包含由源自辅助性T细胞的细胞外囊泡激活的细胞毒性T细胞作为活性成分的用于预防或治疗癌症疾病的组合物的制作方法

包含由源自辅助性t细胞的细胞外囊泡激活的细胞毒性t细胞作为活性成分的用于预防或治疗癌症疾病的组合物
技术领域
1.本发明涉及用于预防或治疗癌症疾病的组合物，所述组合物包含由源自cd4 t细胞的细胞外囊泡激活的cd8 t细胞作为活性成分。


背景技术：

2.小细胞外囊泡(sev)是大多数细胞分泌的小的膜性囊泡。细胞外囊泡的直径约为30nm-100nm，并且其含有来源于细胞的多种类型的蛋白质、遗传物质(dna、rna、mirna)、脂质等。细胞外囊泡被释放并分泌到细胞外，其起源于称为多泡体(mvb)的特定细胞内区室，而不是直接从质膜分离。换句话说，当发生多泡体与质膜的融合时，囊泡被释放到细胞外环境中，其被称为细胞外囊泡。虽然还没有确切地确定细胞外囊泡是通过什么机制产生的，但已知其在正常和病理条件下从各种细胞类型中分离和释放。
3.癌症是由异常过量的细胞引起的不受控且紊乱的细胞增殖的结果。从分子生物学的角度来看，癌症是由遗传突变引起的疾病。目前已鉴别出的癌症有数十种类型，并且它们主要根据病变组织的位置进行分类。癌症分为良性肿瘤和恶性肿瘤。良性肿瘤生长相对缓慢，并且不会从它们的原发部位转移到其它组织，而恶性肿瘤离开它们的原发部位，侵入其它组织，且生长迅速，并且因这一特征而危及生命。大多数癌症在早期是无症状的，即使有症状，症状也是轻微的，所以大多数人容易忽视它们，从而增加了癌症死亡率。
4.手术疗法、化学疗法、放射疗法等用于治疗癌症，但据报道，尽管进行了许多研究，所有癌症患者中超过50％最终未被治愈而死亡。原因是癌症复发，因为手术切除后显微镜下才可见的转移的癌细胞没有被清除；抗癌药物未诱导癌细胞的死亡；或者尽管在初始阶段由于对抗癌药物的反应，肿瘤似乎缩小，但在治疗期间或治疗后对抗癌药物发展出耐药性的癌细胞迅速增加。今天，约60种不同的抗癌药物被使用，随着对关于癌症发生和癌细胞特征的知识广泛地了解，新的抗癌药物的开发研究正在积极进行。然而，大多数抗癌药物引发严重的副作用(如恶心和呕吐、脱发、皮肤和指甲变色、以及神经系统副作用)，并且由于在长期反复给药时或在癌症复发时，癌细胞获得对抗癌药物的耐药性，因此具有失去它们的治疗作用的缺点。此外，放射疗法通过对癌症组织照射高能辐射来诱导癌细胞死亡，但其缺点是损伤癌组织周围的正常组织而诱发副作用。
5.因此，由源自细胞因子的细胞外囊泡激活的辅助性t细胞可以激活细胞毒性t细胞，并且该技术的发展可以使癌症预防和治疗的效果最大化。
6.[现有技术文献]
[0007]
[专利文献]
[0008]
专利文献1：韩国专利申请公开第10-2018-0063841号(2018年6月12日公开)


技术实现要素：

[0009]
技术问题
[0010]
本发明涉及用于预防或治疗癌症疾病的组合物，所述组合物包含由源自辅助性t细胞(cd4 t细胞)的细胞外囊泡激活的细胞毒性t细胞(cd8 t细胞)作为活性成分。已经发现，从细胞因子激活的cd4 t细胞分泌的细胞外囊泡增加，并且细胞外囊泡增强cd8 t细胞的增殖和活性以诱导癌细胞死亡，从而增强抗癌作用。由源自cd4 t细胞的细胞外囊泡激活的cd8 t细胞可以有用地用作预防或治疗癌症疾病的组合物、用作免疫抗癌药物的组合物等。因此，本发明提供了由源自cd4 t细胞的细胞外囊泡激活的cd8 t细胞作为癌症疾病的药剂或免疫治疗剂，以及使用源自cd4 t细胞的细胞外囊泡激活cd8 t细胞的方法，以制备如上所述表现出优异抗癌活性的cd8 t细胞。
[0011]
技术方案
[0012]
本发明提供了用于预防或治疗癌症疾病的药物组合物，所述组合物包含由源自cd4 t细胞的细胞外囊泡激活的cd8 t细胞作为活性成分。
[0013]
此外，本发明提供了用于免疫抗癌剂的组合物，所述组合物包含由源自cd4 t细胞的细胞外囊泡激活的cd8 t细胞作为活性成分。
[0014]
此外，本发明提供了激活cd8 t细胞的方法，所述方法包括：通过用细胞因子进行处理来激活cd4 t细胞；以及，用源自经激活的cd4 t细胞的细胞外囊泡处理cd8 t细胞。
[0015]
有益效果
[0016]
根据本发明，发现从细胞因子激活的cd4 t细胞分泌的细胞外囊泡增加，并且细胞外囊泡增强cd8 t细胞的增殖和活性以诱导癌细胞死亡，从而增强抗癌作用。因此，由源自cd4 t细胞的细胞外囊泡激活的cd8 t细胞可有用地用作预防或治疗癌症疾病的组合物、免疫抗癌药物的组合物等。
附图说明
[0017]
图1是显示出源自被il-2激活的cd4 t细胞的细胞外囊泡的增高的分泌以及由该细胞外囊泡激活的cd8 t细胞的抗癌效果的图。
[0018]
图2显示了通过进行蛋白印迹、实时聚合酶链式反应和流式细胞术分析确定cd4 t细胞和原代cd4 t细胞中由il-2引起的rab5、rab7、rab27a表达增加的结果。
[0019]
图3显示了通过纳米粒子追踪分析确定cd4 t细胞和原代cd4 t细胞中由il-2引起的分泌增加和细胞外囊泡大小验证的结果。
[0020]
图4和图5显示了确定使用源自被il-2激活的cd4 t细胞和原代cd4 t细胞的细胞外囊泡的cd8 t细胞和原代cd8 t细胞的增殖和活性增加的结果。
[0021]
图6显示了确定使用源自被il-2激活的cd4 t细胞和原代cd4 t细胞的细胞外囊泡的cd8 t细胞和原代cd8 t细胞的抗癌活性增加的结果。
具体实施方式
[0022]
本文使用的术语在考虑到本发明的功能的同时被尽可能选择为当前广泛使用的通用术语，但可能会根据本领域技术人员的意图或先例、新技术的出现等而变化。此外，在具体情况下，存在申请人任意选择的术语，并且在这种情况下，其含义将在相应发明的描述中进行详细描述。因此，本文使用的术语应根据术语的含义和本发明的整体内容进行定义，而不仅仅根据术语的名称来定义。
[0023]
除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术术语或科学术语)具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。常用术语(如字典中定义的那些)应被解释为具有与相关领域的背景中的含义一致的含义，并且除非在本技术中明确定义，否则不应被解释为理想或过于形式化的含义。
[0024]
数值范围包括在该范围内定义的数值。在本说明书全文中给出的每个最大数值限制都包括任何更低的数值限制，如同该更低的数值限制被明确写出一样。在本说明书全文中给出的每个最小数值限制都包括任何更高的数值限制，如同更高的数值限制被明确写出一样。在本说明书全文中给出的每个数值限制都将包括在更宽的数值范围内的任何更窄的数值范围，如同更窄的数值限制被明确写出一样。
[0025]
在下文中，将更详细地描述本发明。
[0026]
如图1所示，本发明的发明人确定，在用细胞因子处理cd4 t细胞的情况下，细胞外囊泡的分泌增加，并且在用源自cd4 t细胞的细胞外囊泡处理cd8 t细胞的情况下，与其在正常状态下的抗癌作用相比，cd8 t细胞表现出更强的作用。换言之，本发明是通过确定如下而完成的：细胞外囊泡增加cd8 t细胞的增殖能力和细胞毒性能力来诱导癌细胞死亡，从而增强抗癌作用。
[0027]
本发明提供了用于预防或治疗癌症疾病的药物组合物，所述组合物包含由源自cd4 t细胞的细胞外囊泡激活的cd8 t细胞作为活性成分。
[0028]
cd4 t细胞被细胞因子激活，且细胞因子可以是选自于由il-2、il-4、il-7、il-9、il-15和il-21所组成的组中的一种或多种，并且优选il-2，但不限于此。
[0029]
细胞外囊泡可以增加cd8 t细胞的增殖，并增加作为细胞毒性标志物的ifn-γ、穿孔素和颗粒酶b的表达，从而增强抗癌作用。
[0030]
细胞外囊泡是直径为50-100nm的小细胞外囊泡(sev)，并且可以包括外泌体和微囊泡，但应注意本发明不限于此。
[0031]
癌症疾病可以选自于由如下所组成的组，但不限于此：黑色素瘤、皮肤癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、骨癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、hawkins病、食道癌、小肠癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛周癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性白血病或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤和垂体腺瘤。
[0032]
在本发明的组合物是药物组合物的情况下，除了上述活性成分之外，其还可以包括用于给药的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂和稀释剂可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐/酯、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
[0033]
本发明的药物组合物可以分别按常规方法配制成口服剂型(如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂或气溶胶)、或外用制剂、栓剂或无菌注射液的形式并使用。具体而言，在配制时，可以使用稀释剂或赋形剂，例如常用的填充剂、疏松剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂。用于口服给药的固体剂型包括但不限于片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊剂。除了活性成分，还可以通过混入一种或多种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、
乳糖和明胶)来制备此类固体剂型。除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂(如硬脂酸镁和滑石)。除了用于口服使用的液体和液体石蜡外，还可以通过添加各种赋形剂(例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂)来制备。肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂和混悬剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、以及注射用酯(例如油酸乙酯)。作为栓剂的基质，可以使用witepsol、macrosol、吐温61、可可脂、月桂脂和甘油明胶。
[0034]
本发明的药物组合物的合适剂量根据患者的状况和体重、疾病程度、药物形式和时间而变化，但可以由本领域技术人员适当地选择。所述组合物的日剂量优选为0.001mg/kg-50mg/kg，并且根据需要可以一天一次或分数次给药。
[0035]
另外，本发明提供了激活cd8 t细胞的方法，所述方法包括：通过用细胞因子进行处理来激活cd4 t细胞；以及，用源自经激活的cd4 t细胞的细胞外囊泡处理cd8 t细胞。
[0036]
激活cd4 t细胞的步骤的细胞因子可以选自于由il-2、il-4、il-7、il-9、il-15和il-21所组成的组，但不限于此。
[0037]
实施例
[0038]
在下文中，将使用实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，并且对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明的范围不受这些实施例的限制。
[0039]
实施例1：细胞培养
[0040]
将b16f10细胞(小鼠黑色素瘤)在补充有10％胎牛血清(fbs)以及1％青霉素和链霉素(hyclone)的dmem培养基(hyclone)中进行培养，并且将cd4 t细胞(人t淋巴细胞)在补充有10％fbs以及1％青霉素和链霉素的rpmi 1640培养基中进行培养。将cd8 t细胞(小鼠细胞毒性t淋巴细胞)在补充有10％fbs、1％青霉素和链霉素以及20iu/ml重组il-2(r&d system)的rpmi 1640培养基中进行培养。将原代cd4 t细胞和原代cd8 t细胞(分离自pbmc)在补充有10％fbs以及1％青霉素和链霉素的rpmi 1640培养基中进行培养。
[0041]
实施例2：从人外周血单核细胞中分离原代cd4 t细胞和原代cd8 t细胞
[0042]
在使用50ml注射器收集50ml血液并转移到含有肝素的真空管(bd vacutainer)后，通过以550
×
g离心10分钟去除上清液。之后，将其与pbs以1:1混合。然后，每8ml与pbs混合的血液加入5ml ficoll(ge healthcare)，并以550
×
g离心30分钟。然后，去除上清液并将血沉棕黄层(buffy coat)转移到新的50ml锥形管中。添加pbs至30ml后，以550
×
g离心10分钟。此后，将沉淀与补充有10％fbs以及1％青霉素和链霉素的rpmi 1640培养基混合，并在10cm培养皿(cat.430167；corning)上培养16小时。
[0043]
在将人外周血单核细胞培养16小时后，使用人cd4 t细胞分离试剂盒(cat.130-096-533；macs)和人cd8 t细胞分离试剂盒(cat.130-096-495；macs)分离原代cd4 t细胞和原代cd8 t细胞。
[0044]
在10cm培养皿(cat.430167；corning)上培养的人外周血单核细胞的数量通过台盼蓝染色进行计数，然后将它们以550
×
g离心10分钟。之后，每107个添加40μl macs缓冲液。之后，每107个加入10μl生物素-ab混合物并混合，并在4℃孵育5分钟。之后，每107个加入20μl微珠混合物并混合，并在4℃孵育10分钟。之后，将ls柱置于macs分离器的磁场中。之后，每次用1ml macs缓冲液洗涤该柱共3次。此后，将孵育10分钟的细胞上清液置于柱中，并
在5ml管中接收流脱液。将上述过程重复3次以获得总共3ml的细胞上清液，并将其以550
×
g离心10分钟。然后，将沉淀与补充有10％fbs以及1％青霉素和链霉素的rpmi 1640培养基混合，并在10cm培养皿(cat.430167；corning)上培养。
[0045]
实施例3：源自被il-2激活的cd4 t细胞和原代cd4 t细胞的细胞外囊泡(sev)的分析
[0046]
3-1.纳米粒子追踪分析
[0047]
以2
×
106/10cm培养皿(cat.430167；corning)的密度添加cd4 t细胞并用各种浓度的il-2(0iu/ml、1iu/ml、10iu/ml、100iu/ml、500iu/ml)进行处理，然后培养48小时。然后，为了收集细胞外囊泡，将培养基更换为未补充fbs的培养基，并将细胞进一步培养24小时。回收细胞培养上清液并离心以去除细胞和碎片。然后，为了分离源自cd4 t细胞的细胞外囊泡(ce)或源自il-2激活的t细胞的细胞外囊泡(il-2e)，将从细胞获得的各上清液以300
×
g、2500
×
g、10,000
×
g连续离心。然后通过0.2μm注射器式过滤器过滤上清液并以120,000
×
g离心。将细胞外囊泡沉淀重悬在pbs中并以120,000
×
g再次离心。将纯化的沉淀重悬在pbs或1
×
细胞裂解缓冲液中用于下一实验。此后，使用配备快速视频捕获和粒子追踪软件的nanosight lm10(malvern instruments)测量细胞外囊泡的大小和浓度。该过程在原代cd4 t细胞中以相同的方式进行。
[0048]
结果，如图2所示，在用il-2处理cd4 t细胞和原代cd4 t细胞的情况下，确定细胞外囊泡的分泌以浓度依赖性方式增加。
[0049]
3-2.流式细胞术
[0050]
将cd4 t细胞和原代cd4 t细胞用pbs洗涤，然后用4％多聚甲醛在室温下固定15分钟。然后，加入含有0.1％triton-x(cas#.9002-93-1；biosesang)的pbs(cat.sh30028.02；hyclone)，并在室温下反应10分钟以穿透细胞。穿透后，将样品与一抗在4℃反应1小时，用pbs洗涤，与二抗(1:2000稀释)在4℃反应1小时，并用pbs洗涤，并进行流式细胞术(facsaria iii；becton dickinson)。使用flowjo软件(flowjo，ashland，or，usa)分析数据。
[0051]
本实验中使用的一抗为：rab5(ab18211，1:100；abcam)、rab7(ab50533，1:100；abcam)、rab27a(ab55667，1:100；abcam)。
[0052]
结果，如图3所示，在用500iu/ml il-2处理cd4 t细胞和原代cd4 t细胞的情况下，确定了参与产生和分泌细胞外囊泡的rab酶(rab5、rab7、rab27a)的表达增加。
[0053]
实施例4：源自由il-2激活的cd4 t细胞和原代cd4 t细胞的细胞外囊泡(sev)的纯化
[0054]
用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤cd4 t细胞或被il-2(500iu/ml)激活的cd4 t细胞，并在不含fbs的rpmi 1640培养基中进一步培养24小时。
[0055]
对于细胞外囊泡纯化，通过在室温下以1,200rpm离心5分钟来回收细胞培养上清液，然后将上清液以2000
×
g离心30分钟以去除细胞和碎片。然后，为了分离源自cd4 t细胞的细胞外囊泡(ce)或源自il-2激活的t细胞的细胞外囊泡(il-2e)，将从所述细胞获得的各自的上清液以300
×
g、2500
×
g和10,000
×
g连续离心。然后通过0.2μm注射器式过滤器过滤上清液并以120,000
×
g离心。将细胞外囊泡沉淀重悬在pbs中并以120,000
×
g再次离心。将纯化的沉淀重悬在pbs或1
×
细胞裂解缓冲液中用于下一实验。
[0056]
实施例5：通过cd4 t细胞和原代cd4 t细胞的细胞外囊泡激活的cd8 t细胞和原代cd8 t细胞的抗癌作用的分析
[0057]
5-1.流式细胞术
[0058]
接下来，用从被il-2激活的cd4 t细胞纯化的细胞外囊泡处理cd8 t细胞，以评价细胞外囊泡的作用。简而言之，以1
×
105个细胞/孔的密度将cd8 t细胞接种到6孔板中，并用ce(源自cd4 t细胞的细胞外囊泡)或il-2e(源自il-2激活的cd4 t细胞的细胞外囊泡)(25μg/ml)培养24小时。然后，对ki-67、ifn-γ、穿孔素和颗粒酶b进行流式细胞术。此外，用从原代cd4 t细胞纯化的细胞外囊泡处理原代cd8 t细胞，并以与上述相同的方式进行流式细胞术。
[0059]
本实验中使用的一抗为：抗ki-67(ab16667，1:500；abcam)、穿孔素(ab16074，1:500；abcam)、ifn-g(ab9657，1:500；abcam)、颗粒酶b(ab4059，1:500；abcam)。
[0060]
结果，如图4所示，在用源自il-2激活的cd4 t细胞的细胞外囊泡(il-2e)处理cd8 t细胞的情况下，确定细胞增殖标志物ki-67蛋白的表达与对照组相比增加了约7％。此外，在用源自il-2激活的原代cd4 t细胞的细胞外囊泡(il-2e)处理原代cd8 t细胞的情况下，确定了细胞增殖标志物ki-67蛋白的表达与对照组相比增加了约40％。
[0061]
此外，如图5所示，在用源自il-2激活的cd4 t细胞的细胞外囊泡(il-2e)处理cd8 t细胞以及用源自il-2激活的原代cd4 t细胞的细胞外囊泡(il-2e)处理原代cd8 t细胞的情况下，确定了与对照组或ce处理组相比，作为两者中的细胞毒性标志物的ifn-γ、穿孔素和颗粒酶b蛋白的表达也增加。特别是，与对照组或ce处理组相比，穿孔素和颗粒酶b显示出显著增加。
[0062]
因此，确定了源自il-2激活的cd4 t细胞的细胞外囊泡和源自il-2激活的原代cd4 t细胞的细胞外囊泡(il-2e)增强了cd8 t细胞的细胞毒性能力，从而增强了抗癌作用。
[0063]
5-2.实时聚合酶链式反应
[0064]
在从cd8 t细胞中提取mrna(minibest universal rna提取试剂盒，#9767；takara)后，使用nanodrop(ds-11系列分光光度计；denovix)测量mrna的浓度。用100ng mrna合成cdna(primescripttm 1st strand cdna合成试剂盒，#6110a；takara)后，使用tb greentm premix ex taqtm(tli rnaseh plus)试剂盒(#rr420a；takara)检测基因表达。
[0065]
本实验中使用的引物在下表1中示出。
[0066]
表1
[0067][0068]
使用steponeplus实时pcr系统(applied biosystems)进行实时聚合酶链式反应。样品的相对mrna水平在归一化为同一样品中的gapdh的量后，通过ct(比较阈值循环)分析进行计算，并表示为从初始ct值修改的2
‑△△
ct
值。
[0069]
结果，如图4所示，在用原代cd4 t细胞的细胞外囊泡处理cd8 t细胞的情况下，确定了t细胞增殖标志物ki-67的mrna表达水平增加。另外，如图5所示，在用原代cd4 t细胞的细胞外囊泡处理cd8 t细胞的情况下，作为t细胞激活的标志物的ifn-γ、颗粒酶b和穿孔素的mrna表达水平增加。这意味着cd8 t细胞攻击癌细胞的能力得到提升，从而增强了抗癌作用。
[0070]
实施例6：用细胞外囊泡预处理的cd8 t细胞与黑色素瘤细胞的共培养的分析
[0071]
在以1
×
105个细胞/孔的密度将cd8 t细胞接种到6孔板中后，用ce(源自cd4 t细胞的细胞外囊泡)或il-2e(源自被il-2激活的cd4 t细胞的细胞外囊泡)(25μg/ml)对其进行预处理。培养24小时后，将该细胞与不同比例的黑色素瘤细胞(1:1至1:10)在96孔板中培养72小时。在培养结束时，将mts(#g3582；promega)试剂加入每个孔中，并在37℃培养2小时。之后，移出包含各孔的上清液的mts试剂，并使用酶标仪在490nm测定吸光度。此外，以相同的方式，用ce(源自原代cd4 t细胞的细胞外囊泡)或il-2e(源自被il-2激活的原代cd4 t细胞的细胞外囊泡)(25μg/ml)对从人pbmc分离的cd8 t细胞进行预处理，并进行相同的程序。
[0072]
结果，如图8所示，确定在用细胞外囊泡处理的cd8 t细胞与黑色素瘤细胞的共培养组中，黑色素瘤细胞的活力显著降低。
[0073]
以上对本发明的具体部分进行了详细描述，对于本领域技术人员而言清楚的是，这些具体描述仅为优选的实施方式，本发明的范围并不限于此。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来界定。
[0074]
本发明的范围由下面的权利要求指示，并且由权利要求的精神和范围所衍生出的所有修改或替换及其等同物均应理解为包含在本发明的范围内。