2)的作用。进一步的体内攻毒实验表明，analog-1能够降解小鼠肺部病毒e蛋白水平，降低病毒在小鼠体内的复制，减轻小鼠肺组织病变，增加小鼠体重至未攻毒水平，全面改善小鼠面对新冠病毒感染所带来的病理改变，将对于新冠病毒(sars-cov-2)感染的临床治疗与预防具有巨大意义和应用价值。
附图说明
[0019]
图1为analog-1促进新型冠状病毒包膜蛋白(e蛋白)降解的示意图。
[0020]
图2为analog-1抑制新型冠状病毒在细胞水平复制的示意图。
[0021]
图3为analog-1抑制新型冠状病毒在小鼠体内复制的示意图。
[0022]
图4为analog-1减轻小鼠肺部由病毒感染造成损伤的示意图。
[0023]
图5为analog-1恢复小鼠由病毒感染造成的体重减轻的示意图。
具体实施方式
[0024]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对
本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0025]
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
[0026]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028]
实施材料：本发明实施例中所列的材料和耗材如无特殊指明均可从市售渠道获得，细胞与病毒来自于atcc或其他相关机构的细胞与微生物资源库，质粒载体来自于addgene、独立构建或学术材料交流。
[0029]
下述实验方法为标准的分子生物学、细胞生物学或病毒学等操作程序，领域内的研究人员可以方便的理解和操作。
[0030]
一、化合物analog-1促进新型冠状病毒包膜蛋白(e蛋白)降解作用的检测
[0031]
由于analog-1具有激活rnf5活性的作用，并且本发明前期结果证明了rnf5具有降解新型冠状病毒包膜蛋白(e蛋白)的活性。因此，本发明分别在正常的293t细胞和敲低rnf5的细胞系中鉴定了analog-1对e蛋白降解作用的影响。具体操作方法如下：
[0032]
步骤一、正常的hek293t细胞(来自于atcc，#crl-11268)和稳定敲低rnf5的hek293t细胞(本发明自己构建)被分别计数，并种于24孔板中(2*105个/孔，每种细胞各种4个孔)；
[0033]
步骤二、次日，利用opti-mem(gibco，货号：31985-070)和pei(polyscience，货号：23966)，对e-ha表达质粒(带有ha标签的新冠病毒e蛋白，由发明者构建)进行转染实验(转染比例：质粒：pei＝1:3)，转染完成后4小时，对转染过的细胞进行换液(含有10％胎牛血清的dmem培养基)处理；
[0034]
步骤三、转染24小时后，更换培养基为含有不同analog-1的培养基；
[0035]
步骤四、继续培养24小时，收取细胞，通过免疫印迹法进行验证。
[0036]
免疫印迹实验中采用了ha标签抗体(invitrogen，货号：715500)，rnf5抗体(生工，货号：d262128)，tubulin抗体(锐抗，货号：rm2003)，辣根过氧化物酶偶联的鼠二抗(jackson，货号：115-035-062)和兔二抗(jackson，货号：115-035-062)，以及ecl显色底物(millipore，货号：wbkls0050)。
[0037]
结果如图1所示，在未敲低rnf5的hek293t细胞中(plko.1)，e蛋白的含量随着analog-1的增加而减少，并呈现出反向趋势。而在敲低了rnf5的hek293t细胞中(sh-rnf5)，e蛋白的含量并未发生改变。
[0038]
上述结果表明化合物analog-1具有下调新冠病毒e蛋白的活性，而此活性是依赖于rnf5的。
[0039]
二、化合物analog-1抑制新型冠状病毒在caco2细胞中感染作用的检测
[0040]
根据以往研究显示，caco2细胞表面表达新型冠状病毒受体(ace2)，是新冠病毒的天然靶细胞系。因此，本发明在此细胞中鉴定了化合物analog-1对新型冠状病毒的抑制作用。具体操作如下：
[0041]
步骤一、正常的caco2细胞(来自于atcc，htb-37)和被敲除rnf5的caco2细胞(本发明自己构建)被分别计数，并种于12孔板中(4*105个/孔，每种细胞各种4个孔)，与此同时，在细胞培养基中分别加入不同浓度的化合物analog-1；
[0042]
步骤二、次日，进行moi为0.1的新型冠状病毒的感染，感染2小时后，对细胞进行换液处理(更换为含有10％胎牛血清的dmem培养基)；
[0043]
步骤三、感染48小时后收取细胞上清液，利用trizol(absin，货号：abs60154)提取rna，并利用反转录试剂盒(roche，货号：4896866001)进行反转录操作，得到新型冠状病毒的cdna。
[0044]
上述感染病毒实验均在p3实验室操作。
[0045]
接下来，以cdna为模板，利用sybr green(roche，货号：491314001)和特异性引物(f：5
’‑
ggggaacttctcctgctagaat-3’和r:5
’‑
cagacattttgctctcaagctg-3’)以及roche 480实时定量pcr仪进行了新型冠状病毒的含量检测。
[0046]
实验结果如图2所示，10μm的化合物analog-1即可抑制病毒至未加药组的1/4左右，而20μm和40μm已经将病毒复制抑制了数十倍。然而，在rnf5敲除的细胞系中，analog-1依然失去了抗病毒作用。
[0047]
上述实验结果显示，analog-1在细胞水平具有抑制病毒复制的作用。
[0048]
三、化合物analog-1抑制新型冠状病毒在小鼠模型中感染作用的检测
[0049]
为了进一步鉴定化合物analog-1在体内抑制新型冠状病毒的作用，我们选择了balb/c小鼠模型进行测试。具体操作如下：
[0050]
步骤一、购买6周龄balb/c雌性小鼠48只(维通利华)，随机分成三组，每组16只小鼠；
[0051]
步骤二、对小鼠进行尾静脉注射给药(药物溶剂为含有8％dmso的生理盐水，药物为化合物analog-1)，给药剂量分别为0mg/kg，1.5mg/kg和3.0mg/kg；隔一天给药一次，共计给药7次，即2周；
[0052]
步骤三、将上述每组小鼠都平均分成两组，一组进行新型冠状病毒的攻毒(攻毒剂量：病毒滴度为1*10
5.5
tcid50/ml，30μl)，对照组采用培养基进行对照；攻毒期间，每日测量小鼠体重，观察小鼠症状，并记录。
[0053]
步骤四、攻毒7天后，取小鼠的肺组织和脾组织，并分别利用病毒rna提取试剂盒(qiagen，货号：52904)提取组织中病毒rna，利用rt-qpcr方法分析组织中病毒载量；制备病理样本(将组织浸泡于4％多聚甲醛24小时)、rna提取样本(将组织匀浆后，加入trizol)和免疫印迹样本(将组织匀浆后加入5*上样缓冲液，并用沸水浴煮样20分钟)。
[0054]
上述攻毒实验及样本采集工作均在p3实验中操作。
[0055]
通过检测不同组小鼠肺组织中的病毒载量，本发明发现1.5mg/kg的化合物analog-1能够将小鼠肺组织中病毒复制抑制到不加药组的1/5左右，而3.0mg/kg的化合物analog-1则能够将小鼠肺组织中病毒复制抑制到不加药组的1/10左右(如图3所示)。
[0056]
而病理检测中，我们也不难发现，无药物保护作用的小鼠肺泡已经出现坍塌，而有化合物analog-1保护的小鼠肺泡组织依然完整(如图4所示)。
[0057]
通过对小鼠体重的统计，我们也可以发现，给药组的小鼠在攻毒5天后发生转折，体重开始增长，在第7天恢复到与未感染病毒的小鼠相同的水平，而未经化合物analog-1保护的小鼠体重则持续下降(如图5所示)。
[0058]
上述实验结果均说明了化合物analog-1在小鼠模型中能够抑制新型冠状病毒的复制，达到保护小鼠的作用，且没有对小鼠产生可观测的副作用影响。
[0059]
本发明通过揭示人rnf5蛋白降解新型冠状病毒包膜蛋白(e蛋白)的作用，进而明确了rnf5激活剂——analog-1具有抑制新型冠状病毒(sars-cov-2)的作用。
[0060]
进一步的体内攻毒实验表明，analog-1能够降解小鼠肺部病毒e蛋白水平，降低病毒在小鼠体内的复制，减轻小鼠肺组织病变，增加小鼠体重至未攻毒水平，全面改善小鼠面对新冠病毒感染所带来的病理改变。
[0061]
本发明通过analog-1能够提高人rnf5的活性，进而增强人体对新型冠状病毒包膜蛋白(e蛋白)的降解作用，将对于新冠病毒(sars-cov-2)感染的临床治疗与预防具有巨大意义和应用价值。
[0062]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0063]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。