一种色氨酸修饰的富勒烯纳米材料、其制备方法及在神经修复领域的应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种色氨酸修饰的富勒烯纳米材料、其制备方法及在神经修复领域的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.脑卒中是全球第二大死亡原因，每年约有550万人因脑卒中死亡，它具有高发病率，高死亡率，高致残率的特点。临床上缺血性卒中的发病率远高于出血性脑卒中，约占脑卒中总数的80％。近年来，脑卒中已经逐渐成为导致我国居民致残、致死的首位原因，中老年发病率居高不下，除此之外，脑卒中年轻化的趋势也愈发明显。目前临床上规定的有效治疗窗时间为脑缺血发作后的4h内。美国食品药品监督管理局(fda)唯一批准上市用于治疗脑卒中的药物就是组织纤溶酶原激活剂，这是一种溶栓药物，但这种药物的使用条件有限，也无法减轻缺血性中风引起的神经功能缺损。
4.神经干细胞(neural stem cells,nsc)是一种能够自我更新的多能细胞，可分化成多种神经元谱系的细胞：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。成年神经干细胞可以被多种刺激物和疾病损伤过程激活，通过神经发生进行增殖和分化，以替代一些丢失或受损的神经细胞。目前研究表明，成年哺乳动物的神经发生主要存在于两个区域：室管膜下区(svz)和海马齿状回区域(dg)。内源性神经干细胞的增殖、迁移、分化完全模拟胚胎时期神经系统的发育过程，而且内源性神经干细胞修复受损神经也不存在组织相容性问题，因此利用内源性神经发生的治疗策略可能是治疗神经疾病的理想选择。此外，以往的研究表明，内源性神经干细胞往往迁移到梗死区，易于分化为星形胶质细胞以促进胶质瘢痕组织的形成，但这种分化方向无法产生修复受损大脑所必需的神经元。因此，如何有效的保护脑卒中后损伤部分的神经元，促进svz区神经干细胞增殖以及向神经元的定向分化对于治疗脑卒中有非常重要的意义。
5.富勒烯是一种碳基纳米颗粒，是碳原子的第三种同素异形体。富勒烯由于其独特的物理结构使得富勒烯本身具有很强的清除超氧阴离子和羟基自由基的能力。多数中枢神经系统疾病，如阿尔兹海默症，脑卒中等，在发病过程中均伴随着体内氧化水平失衡，自由基过多进而破坏dna，引起细胞膜不饱和脂肪酸的过氧化，破坏细胞完整性，进而加重病情。因此，将富勒烯衍生物应用于脑卒中，利用富勒烯衍生物的抗氧化能力和穿过血脑屏障的能力，可能会给脑卒中等疾病带来新的治疗策略，但富勒烯不溶于水的特性限制了其在生物医学中的应用。


技术实现要素：

6.针对目前的研究现状，发明人发现，目前已发表的多数文献中使用的富勒烯衍生物多是通过羟基或羧基修饰来改善富勒烯的水溶性。本发明联想到采用活性基团对富勒烯进行修饰，色氨酸是一种必需氨基酸，能够稳定情绪，促进睡眠，与此同时，色氨酸还可以促进体内血清素的产生，能够有效减少焦虑和抑郁。此外，本发明提供了一种全新的氨基酸修饰的富勒烯纳米材料的制备工艺，摒弃以往传统的制备路线，去除了制备过程中需要用到的氢氧化钠和具有毒性的四丁基氢氧化铵，得到了一种全新的毒性更低，生物相容性更高的富勒烯衍生物-色氨酸修饰的富勒烯。经验证，修饰后的新型纳米材料能够促进体外培养的神经干细胞增殖，诱导神经干细胞分化成为神经元细胞，同时也可以促进体内神经干细胞的发生和分化，在神经发生和修复领域有望获得广泛的应用。
7.基于上述阐述，本发明提供以下技术方案
8.本发明第一方面，提供一种色氨酸修饰的富勒烯纳米材料，所述纳米材料的分子式如下：c
60
(c
10h10
n2coo-)
10.01h 10.01
·
2.44h2o；结构式如下：
[0009][0010]
由于富勒烯纳米粒子在生物环境中不溶，因此必须对其进行修饰，使其成为水溶性物质才可以应用于生物医药领域。根据现有技术的报道，富勒烯衍生物对于缺血性脑损伤具有保护作用，由于色氨酸本身具有特殊的生理活性，本发明联想到采用色氨酸修饰富勒烯，有望实现水溶性和生理活性的共同提升。通过体外测量神经干细胞数量和体外cck-8实验，证明了色氨酸修饰的富勒烯不仅不会降低神经干细胞活性，还促进神经干细胞活性增加，并且随着浓度逐渐升高，干细胞活性也明显增加，从而证明它对神经干细胞没有毒性。体外实验显示，通过brdu/nestin免疫荧光染色发现色氨酸修饰的富勒烯可以促进神经干细胞增殖，并随着富勒烯浓度的升高，brdu/nestin阳性细胞所占比例也会增加。通过map2/gfap免疫荧光染色发现色氨酸修饰的富勒烯促进神经干细胞向神经元方向分化，并减少星形胶质细胞的生成。
[0011]
本发明第二方面，提供第一方面所述色氨酸修饰的富勒烯纳米材料的制备方法，所述制备方法如下：将色氨酸加入富勒烯溶液中，加热反应得到所述色氨酸修饰的富勒烯纳米材料。
[0012]
本发明第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述色氨酸修饰的富勒烯纳米材料。
[0013]
本发明第四方面，提供第一方面所述色氨酸修饰的富勒烯纳米材料和/或司三方面所述的药物组合物在神经修复领域的应用。
[0014]
本领域公知，神经干细胞具有自我更新能力，即可分化为成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。目前如何促进神经干细胞大量增殖，如何定向诱导神经干细胞分化仍然是干细胞研究领域的热点和难点问题。依据本发明的研究，色氨酸修饰的富勒烯促进神经干细胞向神经元方向分化，并减少星形胶质细胞的生成。这一发现意味着，色氨酸修饰的富勒烯一方面可以通过增加神经元细胞的数量，帮助补充神经损伤及神经退行性疾病中缺失的神经元细胞，另一方面，还能够减少病灶部位星形胶质细胞的数量，减少脑损伤带来的瘢痕组织的效果。基于该效果，本领域技术人员不难想象将其应用于治疗神经细胞受损引发的疾病。
[0015]
本发明通过大鼠脑缺血再灌注mcao模型发现色氨酸修饰的富勒烯可以显著促进svz区域的神经干细胞增殖，并使其向缺血半影区进行迁移。除此之外，色氨酸修饰的富勒烯还可以促进缺血大鼠半影区新增殖的神经干细胞向神经元分化。此外，色氨酸修饰的富勒烯还提高大鼠的神经功能并减少缺血半影区凋亡细胞的数量，从而起到神经保护的作用。
[0016]
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
[0017]
1、本发明首次使用色氨酸作为修饰基团，给富勒烯携带新的小分子药物或基团提供了新思路。
[0018]
2、富勒烯衍生物是否能促进神经干细胞的增殖和分化，并对糖氧剥夺导致的神经干细胞损伤是否具有保护作用等问题，目前还没有相关研究报道。而本次实验证明了上述问题，对神经保护及促进神经再生和神经干细胞的分化的研究有非常重要的意义。
[0019]
3、本发明为缺血性脑卒中等中枢神经系统疾病的治疗提供新思路：本发明通过体内实验进一步证实，在脑缺血损伤的大鼠中，此富勒烯衍生物可以促进svz脑区神经干细胞增殖并在缺血半影区促进其向神经元方向的分化。基于此，可以进一步设计相关的色氨酸修饰的富勒烯药物，促进脑内源性的神经干细胞增殖且向神经元方向分化并迁移到损伤区域，从而达到运用干细胞疗法治疗脑卒中等中枢神经系统疾病的目的。
附图说明
[0020]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0021]
图1为实施例1中所述色氨酸修饰的富勒烯水溶液照片。
[0022]
图2为实施例1中所述色氨酸修饰的富勒烯化学表征图。
[0023]
图3为实施例2中所述色氨酸修饰的富勒烯对神经干细胞的影响；其中，图3a为色氨酸修饰的富勒烯对神经干细胞的cck-8统计结果；图3b为色氨酸修饰的富勒烯对神经干细胞的ogd结果。
[0024]
图4为实施例2中所述色氨酸修饰的富勒烯对神经干细胞增殖的作用结果图；其中，图4a为神经干细胞的brdu/nestin免疫荧光染色图；图4b为brdu阳性细胞数量统计结果。
[0025]
图5为实施例2中所述色氨酸修饰的富勒烯对神经干细胞分化的作用结果图；其中，图5a为神经干细胞分化为星形胶质细胞和成熟神经元的免疫荧光染色图；图5b为星形胶质细胞和神经元所占比例的统计图。
[0026]
图6为实施例3中所述色氨酸修饰的富勒烯对大鼠svz区神经干细胞增殖的作用结果图；其中，图6a为svz区神经干细胞的dcx免疫荧光染色图；
[0027]
图6b为dcx阳性细胞数量统计结果。
[0028]
图7为实施例3中所述色氨酸修饰的富勒烯对大鼠半影区神经干细胞分化的作用结果图；其中，图7a为半影区神经干细胞的brdu/map2免疫荧光染色图；图7b为brdu和map2阳性细胞数量统计结果。
具体实施方式
[0029]
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0030]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0031]
brdu，即5-溴脱氧尿嘧啶核苷，是一种胸腺嘧啶核苷类似物，它能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(t)渗入正在复制的dna分子，通过检测brdu免疫荧光标记便能准确地反映细胞的增殖情况。
[0032]
nestin，即巢蛋白，是一种中间丝类型的蛋白，仅在胚胎发育早期的神经上皮表达，出生后表达就停止，为神经干细胞的特征性标志物。
[0033]
map2，即微管相关蛋白2，是组成神经元细胞骨架的重要组成成分，是成熟神经元特异性标志物。
[0034]
gfap，即胶质纤维酸性蛋白，是星形胶质细胞活化的标志物。
[0035]
正如背景技术所介绍的，富勒烯具有良好的神经保护作用，但是其本身水溶性较差，本发明联想到采用具有生理活性的氨基酸基团修饰富勒烯，改善水溶性的同时，进一步提高生理活性。
[0036]
本发明第一方面，提供一种色氨酸修饰的富勒烯纳米材料，所述纳米材料的分子式如下：c
60
(c
10h10
n2coo-)
10.01h 10.01
·
2.44h2o；结构式如下：
[0037][0038]
本发明第二方面，提供第一方面所述色氨酸修饰的富勒烯纳米材料的制备方法，所述制备方法如下：将色氨酸加入富勒烯溶液中，加热反应得到所述色氨酸修饰的富勒烯
纳米材料。
[0039]
优选的，所述富勒烯为c
60
。
[0040]
优选的，所述色氨酸为l-色氨酸。
[0041]
优选的，所述富勒烯溶液的溶剂为n-甲基吡咯烷酮。
[0042]
进一步优选的，所述富勒烯溶液的浓度为1～3mg/ml，优选为1mg/ml。
[0043]
优选的，色氨酸与富勒烯的质量为1～3：1～3；优选为1：1。
[0044]
优选的，反应温度为80℃-100℃，优选为90℃；进一步优选为，在90℃的油浴锅内反应。
[0045]
优选的，反应时间为一周。
[0046]
优选的，所述制备方法，还包括反应结束后，过滤，渗析得到所述色氨酸修饰的富勒烯纳米材料。
[0047]
进一步优选的，渗析时，采用100da的渗析袋；
[0048]
进一步优选的，渗析一周。
[0049]
本发明第三方面，提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括第一方面所述色氨酸修饰的富勒烯纳米材料。
[0050]
优选的，所述药物组合物中，还包括其他活性成分或药学上所必须的辅料。
[0051]
优选的，所述其他活性成分为包括但不限于神经修复活性成分、促血液循环成分、脑靶向成分或血脑屏障透过成分中的一种或几种。
[0052]
优选的，所述药学上所必须的辅料包括但不限于药物载体、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、悬浮剂、张力剂、缓冲剂、舒缓剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂和其他制剂添加剂中的一种或几种的组合。
[0053]
本发明第四方面，提供第一方面所述色氨酸修饰的富勒烯纳米材料和/或第三方面所述药物组合物在神经修复领域的应用。
[0054]
优选的，所述应用方式包括以下任意一种：
[0055]
(1)应用于神经修复疾病的治疗；
[0056]
(2)应用于制备神经干细胞增殖剂或神经干细胞诱导分化制剂中的应用；
[0057]
(3)应用于制备神经修复药物。
[0058]
所述神经修复疾病的治疗，包括通过注射或手术等方式将上述色氨酸修饰的富勒烯纳米材料递送至神经损伤病灶部位。
[0059]
所述应用于制备神经干细胞增殖剂或神经干细胞诱导分化制剂，包括应用于将神经干细胞诱导为神经元细胞的培养基。
[0060]
所述应用于制备神经修复药物，所述神经修复药物包括但不限于应用于治疗脑神经损伤或神经退行性疾病的治疗药物。
[0061]
优选的，所述脑神经损伤包括但不限于由脑外伤、脑血管硬化后遗症、脑炎与脑膜炎后遗症、脱髓鞘疾病、脑卒中等引发的脑神经损伤；所述神经退行性疾病包括脑缺血、癫痫、阿尔茨海默症、帕金森症、肌萎缩性侧索硬化或不同类型的脊髓小脑共济失调。
[0062]
进一步的，所述脑血管硬化包括脑溢血、脑血栓。
[0063]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
[0064]
实施例1色氨酸修饰的富勒烯的制备与提纯
[0065]
制备：将200ml的c
60 nmp母液(浓度为1mg/ml)与200mg的l-色氨酸在90℃的油浴锅内反应一周，过滤，使用100da的渗析袋渗析一周后得到目的产物。
[0066]
上述色氨酸修饰的富勒烯溶液实物如附图一所示。红外光谱分析结果如附图二a所示，各峰归属如下：3381cm-1
：n-h；～3000cm-1
：-oh；2883,2814cm-1
：c-h；1657cm-1
：coo-；1504cm-1
：c＝c；1244cm-1
:c-n；1097cm-1
：c-o-c；745cm-1
：双取代苯环。热重分析结果如附图二b所示：在99℃之前发生的第一次重量损失(1.57wt％)归因于结晶水的损失。在462℃之前的第二次重量损失(28.51wt％)可归因于羧基、氨基的热解。462℃以上的第三次重量损失源于c
60
的升华。x射线光电子能谱(xps)测量分析结果如附图二c-f所示。
[0067]
实施例2色氨酸修饰的富勒烯对体外神经干细胞的影响
[0068]
1、提取原代神经干细胞
[0069]
将孕13.5天sd大鼠脱颈处死，放入盛有酒精的托盘中消毒，确保无菌环境。用剪刀剪开大鼠腹部，找到串珠样胚胎，放入盛有dmem洗液的6cm皿中。剥离胎盘，分离出胎鼠，全程冰上操作。将胎鼠转移至新的6cm皿中，在显微镜下，用显微镊小心分离胎鼠全脑。然后剥离脑膜和红色血管，用镊子尽可能夹碎脑组织，再用吸管吸取dmem淋于组织上，立即返吸，置于15ml离心管内。待取完全部胎鼠脑组织后，800rpm转速，离心3min，小心弃去上清液。加入提前预热好的0.2m木瓜酶2ml，吹打重悬，放入37℃细胞培养箱中。待组织充分消化后，将离心管以800rpm转速离心3min，小心弃去上清木瓜酶，加入神经干细胞培养基，缓慢吹打混匀。吸取适量的细胞液和培养基放入6cm皿中，吹打混匀。置于37℃，5％co2培养箱中培养。使用细胞计数板计数后种板。
[0070]
2、细胞毒性实验
[0071]
在贴壁处理的96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)，将培养板放在37℃，5％co2的培养箱内培养48h。第3天向每孔中分别加入不同浓度的色氨酸修饰的富勒烯溶液，使之终浓度分别为0、25、50、100、200μm，继续孵育24h，将上清弃去，重新加入100μl培养基，然后每孔加入10μl cck-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2.5h，用酶标仪测定450nm处的吸光值。
[0072]
图三(a)为cck-8统计结果，可以观察到随着色氨酸修饰的富勒烯浓度的逐渐增加，细胞活力也在增加，证明本富勒烯衍生物无明显毒性。
[0073]
3、抗凋亡实验
[0074]
取怀孕13.5天的sd大鼠胚胎前脑组织提取神经干细胞，使用木瓜蛋白酶消化成单细胞，将5000个左右的单细胞贴壁接种在pdl预处理的96孔板内，每组4个复孔。将培养基换为不含葡萄糖的earle’s平衡盐溶液，运用缺氧小室制备缺氧环境(95％n2 5％co2)，缺氧缺糖8h后换用正常培养基，向每组内加入不同体积的色氨酸修饰的富勒烯，继续复氧培养24h。在倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化，通过cck-8比色法检测细胞存活率，同时设置常氧常糖的正常对照组。
[0075]
图三(b)为ogd处理后各组神经干细胞的活性。结果显示，加入色氨酸修饰的富勒烯可以显著提高损伤细胞的存活率，具有明显的神经保护作用。
[0076]
4、测量神经干细胞增殖分化情况
[0077]
(1)细胞增殖及免疫荧光染色
[0078]
24孔板中放置14mm的无菌圆形盖玻片，加入0.1mg/ml多聚赖氨酸包被飞片2h。
[0079]
培养第3天，向贴壁处理的24孔板中分别加入不同浓度的色氨酸修饰的富勒烯，第五天每孔加入5μlbrdu，4h后进行免疫荧光染色：
[0080]
吸弃孔中培养基，加入500μl 1
×
pbs溶液。清洗飞片2次，每次5min。
[0081]
加入4％pfa500μl用于固定细胞，室温作用10min。
[0082]
500μl 1
×
pbs溶液，清洗飞片3次，每次5min。
[0083]
2m盐酸200μl室温酸化30min。
[0084]
500μl 1
×
pbs溶液，清洗飞片3次，每次5min。
[0085]
加入10％ds溶液，封闭30min。
[0086]
加入一抗(brdu，1:400；nestin，1:400)溶液，4℃冰箱中过夜。
[0087]
500μl 1
×
pbs溶液，清洗飞片3次，每次5min。
[0088]
选择与一抗相同属性的二抗(1:500)，室温避光作用1h。
[0089]
500μl 1
×
pbs溶液，清洗飞片3次，每次5min。
[0090]
在载玻片上滴加含有dapi(1:1000)的防荧光淬灭剂，将飞片倒扣于载玻片上，滤纸吸干多余的防荧光淬灭剂。
[0091]
统计不同视野下的阳性细胞数和dapi细胞数。
[0092]
图四(a)是0、50、100、200μm浓度下神经干细胞的brdu/nestin免疫荧光染色。红色代表brdu阳性细胞，绿色代表nestin阳性细胞，蓝色dapi显示细胞核，merge代表新生的神经干细胞。图四(b)是brdu阳性细胞数量统计结果。结果显示，随着色氨酸修饰的富勒烯浓度的升高，brdu阳性细胞所占比例越来越高，证明色氨酸修饰的富勒烯可以显著促进神经干细胞增殖，并有浓度依赖性。
[0093]
(2)细胞分化及免疫荧光染色
[0094]
诱导分化后第2天，向贴壁处理后的24孔板内分别加入不同浓度的色氨酸修饰的富勒烯，在分化培养后第7天进行免疫荧光染色：
[0095]
吸弃孔中培养基，加入500μl 1
×
pbs溶液。清洗飞片2次，每次5min。
[0096]
加入4％pfa 500μl用于固定细胞，室温作用10min。
[0097]
500μl 1
×
pbs溶液，清洗飞片3次，每次5min。
[0098]
0.4％triton x-100室温通透8min。
[0099]
500μl 1
×
pbs溶液，清洗飞片3次，每次5min。
[0100]
加入10％ds溶液，封闭30min。
[0101]
加入一抗(map2，1:200；gfap，1:300)溶液，4℃冰箱中过夜。
[0102]
500μl 1
×
pbs溶液，清洗飞片3次，每次5min。
[0103]
选择与一抗相同属性的二抗(1:500)，室温避光作用1h。
[0104]
500μl 1
×
pbs溶液，清洗飞片3次，每次5min。
[0105]
在载玻片上滴加含有dapi(1:1000)的防荧光淬灭剂，将飞片倒扣于载玻片上，滤纸吸干多余的防荧光淬灭剂。
[0106]
统计不同视野下的阳性细胞数和dapi细胞数。
[0107]
图五(a)是0、50、100、200μm浓度下神经干细胞分化为星形胶质细胞和成熟神经元。绿色代表gfap阳性细胞，红色代表的是map2阳性细胞，蓝色dapi显示细胞核。图五(b)是星形胶质细胞和神经元所占比例的统计图。结果显示，随着色氨酸修饰的富勒烯浓度的升
高，gfap阳性细胞所占比例逐渐降低，而map2阳性细胞所占比例逐渐升高，证明色氨酸修饰的富勒烯可以显著促进神经干细胞向神经元方向分化。
[0108]
本实施例首先通过cck-8和ogd实验证明了色氨酸修饰的富勒烯对神经干细胞几乎没有毒性，并且可以保护神经干细胞免受ogd损伤。接着用brdu/nestin和map2/gfap两个免疫荧光染色实验，分别比较了不同浓度下色氨酸修饰的富勒烯对于神经干细胞增殖和分化的影响，结果证明，色氨酸修饰的富勒烯可以促进神经干细胞增殖，并随着富勒烯浓度的升高，brdu阳性细胞所占比例也会明显增加。此外，色氨酸修饰的富勒烯会影响神经干细胞分化的方向，诱导神经干细胞向神经元方向分化，并减少星形胶质细胞的生成。
[0109]
实施例3色氨酸修饰的富勒烯对体内神经发生的影响
[0110]
1、大鼠大脑中动脉闭塞模型
[0111]
将大鼠按照40mg/kg的剂量通过腹腔注射10％的水合氯醛进行麻醉。选用直径为0.38mm的栓线，在距离光滑顶端的2cm处，用黑色记号笔进行标记。待大鼠完全麻醉后，将其以仰卧位姿势在操作台上固定四肢和头部。用碘伏擦拭大鼠颈部皮肤进行消毒，用剪刀纵向剪开中线偏左的位置，用镊子分离皮下组织，找到右侧颈总动脉(cca)，小心剥离颈总动脉上附着的血管和神经。沿颈总动脉向上分离颈内动脉(ica)和颈外动脉(eca)。将cca的近心端和eca两处结扎，cca的远心端用动脉钳夹紧，cca的中间部分穿线打虚结，并在虚结的下方剪开小口，将栓线沿着剪口处插入。系紧虚结，松开动脉钳，缓慢将栓线推入ica，至有阻力时停止，此时可观察到标记点在ica和eca的交界处。将大鼠颈部皮肤缝合，待脑缺血2h后，将栓线缓慢拔出，直至看见标记点停止，实现缺血再灌注。
[0112]
2、心脏灌流取脑及组织冰冻切片
[0113]
将大鼠按照40mg/kg的剂量通过腹腔注射10％的水合氯醛进行麻醉。打开蠕动灌注泵，用0.9％的生理盐水排尽输液管内的空气，并将流速调至三十，暂停机器待用。待大鼠完全麻醉后，将其以仰卧位姿势在解剖台上固定四肢。
[0114]
将大鼠胸腔剑突处的皮肤剪开，沿剑突向左上和右上剪断肋骨，用眼科剪将大鼠腹腔隔膜轻轻剪开，用止血钳夹紧剑突向上翻起，充分暴露心脏。
[0115]
用输液管连接的灌流针头沿心尖插入左心室，打开灌流泵剪破心耳后，血液顺利流出。持续灌入生理盐水30min，此时大鼠肝脏转为灰白色。
[0116]
暂停灌流泵，将灌流液体换成4％的多聚甲醛溶液继续灌流30min。直至四肢及尾部僵硬，即完成整个灌流。
[0117]
将大鼠头部剪下，剪开头顶的皮肤以暴露整个头骨。将剪刀斜插入枕骨大孔，分离两侧头骨，完整暴露出从嗅球至小脑的全部组织。用镊子将脑膜剥离，并剪断连接的视神经，取出完整的脑部组织，并将其置于盛有4％多聚甲醛溶液的离心管内，固定48h。随后将鼠脑依次在10％，20％和30％的蔗糖溶液中脱水。
[0118]
待鼠脑在30％的蔗糖溶液中沉至底部后取出，用滤纸吸干表面残留的液体。将脑子水平放置，沿小脑处垂直切下，形成平整的底部。将脑子垂直置于冰冻的脑托上，用环状的透明胶带围住脑组织，向其中缓慢倒入胶水进行包埋，保证脑子在整个过程中保持直立的状态，然后放进-20℃冰箱进行冷冻包埋。
[0119]
用冰冻切片机进行冠状切片，只取svz区域的脑片，将组织切成40μm的薄片，依次放入盛有1
×
pbs的六孔板内，最后分别转移至6个装有防冻液的2ml ep管内，-20℃长期保
存。
[0120]
3、组织免疫荧光染色
[0121]
(1)增殖及免疫荧光染色
[0122]
将脑片在1
×
pbs中清洗3次，每次5min。目的是吸去表面的防冻液。
[0123]
使用0.4％的triton x-100室温透化20min。
[0124]
将脑片在1
×
pbs中清洗3次，每次5min。
[0125]
用2mol的盐酸溶液酸化45min。
[0126]
转移至四硼酸钠溶液中进行中和，时间为45min。
[0127]
将脑片在1
×
pbs中清洗3次，每次5min。
[0128]
使用10％的驴血清，室温封闭90min。
[0129]
加入一抗溶液(dcx，1:500)放入冰箱4℃过夜。
[0130]
将脑片在1
×
pbst中清洗6次，每次5min。
[0131]
使用二抗溶液(驴抗兔：alexa fluor 488)，室温避光作用1h。
[0132]
将脑片在1
×
pbst中避光清洗6次，每次5min。
[0133]
最后将脑片平整展于干净的载玻片表面，晾干后滴加含有dapi染液(1:1000)的防荧光淬灭剂，盖上盖玻片，用滤纸吸干周围溢出的多余液体。统计不同脑片svz区阳性细胞数量。
[0134]
图六(a)是生理盐水组和色氨酸修饰的富勒烯组svz区的免疫荧光染色结果。绿色代表dcx阳性细胞，蓝色dapi显示细胞核。图六(b)是阳性细胞数量统计结果。结果显示，色氨酸修饰的富勒烯可以促进体内神经干细胞的增殖。
[0135]
(2)分化及免疫荧光染色
[0136]
将脑片在1
×
pbs中清洗3次，每次5min。目的是吸去表面的防冻液。
[0137]
使用0.4％的triton x-100室温透化20min。
[0138]
将脑片在1
×
pbs中清洗3次，每次5min。
[0139]
用2mol的盐酸溶液酸化45min。
[0140]
转移至四硼酸钠溶液中进行中和，时间为45min。
[0141]
将脑片在1
×
pbs中清洗3次，每次5min。
[0142]
使用10％的驴血清，室温封闭90min。
[0143]
加入一抗溶液(map2，1:500；brdu，1:500)放入冰箱4℃过夜。
[0144]
将脑片在1
×
pbst中清洗6次，每次5min。
[0145]
使用二抗溶液(驴抗羊：alexa fluor 594；驴抗兔：alexa fluor 488)，室温避光作用1h。
[0146]
将脑片在1
×
pbst中避光清洗6次，每次5min。
[0147]
最后将脑片平整展于干净的载玻片表面，晾干后滴加含有dapi染液(1:1000)的防荧光淬灭剂，盖上盖玻片，用滤纸吸干周围溢出的多余液体。统计不同脑片半影区阳性细胞数量。
[0148]
图七(a)是生理盐水组和色氨酸修饰的富勒烯组半影区的免疫荧光染色结果。红色代表brdu阳性细胞，绿色代表map2阳性细胞，蓝色dapi显示细胞核，merge代表新生的神经元。图七(b)是阳性细胞数量统计结果。结果显示，色氨酸修饰的富勒烯可以促进体内新
增殖的神经干细胞向神经元分化。
[0149]
本实施例通过建立大鼠大脑中动脉闭塞模型模拟临床上脑卒中的病理模型。接着用brdu/dcx和brdu/map2两个免疫荧光实验分别比较了生理盐水组和色氨酸修饰的富勒烯组对于体内神经干细胞增殖和分化的影响。结果证明，色氨酸修饰的富勒烯可以促进损伤后体内神经干细胞增殖并诱导神经干细胞向神经元方向分化。
[0150]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。