一种切片用小鼠肠组织蜡块的制备方法

一种切片用小鼠肠组织蜡块的制备方法
1.技术领域：本发明涉及病理学检验技术领域，具体地说就是一种切片用小鼠肠组织蜡块的制备方法。
2.

背景技术：
小鼠肠道疾病模型是在人为致病因素（物理、化学和生物因素）作用下，在体模拟人类肠道疾病，为研究疾病的预防和治疗提供理论依据。在模型可靠的基础上，相应的组织学切片对于检测和观察肠管组织的病理学改变具有重要意义。相对于组织学而言，肠管可分为黏膜层、黏膜肌层、黏膜下层、肌层和浆膜层。黏膜下层富含血管、淋巴管和神经网，而这些组织构成也是研究肠道疾病的新兴热点。因此，完整的肠组织镜下呈像对观察肠道疾病的发生和发展至关重要。
3.然而，目前的小鼠肠管切片技术普遍存在如图1所示的肌层z和黏膜层x分离之间产生间隙y，黏膜肌层缺损等问题，这不仅不利于对标本肠管进行整体的组织学分析，也阻碍了进一步发现黏膜下层可能存在的未知病理学改变。
4.

技术实现要素：
本发明就是为了克服现有技术中的不足，提供一种切片用小鼠肠组织蜡块的制备方法。
5.本技术提供以下技术方案：一种切片用小鼠肠组织蜡块的制备方法，它包括以下步骤：步骤a肠管组织的取检，其特征在于：步骤b肠管组织的固定，步骤c肠管组织的脱水，步骤d肠管组织的包埋；步骤b包括：（1)取出包埋盒，在包埋盒底部预先铺垫第一滤纸层；在第一滤纸层上铺垫至少两层同样尺寸的第一无纺布层，将肠管沿正中剖开，将肠管组织转移至无纺布正中位置上；将肠管组织压平且铺展成长方形并固定；（2）在平铺好的肠管组织上覆盖至少两层同样尺寸的第二无纺布层，再在第二无纺布层上方覆盖第二滤纸层，而后用食指摁压滤纸至压平管肠管组织，从而形成肠组织夹层；(3)对肠管夹层四周进行装订；将装订好的肠管夹层放入组织包埋盒中；在其上方覆盖防压层，而后盖上包埋盒，防压层在包埋盒盒盖的挤压向发生一定形变从而压住下方的肠组织夹层，避免其在包埋盒内移动；(4)使用流水对冲洗包埋盒（17-25） min；步骤c包括将包埋盒放入组织脱水机内进行脱水；步骤d包括在包埋模具内注入蜡水，而后打开包埋盒取出完成脱水的肠组织夹层，打开无纺布取出肠组织，将肠组织放入蜡水中反复冲洗至表面物明显气泡，将肠组织纵面置于包埋模具使其与包埋模具底面垂直，将模具移至冷冻台面上，待模具底部蜡水凝固时，在模具中继续加入蜡水直至充满模具，而后将包埋盒底座倒扣在即将凝固的蜡块上，待蜡块完全凝固后，手持包埋盒底座将蜡块从包埋模具内取出，即得到切片用的蜡块。
6.在上述技术方案的基础上，还可以有以下进一步的技术方案：在所述步骤b中，第一滤纸层上覆盖有三层无纺布，在肠管组织上覆盖有三层无纺布。
7.在所述步骤b中，使用订书机对肠组织夹层进行厚度方向的装订，订书针位置需距离组织边缘处6-10mm。
8.在所述步骤c中的组织脱水机中缸组中，第1-7缸内放置乙醇，第8和9缸内放置二甲苯，第10-12缸内放置切片石蜡。
9.所述第1缸内的乙醇浓度为50%，第2缸内的乙醇浓度为70%，第3缸内的乙醇浓度为80%，第4缸乙醇浓度为95%，第5-7缸内的乙醇浓度为100%。
10.所述包埋盒在所述第1缸内的脱水时间为12h，在所述第2缸内的脱水时间为4 h，在所述第3和4缸内脱水时间为6 h，所述第5-7缸内脱水时间为20min，在所述第8和9缸内脱水时间为10min，在所述第10缸内脱水时间为1 h30 min，在所述11和12缸内脱水时间为1 h，所述包埋盒在组织脱水机内总脱水时间为32 h50 min。
11.发明优点：本发明步骤简单，操作方便，包埋后的肠管组织可以在后续的切片时保持形态学完整，大幅降低了小鼠肠管肌层和黏膜层分离的发生率；完整呈现黏膜下层的结缔组织形态，便于科研工作者对蜡块进行切片后全面观察，为肠道疾病的理论研究提供可靠素材。
12.附图说明：图1是采用现有技术小鼠肠组织蜡块切片后，在显微镜下肌层和黏膜层分离的成像图图中a为结肠成像，b为直肠成像；图2是完成步骤b后的结构示意图；图3是步骤d中蜡块完全凝固后的示意图；图4是完成步骤d后的示意图；图5是采用本发明制备得到的蜡块进行切片后在显微镜下的成像图，图中a为结肠成像，b为直肠成像；图6是采用本发明制备的蜡块和采用常规手段制备的蜡块切片后合格率的对比示意图。
13.具体实施方式：如图2-6所示，一种切片用小鼠肠组织蜡块的制备方法，它包括以下步骤：步骤a肠管组织的取检，该步骤包括，(1)脱颈处死小鼠，于胸骨角下方约2 cm处剪开肌肉；沿中轴线上下扩大刀口以暴露全部肠管。
14.(2)分别于胃幽门口处剪断肠管，肛门上方1-2 cm处剪断耻骨联合。
15.(3)取出整段肠管，剔除肠壁附着的腺体和肠系膜脂肪等。
16.(4)生理盐水冲洗肠管，将肠管按空肠、回肠、结肠和直肠段分类，各分类并裁剪成1 cm长度的肠管组织，置于福尔马林中固定12-16h。
17.步骤b肠管组织的固定, 该步骤包括，(1)取出包埋盒1，在包埋盒底部预先铺垫一层第一滤纸层2（比包埋盒尺寸略小）；再于滤纸上铺垫三层同样尺寸的第一无纺布层3。
18.从福尔马林内取出一段肠管组织4，放在最上层的第一无纺布层3上，而后使用手
术剪刀将肠管组织沿正中剖开，注意避免损伤肠管组织。将肠管组织转移至无纺布正中位置上；并使用镊子的两个夹臂分别压住肠管组织的两端端部，使得肠管组织成铺展成长方形平铺在最上层的第一无纺布层表面。
19.（2）在平铺好的肠管组织4上覆盖三层同样尺寸的第二无纺布层5，再在第二无纺布5层上方覆盖第二滤纸层6，而后用食指摁压滤纸代替镊子压平肠管后，将镊子从无纺布中抽出，从而形成肠组织夹层。
20.(3) 使用镊子夹取制作好的肠组织夹层，需注意要夹住肠管组织4所在部位，以防肠管组织4回弹回圆柱状。使用订书机对肠组织夹层四周进行装订；订书针7位置需距离肠管组织4边缘处约8 mm，因为距离肠管组织4过近会挤压肠管组织4的绒毛形态，过远则会使肠管组织4回弹回圆柱状。
21.将装订好的肠管夹层放入组织塑料制成的包埋盒1中；在其上方覆盖防压层8，所述的防压层8为橡胶或pvc材质，而后盖上包埋盒，防压层7在包埋盒盒盖1a的挤压向发生一定形变从而压住下方的肠组织夹层，避免其在包埋盒1内移动.由于无纺布不易与肠组织黏连，又具有透水和透气性，可在脱水过程中保护肠组织的同时，是肠组织与脱水试剂充分接触。只覆盖一层无纺布时，试验发现不能使肠管保持平铺的状态（肠管易卷曲）；覆盖两层时发现只有部分肠管保持平铺的状态，效果不够稳定；因此采用，覆盖三层时才发现基本所有肠都能管保持平铺的状态(4)使用流水对冲洗包埋盒20 min；步骤c包括将包埋盒放入组织脱水机内进行脱水，整个脱水过程为：包埋盒在所述第1缸内的脱水时间为12h，第1缸内的乙醇浓度为50%。在所述第2缸内的脱水时间为4 h，第2缸内的乙醇浓度为70%。在所述第3和4缸内脱水时间为6 h，第3缸内的乙醇浓度为80%，第4缸乙醇浓度为95%。所述第5-7缸内脱水时间为20min，第5-7缸内的乙醇浓度为100%。
22.所述第8和9缸内脱水时间为10min，第8和9缸内放置二甲苯。在所述第10缸内脱水时间为1 h30 min，在所述11和12缸内脱水时间为1 h，第10-12缸内放置切片石蜡，所述包埋盒在组织脱水机内总脱水时间为32 h50 min。
23.步骤d包括包埋模具9内注入少量的蜡水以便将包埋模具9底面覆盖上蜡水，而后打开包埋盒1取出完成脱水的肠组织夹层，打开第一、二无纺布层，使用镊子取出肠管组织4，将肠管组织4放入蜡水中反复冲洗至表面物明显气泡， 将肠管组织4纵面置至于包埋模具9内使其与包埋模具9的底面相垂直的状态，将包埋模具9移至冷冻台面上，待包埋模具9底部蜡水凝固后，在包埋模具9中继续加入蜡水直至充满模具，而后去除包埋盒1的上盖将底座的底面放在即将凝固的蜡块10上，待蜡块完全凝固后，手持包埋盒1的底座将蜡块从包埋模具9内取出，即得到切片用的蜡块10，这时包埋盒1的底座位于蜡块10下方能起到支架的作用。切片后的肠管组织在显微镜下肌层z和黏膜层x贴合紧密之间没有间隙y产生。
24.如图6所示，为证明本专利提供的一种切片用小鼠肠组织蜡块的制备方法的可靠性，我们进行了同质标本的对比实验。a组采用常规脱水包埋方法，b组采用本技术提供的制备方法，切片（5 μm）和h＆e染色处理后，统一在显微镜镜下拍照（
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200倍），测量肌层不分离长度，并计算不分离长度占该肠管总长度的百分率，肌层不分离长度比率≥80%认定为合格切片。
25.通过图6可见本技术提供的一种切片用小鼠肠组织蜡块的制备方法相对于常规方
法有着显著的进步。