用于治疗戈谢病的β-葡糖脑苷脂酶变体1.相关申请2.本发明要求2020年3月29日提交的以色列专利申请号为273684和2020年7月9日提交的美国临时专利申请号为63/049,685的优先权，其全部内容通过引用并入本文。3.序列表声明4.与本发明同时提交的、创建于2021年3月29日名为86504序列表.txt(86504sequencelisting.txt)的ascll文件包括81,406字节，该文件通过引用并入本文。5.本发明的
技术领域：
：和
背景技术：
：：6.本发明在其一些实施方式中涉及β-葡糖脑苷脂酶(β-glucocerebrosidase，gcase)的变体，更具体地但不排他地涉及其用于治疗β-葡糖脑苷脂酶缺乏症(包括戈谢病)的用途。7.溶酶体贮积症(lysosomalstoragedisorders，lsds)包括约50种不同的遗传疾病。由溶酶体酶或转运蛋白的缺陷引起，导致未降解代谢物在溶酶体内积聚。在lsd中，戈谢病(gaucherdisease，gd)是最普遍的；它是由gba1基因中的突变(mutation)引起的。gba1基因编码β-葡糖脑苷脂酶(也称为酸性β葡萄糖苷酶(acidbeta-glucosidase)、d-葡萄糖基-n-酰基鞘氨醇葡萄糖水解酶(d-glucosyl-n-acylsphingosineglucohydrolase)，或gcase)，这是一种具有葡糖神经酰胺酶(glucosylceramidase)活性的溶酶体酶，需要通过水解来切割糖脂代谢的中间产物葡萄糖基神经酰胺(glucosylceramide，glccer，也称为葡糖脑苷脂(glucocerebroside))的β-葡萄糖苷键，糖脂代谢中的中间体。结果，细胞积累了大量的glccer，最终死亡。8.从临床角度来看，根据发病年龄和神经系统参与的迹象，gd可分为三个亚型。1型gd是该疾病最常见的形式，其主要症状是脾和肝肿大、贫血、血小板减少和骨骼病变。2型和3型gd(gd(ngd)的神经性形式)的神经病形式，根据神经症状的发作时间和进展速度进行分类。2型，急性神经性形式，通常指在6个月龄之前表现出神经异常并在2-4岁时死亡的儿童。在3型(亚急性、慢性神经性形式)中，患者表现出与2型中观察到的症状相似的症状，但发病较晚且较严重。9.通常采用酶替代疗法(enzymereplacementtherapy，ert)治疗1型gd患者。第一个用于gd靶向ert(胎盘衍生产品)的药物(阿糖脑苷酶(alglucerase))在1991年被fda获批，并因重组dna技术制成的如下同类药物的获批而退出市场：于1995年获批的伊米苷酶(imiglucerase)2010年获批的维拉西酶α(velagluceraseα)和2012年获批的他利苷酶-α(taligluceraseα)这些疗法不能治愈gd，也就是说，它们不能纠正潜在的遗传缺陷。因此，为了从治疗中受益，有症状的患者需要终身继续接受ert。10.除了上述ert治疗外，美格鲁特(miglustat)(ogt918，n-丁基-脱氧野尻霉素(n-butyl-deoxynojirimycin))一种小分子，可口服药物，于2002年获批，提供了用于治疗gd的基板减低疗法(substratereductiontherapy，srt)。通过减少身体产生的鞘糖脂(glycosphingolipids，gsls)的量来减少整个身体的糖鞘脂(gsls)的有害积聚。此外，2014年获批的依利格鲁司特(eliglustat)也是一种用于治疗gd的小分子药物。被认为是通过抑制葡萄糖基神经酰胺合酶而起作用的。11.对1型gd的美格鲁特(miglustat)的回顾性分析发现，联合治疗可以为gd患者提供更好的疾病控制(通过采用一种以上的作用机制对抗细胞中葡萄糖基神经酰胺的积聚)，可以通过允许使用降低剂量的ert和美格鲁特来降低成本，并且可以提供可接受的生活质量[machaczkam.等人，乌普萨拉医学科学杂志(upsalajournalofmedicalsciences)(2012)117,28-34]。技术实现要素：[0012]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种经基因修饰(geneticallymodified)的人β-葡糖脑苷脂酶(β-glucocerebrosidase，gcase)：(i)包含与seqidno:2至少85％相同的氨基酸序列；(ii)包含坐标l34p、k224n/g、t369e和n370d处的突变，其中所述坐标对应于所述seqidno:2；和(iii)能够催化糖脂葡萄糖基神经酰胺(glucosylceramide，glccer)的水解。[0013]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码本发明一些实施方式所述的经基因修饰的人gcase的核酸序列。[0014]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含本发明一些实施方式所述的分离的多核苷酸和用于指导核酸序列在细胞中表达的顺式作用调节元件。[0015]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种分离的细胞，所述分离的细胞包含本发明一些实施方式所述的多核苷酸或本发明一些实施方式所述的构建体。[0016]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的本发明一些实施方式所述的经基因修饰的人gcase、本发明一些实施方式所述的分离的多核苷酸、本发明一些实施方式所述的构建体，或本发明一些实施方式所述的细胞，以及药学上可接受的载体或稀释剂。[0017]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种在有需要的主体中治疗与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病的方法，所述方法包括向所述主体施用治疗有效量的本发明一些实施方式所述的经基因修饰的人gcase、本发明一些实施方式所述的分离的多核苷酸、本发明一些实施方式所述的构建体或本发明一些实施方式所述的细胞，从而治疗主体中与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病。[0018]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了治疗有效量的本发明一些实施方式所述的经基因修饰的人gcase、本发明一些实施方式所述的分离的多核苷酸、本发明一些实施方式所述的构建体或本发明一些实施方式所述的细胞，用于在有需要的主体中治疗与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病。[0019]根据本发明一些实施方式的一个方面，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k和/或l372n，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0020]根据本发明的一些实施方式，经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w和/或h495r，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0021]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：i130t、a168s和/或d263n，其中坐标对应于seqidno:2。[0022]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：r211n和/或k303r，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0023]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和/或l420m/i，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0024]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：v78i、a95k、v191m、a322d、v343t、m361e、s364a、h374w、t410e、h451n和/或l480i，其中坐标对应于seqidno:2。[0025]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：h162k、s181a、t297s、m335f、k346h、s431a、s465d和/或a476d，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0026]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：r47k、l51r、q70h、l91i、g115e、a124g、d140n/g、s196t和/或v437s，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0027]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：t36q、s38a、q143e、t183a、l185m、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、e300r、k321e、v376t、k408r、q440e、m450q和/或i483v，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0028]根据本发明的一些实施方式，坐标d127、f128、w179、n234、e235、y244、f246、q284、y313、e340、s345、w381、n396处的氨基酸未被修饰，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0029]根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列与选自由seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22和27组成的组的序列相同。[0030]根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列如seqidno:14所示。[0031]根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列如seqidno:22所示。[0032]根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列如seqidno:27所示。[0033]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase能够催化人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-d-glucopyranoside，p-np-glc)的水解。[0034]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase能够以至少约0.2×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer的水解。[0035]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase能够以至少约0.5×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer的水解。[0036]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase能够以至少约1.5×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer的水解。[0037]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比gcase多肽高5至20℃温度范围的热稳定性。[0038]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比野生型多肽高5至20℃温度范围的热稳定性。[0039]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比野生型多肽高至少5℃温度范围的热稳定性。[0040]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比野生型多肽高至少10℃温度范围(例如高至少12℃温度范围)的热稳定性。[0041]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比多肽高5至20℃高温度范围的热稳定性。[0042]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比多肽高至少10℃温度范围(例如高至少11℃温度范围)的热稳定性。[0043]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比多肽高至少15℃温度范围(例如高至少17℃温度范围)的热稳定性。[0044]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase在真核细胞中具有比野生型多肽高至少2倍的细胞内表达水平。[0045]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，与不分泌的野生型多肽相比，所述经基因修饰的人gcase是从真核细胞分泌的。[0046]根据本发明的一些实施方式，所述分离的多核苷酸包含seqidno:3、5、7、9、11、13、17、19、21、23或26所示的核酸序列。[0047]根据本发明的一些实施方式，所述顺式作用调节元件包含启动子。[0048]根据本发明的一些实施方式，与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的所述疾病是戈谢病(gaucherdisease)。[0049]根据本发明的一些实施方式，所述主体是人。[0050]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实施方式的实践或测试中，可以使用与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料，下文描述示例性的方法和/或材料在下面描述。如有冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而非限制性的。[0051]附图的简要说明[0052]本文仅通过示例的方式参考附图描述了本发明的一些实施方式。现在具体参照附图详图，需要强调的是，所示的细节是示例，是为了对本发明的实施方式进行说明性的讨论。在这一点上，结合附图进行的描述使得本领域技术人员清楚如何实施本发明的实施方式。[0053]在附图中：[0054]图1示出了野生型(wt，seqidno:2，包含如(赛诺菲健赞(sanofigzyme))提供的单个r495h突变)和变体(variants)d2-d7gcase(分别在seqidno:4、6、8、10、12和14中列出)的氨基酸序列。在每个序列中，酶的活性位点残基用下划线标出。由pross引入d2-d7gcase变体序列的所有突变都以粗体突出显示。[0055]图1b示出了野生型(wt)和变体d7gcase的氨基酸序列。gcasewt的完整氨基酸序列显示在上面的行(seqidno:2)，由pross引入d7序列的突变显示在下面的行(seqidno:14)。[0056]图2a是用于hek293t细胞中用于gcase表达的pcdna3.1载体内gcase序列位置的示意图。[0057]图2b-2c是示出通过纯化从wt和gcase沉淀中分离的gcase获得的三个洗脱部分的硫酸盐/聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)(图2b)，以及和在flag珠粒上纯化的分泌型gcase的sds-page(图2c)的照片。值得注意的是，只有d7变体产生一种分泌酶。箭头表示通过质谱(massspectrometry，ms)识别的gcase带的位置。[0058]图3a-b示出了使用flag珠粒一步纯化后d7gcase的体积排除色谱(sizeexclusionchromatography，sec)。将从具有flag肽的flag珠粒上洗脱的蛋白质级分合并，并上样到superdex200柱上。通过280nm处的吸光度监测蛋白质。收集、浓缩对应于每个峰的级分，并通过sds-page分析。值得注意的是，峰1对应于单体gcase。[0059]图4是示出wtgcase(三角形，实线)和d7gcase(圆圈，虚线)的代表性米氏图(michaelis-mentenplots)的图。将底物转化为产物的速率(y轴)归一化为1μg/ml蛋白质。[0060]图5a示出了野生型(wt,seqidno:2)和变体d7、d13、d14和d15gcase(分别在seqidno:14、18、20和22中列出)的氨基酸序列。在每个序列中，酶的活性位点残基用下划线标出。由pross引入d7、d13、d14和d15gcase变体序列的所有突变都以粗体突出显示。[0061]图5b示出了野生型gcase(上面的序列，如seqidno:2所示)和pross设计的变体d15gcase(下面的序列，如seqidno:22所示)的氨基酸序列的比较。突变的氨基酸以粗体突出显示，对应于酶催化位点的氨基酸用下划线标出。[0062]图6示出了使用p-np-glc作为底物估计的变体d15gcase(空心圆圈)和(黑色圆圈)的比活性。测定活性的底物浓度：0.4、1.5和3mmp-np-glc。[0063]图7示出了野生型(wt,seqidno:2，包含如(赛诺菲健赞(sanofigzyme))提供的单个r495h突变)，野生型(wt,seqidno:25)和变体d7、d13、d14、d15和d16gcase(分别在seqidno:14、18、20和22中列出)的氨基酸序列。在每个序列中，酶的活性位点残基用下划线标出。由pross引入d7、d13、d14和d15gcase变体序列的所有突变都以粗体突出显示。[0064]本发明具体实施方式的描述[0065]本发明在其一些实施方式中涉及β-葡糖脑苷脂酶(β-glucocerebrosidase，gcase)的变体，更具体地但不排他地涉及其用于治疗β-葡糖脑苷脂酶缺乏症(包括戈谢病(gd))的用途。[0066]可以参考附图和所附的说明书来更好地理解本发明的原理和操作。[0067]在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解的是，本发明在其应用中不一定局限于以下描述中阐述的细节或由实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方式或者能够以各种方式实践或实现。而且，应当理解，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应当被认为是限制性的。[0068]gd是一种由β-葡萄糖脑苷脂酶(β-glucocerebrosidase，gcase)功能缺陷引起的no:25至少86％相同的氨基酸序列。[0084]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少88％相同的氨基酸序列。[0085]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少90％相同的氨基酸序列。[0086]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少95％相同的氨基酸序列。[0087]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少96％相同的氨基酸序列。[0088]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少97％相同的氨基酸序列。[0089]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少98％相同的氨基酸序列。[0090]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少99％相同的氨基酸序列。[0091]同源性(homology)(例如，同源性百分比(percenthomology)，序列同一性 序列相似性)可以使用计算双序列比对(pairwisesequencealignment)的任何同源性比较软件来进行确定。[0092]如本文所用，在上下文中两个核酸或多肽序列的“序列同一性(sequenceidentity)”或“同一性(identity)”包括指两个序列中比对时相同的残基。当序列同一性百分比用于指蛋白质时，认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列被认为具有“序列相似性(sequencesimilarity)”或“相似性(similarity)”。用于进行这种调整的方式(means)是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守取代作为部分错配而不是完全错配进行评分，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，当相同的氨基酸评分为1，而非保守取代评分为0时，保守取代的评分介于0-1之间。保守取代的评分是根据例如henikoffs和henikoffjg[来自蛋白质块的氨基酸取代矩阵(aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks)美国国家科学研究院期刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)1992,89(22):10915-9]。[0093]同一性(identity)(例如，同源性百分比(percenthomology))可以使用任何同源性比较软件来确定，包括例如，国家生物技术信息中心(nationalcenterofbiotechnologyinformation，ncbi)的blastn软件，例如通过使用默认参数来确定。[0094]根据本发明的一些实施方式，同一性是总体同一性(globalidentity)，即，本发明的整个氨基酸或核酸序列上的同一性，而不是其部分的同一性。[0095]根据本发明的一些实施方式，术语“同源性(homology)”或“同源的(homologous)”是指两个或多个核酸序列的同一性；或两个或多个氨基酸序列的同一性；或氨基酸序列与一个或多个核酸序列的同一性。[0096]根据本发明的一些实施方式，同源性是总体同源性(globalhomology)，即，本发明的整个氨基酸或核酸序列的同源性，而不是其部分的同源性。[0097]两个或多个序列之间的同源性或同一性的程度可以使用各种已知的序列比较工具来进行确定。下面是可以与本发明的一些实施方式一起使用的这种工具的非限制性描述。[0098]双序列全局比对(pairwiseglobalalignment)由s.b.needleman和c.d.wunsch,“(适用于寻找两种蛋白质的氨基酸序列相似性的一般方法(ageneralmethodapplicationstothesearchofsimilarityintheaminosequenceoftwoproteins))”,(分子生物学期刊(journalofmolecularbiology)),1970，第443-453页，第48卷)。[0099]当从多核苷酸序列开始并与其它多核苷酸序列比较时，可以使用emboss-6.0.1needleman-wunsch算法(可从emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/needle.html获得)。[0100]根据一些实施方式，同源性程度的确定还需要采用史密斯-沃特曼算法(smith-watermanalgorithm)(用于蛋白质-蛋白质比较或核苷酸-核苷酸比较)。[0101]根据本发明的一些实施方式，在对感兴趣的多肽或多核苷酸进行总体同源性(globalhomology)(例如，整个序列上的80％总体同源性)之前，对通过与感兴趣的多肽或多核苷酸的局部同源性预先选择的序列进行总体同源性(例如，超过60％序列长度的60％同一性)。例如，使用blast软件选择同源序列，第一阶段使用blastp和tblastn算法作为过滤器，第二阶段使用针(needle)(emboss程序包(embosspackage))或frame 算法比对。局部同一性(localidentity)(blast比对)的定义具有非常宽松的截止值-在60％序列长度的跨度上有60％的同一性，因为它仅用作总体比对阶段的过滤器。在该特定实施方式中(当使用局部同一性时)，不使用blast程序包包的默认过滤(通过设置参数“‑ff”)。在第二阶段中，基于与核心基因多肽序列至少80％的总体同一性来定义同源物。[0102]根据本发明的一些实施方式，gcase多肽的长度为470-520个氨基酸。[0103]根据本发明的一些实施方式，gcase多肽的长度为480-510个氨基酸。[0104]根据本发明的一些实施方式，gcase多肽的长度为490-510个氨基酸。[0105]根据本发明的一些实施方式，gcase多肽的长度为495-500个氨基酸。[0106]根据具体的实施方式，gcase多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列含有480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504或505个氨基酸残基。[0107]根据具体的实施方式，gcase多肽包含的氨基酸序列含有497个氨基酸残基。[0108]本文所用的术语“多肽(polypeptide)”包括修饰，所述修饰使得与天然gcase序列(即seqidno:2或seqidno:25)相比，多肽在动物或人体内高度表达、在体外(vitro)和体内(vivo)更稳定或更能渗透入细胞。[0109]这种修饰包括但不限于n末端修饰、c末端修饰、多肽键修饰、主链修饰和残基修饰。制备肽模拟物化合物的方法是本领域公知的，并且在例如定量药物设计(quantitativedrugdesign)，c.a.ramsdengd.，第17.2章，f.choplinpergamonpress(1992)中详细进行了说明，其通过引用并入本文中，如同在本文中完全阐述一样。下文提供了关于这一方面的进一步的细节。[0110]术语“分离的(isolated)”是指至少部分地与自然环境(例如，人体)分离。根据一个实施方式，分离的多肽基本上不含污染的细胞成分，例如碳水化合物、脂质或自然界中与多肽相关的其它蛋白质杂质。然而，术语“分离的”不排除以替代的物理形式存在相同的多肽，例如二聚体或替代的糖基化或衍生的形式。[0111]术语“氨基酸(aminoacid或aminoacids)”应理解为包括20种天然存在的氨基酸；那些通常在体内翻译后被修饰的氨基酸，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其它不寻常的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素(isodesmosine)、正缬氨酸(nor-valine)、正亮氨酸(nor-leucine)和鸟氨酸。[0112]根据一个实施方式，氨基酸是“等效氨基酸残基(equivalentaminoacidresidue)”。等效氨基酸残基是指能够取代多肽中的另一个氨基酸残基而基本上不改变多肽的结构和/或功能性(例如催化葡萄糖基神经酰胺/glccer的水解的能力)的氨基酸残基。因此，等效氨基酸具有相似的性质，如侧链的体积、侧链极性(极性或非极性)、疏水性(疏水性或亲水性)、ph(酸性、中性或碱性)和碳分子(芳香族/脂肪族)的侧链组织(sidechainorganization)。因此，“等效氨基酸残基”可以被认为是“保守性氨基酸置换(conservativeaminoacidsubstitutions)”。[0113]在术语“等效氨基酸置换(equivalentaminoacidsubstitution)”的含义内，一个氨基酸可以被下文所示的氨基酸组内的另一个氨基酸取代：[0114]i)具有极性侧链的氨基酸(asp、glu、lys、arg、his、asn、gln、ser、thr、tyr、cys)；[0115]ii)具有非极性侧链的氨基酸(gly、ala、val、leu、ile、phe、trp、pro、met)；[0116]iii)具有非极性脂肪族侧链的氨基酸(gly、ala、val、leu、ile)；[0117]iv)具有环状侧链的氨基酸(phe、tyr、trp、his、pro)；[0118]v)具有芳香族侧链的氨基酸(phe、tyr、trp)；[0119]vi)具有酸性侧链(acidicsidechains)的氨基酸(asp、glu)；[0120]vii)具有碱性侧链(basicsidechains)的氨基酸(lys、arg、his)；[0121]viii)具有酰胺侧链的氨基酸(asn、gln)；[0122]ix)具有羟基侧链的氨基酸(ser、thr)；[0123]x)具有含硫侧链的氨基酸(cys、met)；[0124]xi)中性，弱疏水性氨基酸(pro、ala、gly、ser、thr；[0125]xii)亲水性氨基酸(arg、asn、asp、glu、gln、his、lys、ser、thr、tyr)；[0126]xiii)疏水性氨基酸(ala、cys、gly、ile、leu、met、phe、pro、trp、val)；以及[0127]xiv)带电荷的氨基酸(arg、lys、asp、glu)。[0128]由于本发明的多肽被用于需要肽呈可溶性形式的治疗中，本发明一些实施方式的多肽优选包括一种或多种非天然或天然极性氨基酸，包括但不限于丝氨酸，由于其含羟基的侧链，其能够增加多肽的溶解度。[0129]根据一个具体的实施方式，与seqidno:2相比，gcase变体的氨基酸序列包含突变，例如取代(substitution)。[0130]根据一个具体的实施方式，与seqidno:25相比，gcase变体的氨基酸序列包含突变，例如取代。[0131]根据一个实施方式，突变在seqidno:25上。[0132]本发明一些实施方式的多肽可以包含本文所述的突变，只要修饰的区域不是催化结构域的一部分，例如不修饰形成活性位点(如上所述)的催化结构域的3d结构，或糖基化位点(如上所述)的3d结构，即seqidno:2或seqidno:25的3d结构。[0133]根据一个实施方式，gcase多肽在seqidno:2或seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含4-80、4-75、4-70、4-60、4-50、4-45、4-40、4-35、4-30、4-25、4-20、4-15、4-10、4-5、6-80、6-75、6-70、6-60、6-50、6-40、6-35、6-30、6-25、6-20、6-15、6-10、9-80、9-75、9-70、9-60、9-50、9-40、9-35、9-30、9-25、9-20、9-15、9-10、12-80、12-75、12-70、12-60、12-50、12-40、12-35、12-30、12-25、12-20、12-15、16-80、16-75、16-70、16-60、16-50、16-40、16-35、16-30、16-25、16-20、19-80、19-75、19-70、19-60、19-50、19-40、19-35、19-30、19-25、19-20、21-80、21-75、21-70、21-60、21-50、21-45、21-40、21-35、21-30、21-25、25-80、25-75、25-70、25-60、25-50、25-45、25-40、25-35、25-30、30-80、30-75、30-70、30-60、30-50、30-45、30-40、30-35、40-80、40-70、40-60、40-50、50-80、50-70、50-55、55-60、60-70或70-80个突变。[0134]根据一个实施方式，gcase多肽在seqidno:2或seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个突变。[0135]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含4个突变。[0136]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含9个突变。[0137]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含16个突变。[0138]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含15个突变。[0139]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含19个突变。[0140]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含18个突变。[0141]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含21个突变。[0142]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含20个突变。[0143]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含30个突变。[0144]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含29个突变。[0145]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含36个突变。[0146]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含35个突变。[0147]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含46个突变。[0148]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含45个突变。[0149]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含56个突变。[0150]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含55个突变。[0151]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含73个突变。[0152]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含72个突变。[0153]如上所述，本发明一些实施方式的gcase多肽包含突变l34p、k224n/g、t369e和n370d，其中坐标对应于seqidno:2。本领域技术人员可以通过手动进行的氨基酸序列比对或使用特定的生物信息学工具如fasta、l-align和蛋白blast来调整氨基酸坐标。[0154]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k或l372n，其中坐标对应于seqidno:2。[0155]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的两个：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k或l372n，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h145k/r和i204k；h145k/r和e222k；h145k/r和t334f/y/k；h145k/r和l372n；i204k和e222k；i204k和t334f/y/k；i204k和l372n；e222k和t334f/y/k；e222k和l372n；或t334f/y/k和l372n，其中坐标对应于seqidno:2。[0156]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的三个：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k或l372n，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h145k/r、i204k和e222k；h145k/r、i204k和t334f/y/k；h145k/r、i204k和l372n；h145k/r、e222k和t334f/y/k；h145k/r、e222k和l372n；h145k/r、t334f/y/k和l372n；i204k、e222k和t334f/y/k；i204k、e222k和l372n；i204k、t334f/y/k和l372n；或e222k、t334f/y/k和l372n，其中坐标对应于seqidno:2。[0157]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的四个：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k或l372n，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：i204k、e222k、t334f/y/k和l372n；h145k/r、e222k、t334f/y/k和l372n；h145k/r、i204k、t334f/y/k和l372n；h145k/r、i204k、e222k和l372n；或h145k/r、i204k、e222k和t334f/y/k，其中坐标对应于seqidno:2。[0158]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k和l372n，其中坐标对应于seqidno:2。[0159]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、h145k/r、i204k、e222k、k224n/g、t334f/y/k、t369e、n370d和l372n，其中坐标对应于seqidno:2。[0160]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0161]根据一个具体的实施方式，seqidno:2中的h495r修饰将seqidno:2的单个精氨酸(r)逆转为组氨酸(h)修饰(即，逆转为seqidno:25所示的wt序列)。[0162]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的两个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：n102d/e和l165q；n102d/e和q226t；n102d/e和l241i；n102d/e和s242p；n102d/e和k473w；n102d/e和h495r；l165q和q226t；l165q和l241i；l165q和s242p；l165q和k473w；l165q和h495r；q226t和l241i；q226t和s242p；q226t和k473w；q226t和h495r；l241i和s242p；l241i和k473w；l241i和h495r；s242p和k473w；s242p和h495r；或k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0163]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的三个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：n102d/e、l165q和q226t；n102d/e、l165q和l241i；n102d/e、l165q和s242p；n102d/e、l165q和k473w；n102d/e、l165q和h495r；n102d/e、q226t和l241i；n102d/e、q226t和s242p；n102d/e、q226t和k473w；n102d/e、q226t和h495r；n102d/e、l241i和s242p；n102d/e、l241i和k473w；n102d/e、l241i和h495r；n102d/e、s242p和k473w；n102d/e、s242p和h495r；n102d/e、k473w和h495r；l165q、q226t和l241i；l165q、q226t和s242p；l165q、q226t和k473w；l165q、q226t和h495r；l165q、l241i和s242p；l165q、l241i和k473w；l165q、l241i和h495r；l165q、s242p和k473w；l165q、s242p和h495r；l165q、k473w和h495r；q226t、l241i和s242p；q226t、l241i和k473w；q226t、l241i和h495r；q226t、s242p和k473w；q226t、s242p和h495r；l241i、s242p和k473w；l241i、s242p和h495r；或s242p,k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0164]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的四个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：n102d/e、l165q、q226t和l241i；n102d/e、l165q、q226t和s242p；n102d/e、l165q、q226t和k473w；n102d/e、l165q、q226t和h495r；n102d/e、q226t、l241i和s242p；n102d/e、q226t、l241i和k473w；n102d/e、q226t、l241i和h495r；n102d/e、l241i、s242p和k473w；n102d/e、l241i、s242p和h495r；n102d/e、s242p、k473w和h495r；l165q、q226t、l241i和s242p；l165q、q226t、l241i和k473w；l165q、q226t、l241i和h495r；l165q、l241i、s242p和k473w；l165q、l241i、s242p和h495r；l165q、s242p、k473w和h495r；q226t、l241i、s242p和k473w；q226t、l241i、s242p和h495r；或l241i、s242p、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0165]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的五个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：n102d/e、q226t、l241i、s242p和k473w；n102d/e、q226t、l241i、s242p和h495r；n102d/e、q226t、l241i、k473w和h495r；n102d/e、q226t、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l241i、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l165q、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l165q、l241i、k473w和h495r；n102d/e、l165q、l241i、s242p和h495r；n102d/e、l165q、l241i、s242p和k473w；n102d/e、l165q、q226t、k473w和h495r；n102d/e、l165q、q226t、s242p和h495r；n102d、l165q、q226t、s242p和k473w；n102d、l165q、q226t、l241i和h495r；n102d/e、l165q、q226t、l241i和k473w；q226t、l241i、s242p、k473w和h495r；l165q、l241i、s242p、k473w和h495r；l165q、q226t、s242p、k473w和h495r；l165q、q226t、l241i、k473w和h495r；l165q、q226t、l241i、s242p和h495r；或l165q,q226t、l241i、s242p和k473w，其中坐标对应于seqidno:2。[0166]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的六个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：n102d/e、q226t、l241i、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l165q、l241i、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l165q、q226t、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l165q、q226t、l241i、k473w和h495r；n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p和h495r；n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p和k473w；或l165q、q226t、l241i、s242p、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0167]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0168]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、n102d/e、h145k/r、l165q、i204k、e222k、k224n/g、q226t、l241i、s242p、t334f/y/k、t369e、n370d、l372n、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0169]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：i130t、a168s或d263n，其中坐标对应于seqidno:2。[0170]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的两个：i130t、a168s或d263n，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：i130t和a168s；i130t和d263n；或a168s和d263n，其中坐标对应于seqidno:2。[0171]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：i130t、a168s和d263n，其中坐标对应于seqidno:2。[0172]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、n102d/e、i130t、h145k/r、l165q、a168s、i204k、e222k、k224n/g、q226t、l241i、s242p、d263n、t334f/y/k、t369e、n370d、l372n、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0173]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：r211n或k303r，其中坐标对应于seqidno:2。[0174]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的两个：r211n和k303r，其中坐标对应于seqidno:2。[0175]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、n102d/e、i130t、h145k/r、l165q、a168s、i204k、r211n、e222k、k224n/g、q226t、l241i、s242p、d263n、k303r、t334f/y/k、t369e、n370d、l372n、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0176]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0177]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的两个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h60w和l103n/e/r；h60w和q166a；h60w和h274r；h60w和n333d；h60w和n386d；h60w和r395k；h60w和i406t/a；h60w和l420m/i；l103n/e/r和q166a；l103n/e/r和h274r；l103n/e/r和n333d；l103n/e/r和n386d；l103n/e/r和r395k；l103n/e/r和i406t/a；l103n/e/r和l420m/i；q166a和h274r；q166a和n333d；q166a和n386d；q166a和r395k；q166a和i406t/a；q166a和l420m/i；h274r和n333d；h274r和n386d；h274r和r395k；h274r和i406t/a；h274r和l420m/i；n333d和n386d；n333d和r395k；n333d和i406t/a；n333d和l420m/i；n386d和r395k；n386d和i406t/a；n386d和l420m/i；r395k和i406t/a；r395k和l420m/i；或i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0178]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的三个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h60w、l103n/e/r和q166a；h60w、l103n/e/r和h274r；h60w、l103n/e/r和n333d；h60w、l103n/e/r和n386d；h60w、l103n/e/r和r395k；h60w、l103n/e/r和i406t/a；h60w、l103n/e/r和l420m/i；h60w、q166a和h274r；h60w、q166a和n333d；h60w、q166a和n386d；h60w、q166a和r395k；h60w、q166a和i406t/a；h60w、q166a和l420m/i；h60w、h274r和n333d；h60w、h274r和n386d；h60w、h274r和r395k；h60w、h274r和i406t/a；h60w、h274r和l420m/i；h60w、n333d和n386d；h60w、n333d和r395k；h60w、n333d和i406t/a；h60w、n333d和l420m/i；h60w、n386d和r395k；h60w、n386d和i406t/a；h60w、n386d和l420m/i；h60w、r395k和i406t/a；h60w、r395k和l420m/i；h60w、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a和h274r；l103n/e/r、q166a和n333d；l103n/e/r、q166a和n386d；l103n/e/r、q166a和r395k；l103n/e/r、q166a和i406t/a；l103n/e/r、q166a和l420m/i；l103n/e/r、h274r和n333d；l103n/e/r、h274r和n386d；l103n/e/r、h274r和r395k；l103n/e/r、h274r和i406t/a；l103n/e/r、h274r和l420m/i；l103n/e/r、n333d和n386d；l103n/e/r、n333d和r395k；l103n/e/r、n333d和i406t/a；l103n/e/r、n333d和l420m/i；l103n/e/r、n386d和r395k；l103n/e/r、n386d和i406t/a；l103n/e/r、n386d和l420m/i；l103n/e/r、r395k和i406t/a；l103n/e/r、r395k和l420m/i；l103n/e/r、i406t/a和l420m/i；q166a、h274r和n333d；q166a、h274r和n386d；q166a、h274r和r395k；q166a、h274r和i406t/a；q166a、h274r和l420m/i；q166a、n333d和n386d；q166a、n333d和r395k；q166a、n333d和i406t/a；q166a、n333d和l420m/i；q166a、n386d和r395k；q166a、n386d和i406t/a；q166a、n386d和l420m/i；q166a、r395k和i406t/a；q166a、r395k和l420m/i；h274r,n333d和n386d；h274r、n333d和r395k；h274r、n333d和i406t/a；h274r,n333d和l420m/i；h274r、n386d和r395k；h274r、n386d和i406t/a；h274r、n386d和l420m/i；h274r、r395k和i406t/a；h274r、r395k和l420m/i；h274r、i406t/aa和l420m/i；n333d、n386d和r395k；n333d、n386d和i406t/aa；n333d、n386d和l420m/i；n333d、r395k和i406t/a；n333d、r395k和l420m/i；n333d、i406t/a和l420m/i；n386d、r395k和i406t/aa；n386d、r395k和l420m/i；n386d、i406t/aa和l420m/i；或r395k、i406t/aa和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0179]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的四个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h60w、l103n/e/r、q166a和h274r；h60w、l103n/e/r、q166a和n333d；h60w、l103n/e/r、q166a和n386d；h60w、l103n/e/r、q166a和r395k；h60w、l103n/e/r、q166a和i406t/a；h60w、l103n/e/r、q166a和l420m/i；h60w、q166a、h274r和n333d；h60w、q166a、h274r和n386d；h60w、q166a、h274r和r395k；h60w、q166a、h274r和i406t/a；h60w、q166a、h274r和l420m/i；h60w、q166a、n333d和n386d；h60w、q166a、n333d和r395k；h60w、q166a、n333d和i406t/a；h60w、q166a、n333d和l420m/i；h60w、q166a、n386d和r395k；h60w、q166a、n386d和i406t/a；h60w、q166a、n386d和l420m/i；h60w、q166a、r395k和i406t/a；h60w、q166a、r395k和l420m/i；h60w、q166a、i406t/a和l420m/i；h60w、h274r、n333d和n386d；h60w、h274r、n333d和r395k；h60w、h274r、n333d和i406t/a；h60w、h274r、n333d和l420m/i；h60w、n333d、n386d和r395k；h60w、n333d、n386d和i406t/a；h60w、n333d、n386d和l420m/i；h60w、n386d、r395k和i406t/a；h60w、n386d、r395k和l420m/i；h60w、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r和n333d；l103n/e/r、q166a、h274r和n386d；l103n/e/r、q166a、h274r和r395k；l103n/e/r、q166a、h274r和i406t/a；l103n/e/r、q166a、h274r和l420m/i；l103n/e/r、h274r、n333d和n386d；l103n/e/r、h274r、n333d和r395k；l103n/e/r、h274r、n333d和i406t/a；l103n/e/r、h274r、n333d和l420m/i；l103n/e/r、n333d、n386d和r395k；l103n/e/r、n333d、n386d和i406t/a；l103n/e/r、n333d、n386d和l420m/i；l103n/e/r、n386d、r395k和i406t/a；l103n/e/r、n386d、r395k和l420m/i；l103n/e/r、r395k、i406t/a和l420m/i；或n386d、r395k、i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0180]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的五个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r和n333d；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r和n386d；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r和r395k；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r和i406t/a；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r和l420m/i；h60w、q166a、h274r、n333d和n386d；h60w、q166a、h274r、n333d和r395k；h60w、q166a、h274r、n333d和i406t/a；h60w、q166a、h274r、n333d和l420m/i；h60w、h274r、n333d、n386d和r395k；h60w、h274r、n333d、n386d和i406t/a；h60w、h274r、n333d、n386d和l420m/i；h60w、n333d、n386d、r395k和i406t/a；h60w、n333d、n386d、r395k和l420m/i；h60w、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和n386d；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和r395k；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和i406t/a；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和l420m/i；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d和r395k；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d和i406t/a；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d和l420m/i；l103n/e/r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；l103n/e/r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；l103n/e/r、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；q166a、h274r、n333d、n386d和r395k；q166a、h274r、n333d、n386d和i406t/a；q166a、h274r、n333d、n386d和l420m/i；q166a、n333d、n386d、r395k和i406t/a；q166a、n333d、n386d、r395k和l420m/i；q166a、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；或n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0181]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的六个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可以进一步包含突变：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和n386d；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和r395k；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和i406t/a；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和l420m/i；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d和r395k；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d和i406t/a；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d和l420m/i；h60w、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；h60w、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；h60w、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和r395k；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和i406t/a；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和l420m/i；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；l103n/e/r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；或h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0182]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的七个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和r395k；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和i406t/a；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和l420m/i；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；h60w、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；或q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0183]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的八个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/aa，其中坐标对应于seqidno:2。[0184]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0185]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个：：l34p、h60w、n102d、l103n、i130t、h145k/r、l165q、q166a、a168s、i204k、r211n、e222k、k224n、q226t、l241i、s242p、d263n、h274r、k303r、n333d、t334f/y、t369e、n370d、l372n、n386d、r395k、i406t、l420m、k473w、h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0186]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、h60w、n102d、l103n、i130t、h145k/r、l165q、q166a、a168s、i204k、r211n、e222k、k224n、q226t、l241i、s242p、d263n、h274r、k303r、n333d、t334f/y、t369e、n370d、l372n、n386d、r395k、i406t、l420m、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0187]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：v78i、a95k、v191m、a322d、v343t、m361e、s364a、h374w、t410e、h451n或l480i，其中坐标对应于seqidno:2。[0188]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个：v78i、a95k、v191m、a322d、v343t、m361e、s364a、h374w、t410e、h451n或l480i，其中坐标对应于seqidno:2。[0189]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：v78i、a95k、v191m、a322d、v343t、m361e、s364a、h374w、t410e、h451n和l480i，其中坐标对应于seqidno:2。[0190]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个：l34p、h60w、v78i、a95k、n102e、l103e、i130t、h145k/r、l165q、q166a、a168s、v191m、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、a322d、t334k、v343t、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、i406a、t410e、l420i、h451n、k473w、l480i和/或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0191]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、h60w、v78i、a95k、n102e、l103e、i130t、h145k/r、l165q、q166a、a168s、v191m、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、a322d、t334k、v343t、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、i406a、t410e、l420i、h451n、k473w、l480i和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0192]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：h162k、s181a、t297s、m335f、k346h、s431a、s465d或a476d，其中坐标对应于seqidno:2。[0193]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少2、3、4、5、6或7个：h162k、s181a、t297s、m335f、k346h、s431a、s465d或a476d，其中坐标对应于seqidno:2。[0194]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：h162k、s181a、t297s、m335f、k346h、s431a、s465d和a476d，其中坐标对应于seqidno:2。[0195]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个：l34p、h60w、v78i、a95k、n102e、l103e、i130t、h145k/r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、v191m、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t297s、a322d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、n386d、r395k、i406a、t410e、l420i、s431a、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i和/或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0196]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、h60w、v78i、a95k、n102e、l103e、i130t、h145k/r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、v191m、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t297s、a322d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、n386d、r395k、i406a、t410e、l420i、s431a、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0197]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：r47k、l51r、q70h、l91i、g115e、a124g、d140n/g、s196t或v437s，其中坐标对应于seqidno:2。[0198]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少2、3、4、5、6、7或8个：r47k、l51r、q70h、l91i、g115e、a124g、d140n/g、s196t或v437s，其中坐标对应于seqidno:2。[0199]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：r47k、l51r、q70h、l91i、g115e、a124g、d140n/g、s196t和v437s，其中坐标对应于seqidno:2。[0200]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55个：l34p、r47k、l51r、h60w、q70h、v78i、l91i、a95k、n102e、l103e、g115e、a124g、i130t、d140n/g、h145k/r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、v191m、s196t、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t297s、a322d、n333d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、n386d、r395k、i406a、t410e、l420m、s431a、v437s、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i和/或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0201]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、r47k、l51r、h60w、q70h、v78i、l91i、a95k、n102e、l103e、g115e、a124g、i130t、d140n/g、h145k/r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、v191m、s196t、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t297s、a322d、n333d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、n386d、r395k、i406a、t410e、l420m、s431a、v437s、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0202]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：t36q、s38a、q143e、t183a、l185m、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、e300r、k321e、v376t、k408r、q440e、m450q和/或i483v，其中坐标对应于seqidno:2。[0203]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个：t36q、s38a、q143e、t183a、l185m、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、e300r、k321e、v376t、k408r、q440e、m450q和/或i483v，其中坐标对应于seqidno:2。[0204]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：t36q、s38a、q143e、t183a、l185m、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、e300r、k321e、v376t、k408r、q440e、m450q和/或i483v，其中坐标对应于seqidno:2。[0205]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72个：l34p、t36q、s38a、r47k、l51r、h60w、q70h、v78i、l91i、a95k、n102e、l103r、g115e、a124g、i130t、d140g、q143e、h145r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、t183a、l185m、v191m、s196t、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、t297s、e300r、k321e、a322d、n333d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、v376t、n386d、r395k、i406a、k408r、t410e、l420m、s431a、v437s、q440e、m450q、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i、i483v和h495r，其中坐标对应于seqidno:2，其中坐标对应于seqidno:2。[0206]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、t36q、s38a、r47k、l51r、h60w、q70h、v78i、l91i、a95k、n102e、l103r、g115e、a124g、i130t、d140g、q143e、h145r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、t183a、l185m、v191m、s196t、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、t297s、e300r、k321e、a322d、n333d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、v376t、n386d、r395k、i406a、k408r、t410e、l420m、s431a、v437s、q440e、m450q、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i、i483v和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0207]如上所述，酶的催化结构域的氨基酸未被修饰。[0208]根据一个实施方式，gcase多肽的坐标：d127、f128、w179、n234、e235、y244、f246、q284、y313、e340、s345、w381、n396处的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸未被修饰，其中坐标对应于seqidno:2。[0209]根据一个实施方式，gcase多肽的所有下列坐标：d127、f128、w179、n234、e235、y244、f246、q284、y313、e340、s345、w381、n396处的氨基酸未被修饰，其中坐标对应于seqidno:2。[0210]根据一个实施方式，gcase多肽包含与选自seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22和27的序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。这种测定可以使用例如ncbi的标准蛋白-蛋白blast(standardprotein-proteinblast)[blastp]软件进行。[0211]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少85％相同的氨基酸序列。[0212]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少90％相同的氨基酸序列。[0213]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少95％相同的氨基酸序列。[0214]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少96％相同的氨基酸序列。[0215]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少97％相同的氨基酸序列。[0216]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少98％相同的氨基酸序列。[0217]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少99％相同的氨基酸序列。[0218]根据一个实施方式，gcase多肽包含与选自由seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27组成的组的序列相同的氨基酸序列。[0219]根据一个实施方式，gcase多肽包含与seqidno:14至少95％相同的氨基酸序列。[0220]根据一个实施方式，gcase多肽包含seqidno:14所示的氨基酸序列。[0221]根据一个实施方式，gcase多肽包含与seqidno:22至少95％相同的氨基酸序列。[0222]根据一个实施方式，gcase多肽包含seqidno:22所示的氨基酸序列。[0223]根据一个实施方式，gcase多肽包含与seqidno:27至少95％相同的氨基酸序列。[0224]根据一个实施方式，gcase多肽包含seqidno:27所示的氨基酸序列。[0225]本发明一些实施方式的多肽可以通过多肽合成领域技术人员已知的任何技术来合成。根据一个实施方式，可以使用重组dna技术合成本发明的多肽。[0226]优选使用重组技术来产生本发明的多肽。这种重组技术描述于以下文献中：bitter等人,(1987)酶学方法(methodsinenzymol)153:516-544；studier等人，(1990)酶学方法(methodsinenzymol)185:60-89；brisson等人，(1984)自然(nature)310:511-514；takamatsu等人，(1987)欧洲分子生物学学会杂志(emboj.)6:307-311；coruzzi等人(1984)欧洲分子生物学学会杂志(emboj.)3:1671-1680和brogli等人(1984)科学(science)224:838-843；gurley等人(1986)分子细胞生物学(mol.cell.biol.)6:559-565，和weissbach&weissbach,1988,植物分子生物学方法(methodsforplantmolecularbiology)，学术出版社(academicpress)纽约,第viii章，第421-463页。[0227]为了使用重组技术生产本发明的多肽，将编码本发明多肽的多核苷酸连接到核酸表达构建体中，所述核酸表达构建体包括在顺式调节(cis-regulatory)(例如，启动子)序列的转录控制下的多核苷酸序列，所述顺式调节(例如，启动子)序列适于在宿主细胞中指导组成型或诱导型转录，如下文进一步描述。[0228]本教导还提供了编码基因修饰的人gcase多肽的核酸序列。[0229]如本文所用，短语“分离的多核苷酸(anisolatedpolynucleotide)”是指以rna序列、互补多核苷酸序列(complementarypolynucleotidesequence，cdna)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，上述序列的组合)的形式分离和提供的单链或双链核酸序列。[0230]用于表达本发明多肽的示例性多核苷酸序列如seqidnos:3、5、7、9、11、13、17、19、21、23或26所示。[0231]除了包含插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件之外，本发明的表达构建体还可以包括经工程改造以增强所表达的多肽的稳定性、生产、纯化、产量或降低的毒性的序列(即标签)。这样的融合蛋白可以被设计成使得该融合蛋白可以容易地通过亲和层析分离；例如，通过固定在对外源蛋白(heterologousprotein)特异性的柱上。当在肽部分和外源蛋白之间设计切割位点时，可以通过用适当的酶或试剂处理而将肽从色谱柱中释放出来[例如，参见booth等人，(1988)免疫学通讯(immunol.lett.)19:65-70；和gardella等人，(1990)生物化学杂志(j.biol.chem.)265:15854-15859]。[0232]各种原核或真核细胞可用作宿主表达系统以表达多肽编码序列。[0233]原核细胞包括但不限于微生物，例如用含有多肽编码序列的重组噬菌体dna、质粒dna或粘粒dna表达载体转化的细菌。[0234]真核细胞包括真核生物的任何细胞，包括但不限于单细胞和多细胞生物。单细胞真核生物包括但不限于酵母、原生动物、粘菌(slimemolds)和藻类。多细胞真核生物包括但不限于动物(例如哺乳动物、昆虫、无脊椎动物、线虫、鸟类、鱼类、爬行动物和甲壳类动物)、植物、真菌和藻类(例如褐藻、红藻、绿藻)。[0235]根据一个实施方式，细胞是植物细胞。[0236]植物细胞可以来源于任何植物组织，例如果实、花、根、叶、胚胎、胚胎细胞悬浮液、愈伤组织或幼苗组织。[0237]根据一个实施方式，真核细胞不是植物的细胞。[0238]根据一个实施方式，真核细胞是动物细胞。[0239]根据一个实施方式，真核细胞是脊椎动物的细胞。[0240]根据一个实施方式，真核细胞是无脊椎动物的细胞。[0241]根据一个具体的实施方式，无脊椎动物细胞是昆虫、蜗牛、蛤(clam)、章鱼、海星(starfish)、海胆、水母和蠕虫的细胞。[0242]根据一个具体的实施方式，无脊椎动物细胞是甲壳类动物的细胞。示例性甲壳类动物包括但不限于虾(shrimps)、明虾(prawns)、蟹、龙虾(lobsters)和螯虾(crayfishes)。[0243]根据一个具体的实施方式，无脊椎动物细胞是鱼的细胞。示例性的鱼包括但不限于鲑鱼、金枪鱼、鳕鱼(绿青鳕)、鲶鱼(catfish)、鳕鱼(cod)、黑线鳕(haddock)、海鲈鱼(seabass)、罗非鱼(tilapia)、北极碳鱼(arcticchar)和鲤鱼(carp)。[0244]哺乳动物表达系统也可用于表达本发明的多肽。能够糖基化gcase多肽的细胞系统是有利的。[0245]根据一个实施方式，真核细胞是哺乳动物细胞。[0246]根据一个具体的实施方式，哺乳动物细胞是非人类生物体的细胞，例如但不限于啮齿动物、兔、猪、山羊、反刍动物(例如牛、绵羊、羚(antelope)、鹿和长颈鹿)、狗、猫、马和非人类灵长类动物。[0247]根据一个具体的实施方式，真核细胞是人类的细胞。[0248]根据一个实施方式，真核细胞是原代细胞、细胞系、体细胞、生殖细胞、干细胞、胚胎干细胞、成年干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell，ips)、配子细胞(gametecell)、合子细胞(zygotecell)、囊胚细胞(blastocystcell)、胚胎(embryo)、胎儿和/或供体细胞。[0249]根据一个具体的实施方式，所述细胞是人类胚胎细胞。[0250]根据一个具体的实施方式，所述细胞是人类胚胎肾细胞。[0251]根据一个具体的实施方式，所述细胞是hek293t细胞。[0252]根据一个具体的实施方式，细胞能够进行蛋白质糖基化(即修饰的人gcase)。[0253]可以用含有多肽编码序列的重组表达载体来转化真核细胞。例如，用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，camv；烟草花叶病毒，tmv)或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体如ti质粒进行转化。[0254]在任何情况下，转化的细胞在有效条件下培养，这允许表达大量的重组多肽。有效的培养条件包括但不限于允许蛋白质生产的有效培养基、生物反应器、温度、ph和氧气条件。有效的培养基是指在其中培养细胞以产生本发明的重组多肽的任何培养基。这种培养基通常包括具有可同化的碳、氮和磷酸盐源以及适当的盐、矿物质、金属和其它营养物如维生素的水溶液。本发明的细胞可以在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿(microtiterdishes)和培养皿中培养。培养可以在适合重组细胞的温度、ph和氧含量下进行。这种培养条件在本领域普通技术人员的专业知识范围内。[0255]根据用于生产的载体和宿主系统，本发明的所得蛋白可以保留在重组细胞内；被分泌到发酵培养基中；被分泌到两个细胞膜之间的空间中，例如大肠杆菌中的周质空间；或保留在细胞或病毒膜的外表面上。[0256]与野生型人gcase相比，本发明一些实施方式的gcase多肽被赋予了来自细胞(例如，上述宿主表达系统)的更高表达水平和/或更高的分泌水平。[0257]术语“野生型(wild-type)”是指人葡糖神经酰胺酶(humanglucosylceramidase)(人gcase(humangcase))，例如seqidno:2或seqidno:25所示。[0258]根据一个实施方式，与野生型人gcase(例如，在相同的培养条件下)相比，更高的表达水平和/或更高的分泌水平为约5-25％、10-50％、10-100％、20-90％、25-75％、30-80％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、90-99％或95-100％。[0259]根据一个实施方式，与野生型人gcase(例如，在相同的培养条件下)相比，更高的表达水平和/或更高的分泌水平为约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。[0260]根据一个实施方式，如下所述，与相同培养条件下的野生型人gcase(例如来自hek293t细胞)相比，gcase多肽在真核细胞中包含约1.3-5倍(例如3倍)高的细胞内表达水平。[0261]根据一个实施方式，如下所述，与在相同培养条件下不分泌的野生型gcase相比，gcase多肽是从真核细胞(例如，从hek293t细胞)分泌的。[0262]下面讨论评估表达水平的方法。[0263]培养一定时间后，进行重组蛋白的回收。短语“回收重组蛋白(recoveringtherecombinantprotein)”是指收集含有该蛋白的整个发酵培养基，并且不需要另外的分离或纯化步骤。本发明的蛋白质可以使用多种标准蛋白质纯化技术来纯化，例如但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、伴刀豆球蛋白a层析、层析聚焦和差异溶解(differentialsolubilization)。[0264]不管生产gcase变体多肽的方法如何，经基因修饰的人gcase保持人gcase的催化活性。此外，经基因修饰的人gcase包括增加的热稳定性。较高的表达水平和热稳定性以及gcase多肽的持续催化活性有利于酶替代疗法(ert)，特别是有利于戈谢病的治疗(下文讨论)。[0265]如以下实施例部分所讨论的(参见以下实施例4、7和10)，gcase变体d7、d15和d16在分别与野生型gcase和相比时具有相当的酶活性(参见以下表2、4和6)。[0266]根据一个实施方式，gcase多肽在相同条件(即相同的实验条件，例如相同的缓冲液、温度、ph等)下能够类似于野生型gcase催化glccer的水解。[0267]根据一个实施方式，gcase多肽能够以至少约0.1至2.5×106kcat/km(m-1min-1)(例如，0.15至2.0×106kcat/km(m-1min-1))，催化glccer，例如人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)的水解。[0268]根据一个实施方式，gcase多肽能够以至少约0.1×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer，例如人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)的水解。[0269]根据一个实施方式，gcase多肽能够以至少约0.2×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer，例如人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)的水解。[0270]根据一个实施方式，gcase多肽能够以至少约0.3×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer，例如人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)的水解。[0271]根据一个实施方式，gcase多肽能够以至少约0.5×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer，例如人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)的水解。[0272]根据一个具体的实施方式，gcase多肽能够以至少约1.0×106kcat/km(m-1min-1)催化p-np-glc的水解。[0273]根据一个具体的实施方式，gcase多肽能够以至少约1.5×106kcat/km(m-1min-1)催化p-np-glc的水解。[0274]根据一个具体的实施方式，gcase多肽能够以至少约1.6×106kcat/km(m-1min-1)催化p-np-glc的水解。[0275]根据一个具体的实施方式，gcase多肽能够以至少约1.7×106kcat/km(m-1min-1)催化p-np-glc的水解。[0276]根据一个具体的实施方式，gcase多肽能够以至少约1.8×106kcat/km(m-1min-1)催化p-np-glc的水解。[0277]测量本文所述的gcase多肽的催化效率的方法是本领域已知的，包括例如原位活性测定(使用例如施加在含有活性酶的细胞上的底物)、体外活性测定(其中在从细胞提取的蛋白质混合物中测量特定酶的活性)。例如，可以使用对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(β-np-glc)作为底物进行酶活性测定[在weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299-308中讨论，通过引用并入本文]。[0278]如在以下实施例部分所讨论的(参见以下实施例3、6和9)，与野生型gcase和gcase变体d7、d15和d16具有更高的热稳定性。具体地，在ph6.1下，d7gcase显示出比野生型gcase高约6-7℃的热稳定性，比(参见下表1)高约11℃的热稳定性。在相同ph水平下，d15gcase显示出比野生型gcase高约12-13℃的热稳定性，比(参见下表1和3)高约17℃的热稳定性。类似地，d16gcase显示出比高约19℃的显著增加的热稳定性(参见下表5)。[0279]根据一个实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽显示出比野生型多肽高约3-22℃(例如15-22℃、10-20℃、5-15℃、7-13℃、9-11℃)温度范围的热稳定性。[0280]相对于野生型多肽，术语“热稳定性(thermalstability)”或“增加的热稳定性(increasedthermalstability)”是指gcase多肽具有增加的热稳定性，即抵抗随着温度的升高而变性的能力。量化热稳定性的标准技术是本领域已知的，包括但不限于圆二色性、差示扫描量热法和表面等离子体共振。[0281]测量本文所述的gcase多肽的热稳定性的方法是本领域已知的，包括，例如，如weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299-308中所讨论的酶稳定性测定(通过引用并入本文)。[0282]根据一个实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃的热稳定性。[0283]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约5℃的热稳定性。[0284]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约7℃的热稳定性。[0285]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约9℃的热稳定性。[0286]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约11℃的热稳定性。[0287]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约13℃的热稳定性。[0288]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约15℃的热稳定性。[0289]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约17℃的热稳定性。[0290]根据一个实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽显示出比多肽高约3-22℃(例如15-22℃、10-20℃、5-15℃、7-13℃、9-11℃)温度范围的热稳定性。[0291]术语也称为伊米苷酶(imiglucerase)，是一种用于酶替代疗法的商业药物。[0292]根据一个实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃的热稳定性。[0293]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约5℃的热稳定性。[0294]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约7℃的热稳定性。[0295]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约9℃的热稳定性。[0296]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约11℃的热稳定性。[0297]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约13℃的热稳定性。[0298]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约15℃的热稳定性。[0299]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约17℃的热稳定性。[0300]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约19℃的热稳定性。[0301]根据一个实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽显示出比多肽高约15-22℃(例如17-23℃、19-23℃)温度范围的热稳定性。[0302]根据一个实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃的热稳定性。[0303]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约15℃的热稳定性。[0304]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约17℃的热稳定性。[0305]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约20℃的热稳定性。[0306]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约22℃的热稳定性。[0307]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约25℃的热稳定性。[0308]如上所述，gcase多肽在真核细胞高度表达和分泌。在真核细胞中的表达能够使gcase糖基化，这对于gcase活性是至关重要的。[0309]根据另一个实施方式，与在相同培养条件下不分泌的野生型多肽相比，gcase多肽是从真核细胞中分泌的。[0310]根据一个实施方式，在相同培养条件下，从真核细胞(例如hek293t细胞)分泌的gcase多肽比野生型gcase高约1.5-10倍(例如，约1.5-2倍、约2-3倍、约3-4倍、约4-5倍、约5-6倍、约6-7倍、约8-9倍、约9-10倍)。[0311]根据一个实施方式，在相同培养条件下，从真核细胞(例如hek293t细胞)分泌的gcase多肽比野生型gcase高约3倍。[0312]根据一个实施方式，在相同培养条件下，从真核细胞(例如hek293t细胞)分泌的gcase多肽比野生型gcase高约5倍。[0313]根据一个实施方式，在相同培养条件下，从真核细胞(例如hek293t细胞)分泌的gcase多肽比野生型gcase高约10倍。[0314]根据一个实施方式，在相同培养条件下(例如，来自hek293t细胞)，gcase多肽在真核细胞中具有比野生型gcase高约1.3-5倍(例如，约1.3-2倍、约1.3-3倍、约2-3倍、约2-4倍、约3-4倍、约4-5倍)的细胞内表达水平。[0315]根据一个实施方式，在相同培养条件下，gcase多肽在真核细胞中具有比野生型gcase高约1.3倍的细胞内表达水平。[0316]根据一个实施方式，在相同培养条件下(例如，来自hek293t细胞)，gcase多肽在真核细胞中具有比野生型gcase高约2倍的细胞内表达水平。[0317]根据一个实施方式，在相同培养条件下(例如，来自hek293t细胞)，gcase多肽在真核细胞中具有比野生型gcase高约3倍的细胞内表达水平。[0318]根据一个实施方式，在相同培养条件下(例如，来自hek293t细胞)，gcase多肽在真核细胞中具有比野生型gcase高约4倍的细胞内表达水平。[0319]如本文所用，短语“表达水平(levelofexpression或expressionlevel)”是指生物样本(例如真核细胞)中基因表达和/或基因产物活性的程度。[0320]应当注意，表达水平可以以任意绝对单位或归一化单位(相对于对照参考的已知表达水平)来确定。[0321]根据一个实施方式，在相同培养条件下，来自真核细胞的gcase多肽的分泌水平可比野生型多肽的分泌水平高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。[0322]根据一个实施方式，在相同培养条件下，真核细胞中gcase多肽的细胞内表达水平可比野生型多肽的细胞内表达水平可高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。[0323]根据具体的实施方式，使用rna和/或蛋白质检测方法测定表达量。[0324]检测细胞中rna表达水平的方法的非限制性示例包括印迹分析(northernblotanalysis)、rt-pcr分析、rna原位杂交染色和原位rt-pcr染色。[0325]检测细胞中特定蛋白质分子的水平和/或活性的方法的非限制性示例包括酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)、蛋白质印迹分析(westernblotanalysis)、免疫沉淀反应(immunoprecipitation，ip)、放射免疫测定(radio-immunoassay，ria)、荧光激活细胞分选(fluorescenceactivatedcellsorting，facs)、免疫组化分析(immunohistochemicalanalysis)、原位活性测定(insituactivityassay)(使用例如施加在含有活性酶的细胞上的底物)。体外活性测定(invitroactivityassays)(其中在从细胞中提取的蛋白质混合物中测量特定酶的活性)和基于分子量的方法。在需要检测分泌蛋白的表达水平的情况下，可以在培养细胞的细胞培养基(即含有细胞分泌内容物的细胞培养基)上进行elisa测定。[0326]根据一个实施方式，提供了包含至少一种外源多核苷酸或构建体(如上所述)的分离的细胞。[0327]根据一个实施方式，分离的细胞是真核细胞(如上所述)。[0328]本发明一些实施方式的经基因修饰的人gcase，一些实施方式的分离的多核苷酸，一些实施方式的构建体，或本发明一些实施方式的细胞，可以施用于生物体本身，或在与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物中施用。[0329]本文所用，“药物组合物(pharmaceuticalcomposition)”是指本文所述的一种或多种活性成分与其它化学成分如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。[0330]本文中，术语“活性成分(activeingredient)”是指负责生物效应的经基因修饰的人gcase。[0331]下文中，短语“生理学上可接受的载体(physiologicallyacceptablecarrier)”和“药学上可接受的载体(pharmaceuticallyacceptablecarrier)”可以互换使用，是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。在这些短语中包括佐剂。[0332]本文中，术语“赋形剂(excipient)”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的惰性物质。赋形剂的示例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。[0333]可以在以下文献中找到药物的配制和给药技术：“雷明登氏药学全书(remington'spharmaceuticalsciences)”，麦克出版公司(mackpublishingco.)，easton,pa，最新版，其通过引用并入本文。[0334]合适的给药途径可以例如包括口服、直肠、经粘膜，特别是经鼻、肠或肠胃外给药，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内，例如进入右室腔或左心室腔，进入普通冠状动脉、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。[0335]用于药物递送至中枢神经系统(centralnervoussystem，cns)的常规方法包括：神经外科策略(例如，脑内注射或脑室内输注)；试图利用bbb的内源性转运途径之一对药剂进行的分子操作(例如，产生嵌合融合蛋白，其包含转运肽，所述转运肽对内皮细胞表面分子具有亲和力，并且与本身不能穿过bbb的试剂组合)；设计用于增加药剂脂溶性的药理学策略(例如，水溶性药剂与脂质或胆固醇载体的结合)；以及通过高渗性破裂(hyperosmoticdisruption)(由甘露醇溶液注入颈动脉或使用血管紧张素肽等生物活性剂引起)对血脑屏障(bbb)完整性的暂时破坏。然而，这些策略中的每一种都有局限性，例如与侵入性外科手术相关的固有风险，由内源性转运系统固有的局限性所造成的尺寸限制，与全身性施用嵌合分子(所述嵌合分子包含在cns外可能有活性的载体基序)相关的潜在的不良生物副作用，以及在bbb被破坏的脑区域内的脑损伤的可能风险。这使它成为一种次优的递送方法。[0336]可替代地，可以以局部方式而非全身的方式施用药物组合物，例如通过将药物组合物直接注射到患者的组织区域中。[0337]本发明的一些实施方式的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封(encapsulating)、包埋(entrapping)或冻干方法。[0338]因此，根据本发明一些实施方式使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包含赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成可药用的制剂。合适的剂型(formulation)取决于所选的给药途径。[0339]对于注射，药物组合物的活性成分可以配制在在水溶液中，优选配制在在生理相容的缓冲液中，例如汉克氏液(hank’ssolution)、林格氏液(ringer’ssolution)或生理盐缓冲液。对于经粘膜给药，在制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的。[0340]对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域公知的药学上可接受的载体组合来容易地配制药物组合物。这种载体使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以供患者口服摄入(oralingestion)。用于口服使用的药物制剂可以使用固体赋形剂制备，任选地研磨所得混合物，如果需要，在加入合适的助剂后，加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，pvp)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。[0341]糖衣丸芯具有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素添加到片剂或糖衣丸包衣中，以用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。[0342]可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合式胶囊(push-fitcapsules)以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊。推入配合式胶囊可含有与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。用于口服给药的所有制剂的的剂量都应适合所选的给药途径。[0343]对于颊内给药(buccaladministration)，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。[0344]对于通过鼻吸入给药，根据本发明一些实施方式使用的活性成分方便地以气溶胶喷雾给药(气溶胶喷雾给药)的形式从加压包装或喷雾器中递送，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以输送计量的量来确定。用于分配器中的例如明胶的胶囊和药筒可以配制成含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。[0345]本文所述的药物组合物可以配制用于肠胃外给药，例如通过弹丸注射(bolusinjection)或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型(unitdosage)形式存在，例如在安瓿中或多剂量容器中，任选地添加防腐剂。组合物可以是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制试剂(formulatoryagents)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。[0346]用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。此外，活性成分的悬浮液可以制备成合适的油基或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)，或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯)，甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液(aqueousinjectionsuspensions)可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。[0347]可替代地，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前与合适的载体，例如无菌、无热原的水基溶液一起配制。[0348]还可以使用例如常规栓剂基质(例如可可脂)或其它甘油酯，将本发明一些实施方式的药物组合物配制成直肠组合物，例如，栓剂或保留灌肠剂。[0349]适用于本发明一些实施方式上下文中的药物组合物包含组合物，该组合物中活性成分的含量能有效达到预期目。更具体地，治疗有效量是指有效预防、减轻或改善病症(例如戈谢病)的症状，或延长被治疗的主体的存活的活性成分(经基因修饰的人gcase)的量。[0350]治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。[0351]对于在本发明方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以最初从体外和细胞培养试验(cellcultureassays)中估计。例如，可以在动物模型中配制剂量以实现所需的浓度或滴定度(titer)。这种信息可用于更准确地确定人体的有效剂量。[0352]例如，可以采用gcase活性的任何体内或体外测定(invivoorinvitroassay)，例如利用farfel-becker等人[farfel-becker，vitner和futerman，疾病模式与机制(dismodelmech)(2011)4(6):746–752]讨论的戈谢病的动物模型。[0353]本文所述活性成分的毒性和治疗效果可通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定。从这些体外和细胞培养试验以及动物研究中获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。剂量可以根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。具体的制剂、给药途径和剂量可以由个体医生根据患者的状况来选择。(参见，例如，fingl等人，1975，“治疗学的药理学基础(thepharmacologicalbasisoftherapeutics)”，第1页第1章(ch.1p.1))。[0354]可以单独调节剂量和间隔，以提供足够量的活性成分来诱导或抑制生物效应(最小有效浓度(minimaleffectiveconcentration)，mec)。每种制剂的mec会有所不同，但是可以从体外数据估计。达到mec所必需的剂量将取决于个体特征和给药途径。检测测定可用于确定血浆浓度。[0355]根据待治疗疾病的严重程度和反应性，给药可以是单次或多次给药，疗程持续几天至几周或直到实现治愈或实现疾病状态的减轻。[0356]当然，组合物的给药量将取决于被治疗的主体、病痛的严重程度、给药方式、处方医生的判断等。[0357]如果需要，本发明一些实施方式的组合物可以存在于包装或分配器装置中，例如fda批准的试剂盒，其可以包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如，包装可以包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有给药说明书。包装或分配器也可以通过与容器相关联的通知以由管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式来容纳，该通知反映了该机构对组合物的形式或人或兽医给药形式的批准。这种通知例如可以是美国食品和药品管理局(u.s.foodanddrugadministration)批准的处方药物的标签或批准的产品说明书(productinsert)。还可以制备在相容的药物载体中配制的包含本发明制剂的组合物，将其置于合适的容器中，并贴上标签用于治疗指定的病症，如上文进一步详述的。[0358]应当理解，试剂盒还可以包含用于治疗戈谢病的另一种治疗组合物，例如用于基板减低疗法(srt)的试剂。[0359]本发明一些实施方式的经基因修饰的人gcase，编码其的多核苷酸，用于其表达的表达构建体，或本发明一些实施方式的细胞，可以用于在有需要的主体中治疗与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病。[0360]本文所用的术语“治疗(treating或treatment)”是指消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上延迟病症的临床症状的出现，基本上改善病症的临床症状，或基本上预防病症的临床症状的出现。本文所用的术语“治疗(treating)”进一步指延长患有病症的患者的存活或延缓其死亡。[0361]如本文所用，短语“主体(subject)”和“有需要的主体(subjectinneedthereof)”在本文中可互换使用，是指处于任何年龄或性别的患有该病症的哺乳动物，优选人。该术语包括有发展为该病症风险的个体。主体可以包括例如新生儿、婴儿、少年(juvenile)、青少年(adolescent)、成人和老年人。[0362]根据一个实施方式，主体已经被诊断患有与gba基因相关的疾病。[0363]根据一个实施方式，主体已经被诊断患有与降低的β-葡糖脑苷脂酶水平和/或活性相关的疾病。[0364]根据一个实施方式，主体已经被诊断患有与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病。[0365]与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的示例性疾病包括但不限于戈谢病、gba相关的帕金森病、gba相关的路易体痴呆和gba相关的多系统萎缩。[0366]根据一个具体的实施方式，与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病是戈谢病。[0367]如本文可互换使用的术语“戈谢氏病(gaucher'sdisease)”、“戈谢病(gaucherdisease)”或“gd”在本文中可互换使用，是指溶酶体贮积症(lsd)，特征在于葡萄糖基神经酰胺(glccer，也称为葡糖脑苷脂)在细胞中，特别是在单核细胞谱系的细胞中积聚。葡萄糖基神经酰胺可以在脾、肝、肾、肺、脑和骨髓中聚集。该疾病通常由β-葡糖脑苷脂酶(也称为β葡萄糖苷酶、d-葡萄糖基-n-酰基鞘氨醇葡萄糖水解酶、gcd或gcase；ec3.2.1.45)酶缺乏引起，这是一种具有葡糖神经酰胺酶酶活性的溶酶体酶，是催化葡萄糖基神经酰胺/glccer水解所必需的。[0368]基于疾病的具体症状，gd分成两种主要类型：神经性和非神经性疾病。在非神经性疾病中，可能涉及大多数器官和组织，但不涉及大脑。在神经性疾病(ngd)中，还涉及大脑。[0369]i型(或非神经性类型，gd1)是该疾病最常见的形式，大约每50,000活产儿中有1例发生。它最常发生在德系犹太人后裔中。症状可能始于生命早期或成年期，包括肝脏肿大和脾脏严重肿大(统称为“肝脾肿大”)；脾脏可能会破裂并导致其他并发症。脾肿大和骨髓替代(bonemarrowreplacement)导致贫血、血小板减少和白细胞减少。骨骼虚弱和骨病可能是广泛存在的。大脑在病理上未受影响，但可能有肺损伤，偶尔也有肾功能损伤。这类患者通常容易擦伤(由于血小板水平低)，并且由于红细胞数量少而感到疲劳。根据疾病的发病和严重程度，1型gd患者可能会活到成年。有些患者病情较轻，或者可能没有任何症状。[0370]本文所用的神经病性gd(ngd)包括2型和3型gd。[0371]2型gd，也称为急性婴儿神经性gd，通常在出生的6个月内开始，其发病率约为100,000次活产儿中约1例。症状包括肝脾肿大、广泛和进行性脑损伤(extensiveandprogressivebraindamage)、眼球运动障碍、痉挛、癫痫发作、肢体僵硬，以及吮吸和吞咽能力差。受影响的儿童通常在两岁时死亡。[0372]3型gd，也称为慢性神经性gd，可在儿童期甚至成年期的任何时间开始，在约100,000个活产儿中发生1例。其特征是缓慢进展，但与急性或2型相比神经症状较轻。3型gd被分为两个变体，称为3b型和3a型。3b型早期出现巨大肝脏和脾脏，患者还可能经历直接累及肺和快速进行性骨病。主要症状包括脾和/或肝肿大、癫痫发作、协调不力、骨骼不规则、眼球运动障碍、血液疾病(包括贫血)和呼吸道疾病。患者通常活到十几岁和成年。[0373]根据一个具体实施方式，gd是1型。[0374]根据一个实施方式，本发明一些实施方式的经基因修饰的人gcase用于酶替代疗法。[0375]如本文所用，“酶替代疗法(enzymereplacementtherapy，ert)”是指β-葡糖脑苷脂酶(gcase)的外源性给药。[0376]根据具体实施方式，将经基因修饰的人gcase治疗与基板减低疗法剂组合。[0377]如本文所用，术语“基板减低疗法剂(substratereductiontherapy，srt)”是指抑制gcase(即葡萄糖基神经酰胺(或gl1))的天然底物的合成的试剂(例如小分子)。市场上有许多卫生管理机构批准的srt版本。示例包括但不限于美格鲁特(zavesca.rtm.)和依利格鲁司特(eliglustattartrate)。[0378]预期在从本发明申请开始的专利有效期内，将开发许多相关的srt，术语srt的范围旨在包括所有这些先验(apriori)的新技术。[0379]如本文所用，术语“约(about)”是指±10％。[0380]术语“包括(comprises、comprising、includes、including)”、“具有(having)”及其和同源词(conjugates)是指“包括但不限于(includingbutnotlimitedto)”。[0381]术语“由……组成(consistingof)”是指“包括并限于(includingandlimitedto)”。[0382]术语“基本上由……组成(consistingessentiallyof)”是指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅当另外的成分、步骤和/或部分不会实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征时。[0383]如本文所用，单数形式“一个(a或an)”和“所述(the)”包括复数，除非上下文另有明确指示。例如，术语“一种化合物(acompound)”或“至少一种化合物(atleastonecompound)”可以包括多种化合物，包括其混合物。[0384]在整个本发明中，本发明的各个实施例可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本发明范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围如1至6的描述应被认为具有具体公开的子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。这适用于任何宽度的范围。[0385]每当本文指出数值范围时，其意味着包括在所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“第一指示数字和第二指示数字之间的范围(ranging/rangesbetweenafirstindicatenumberandasecondindicatenumber)”和“从第一指示数字到第二指示数字的范围(ranging/rangesfromafirstindicatenumbertoasecondindicatenumber)”在本文中可互换使用，并且意味着包括第一和第二指示数字以及它们之间的所有分数和整数。temperature，tm)定义为荧光强度(fluorescenceintensity，fi)比率曲线(ratiocurve)的拐点，其中r(fi)＝fi350nm/fi330nm。[0405]使用合成底物(p-np-glc)的酶活性测定[0406]使用对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)作为底物测定比酶活性(specificenzymeactivity)。通过将ph升高至10来停止反应，在该ph下释放的对硝基苯酚完全离子化，并且在405nm处显示20000m-1cm-1的摩尔吸收。[0407]活性测定采用wei等人[weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299–308]。简言之，将酶的等分试样与0.1％bsa/0.125％牛磺胆酸钠/0.162％tritonx-100/0.02％叠氮化钠/0.1m磷酸钾(ph5.9)中的0.2-4mmp-np-glc在25℃孵育60分钟。通过在1m甘氨酸缓冲液(ph10)中稀释20-50倍来停止反应，并使用agilentcary3500分光光度计(安捷伦科技有限公司(agilenttechnologies)，美国)在1cm比色皿中在405nm处测量对硝基苯酚的吸光度。将吸光度值转化成对硝基苯酚浓度，并使用origin软件(originlab)构建并拟合米氏图(michaelis-mentenplots)。根据方程kcat＝vmax/c，将从拟合中获得的vmax值转化为kcat值，其中c是gcase催化位点的摩尔浓度。[0408]使用c6nbdglccer的酶活性测定[0409]使用荧光标记的gcase天然底物(nbd葡萄糖基神经酰胺(d18:1/6:0)(c6nbdglccer))测试变体的酶活性。[0410]将蛋白质制剂与20μmc6-nbd-glccer、20μm脱脂bsa在50mmmes缓冲液(ph5.5)中在37℃下孵育5分钟。通过加入750μl氯仿/甲醇(1:2,v/v)，随后加入500μl氯仿和730μl重蒸馏水来停止反应。将样品剧烈涡旋，并在2,000g下离心10分钟。吸出上层相，并在n2流下干燥含有提取的脂质的下层相。将脂质重新悬浮在氯仿/甲醇(9:1,v/v)中，并使用氯仿/甲醇/9.8mmcacl2.2h2o(65/30/8,v/v/v)作为展开溶剂通过tlc进行分离。使用typhoon9410可变模式成像仪观察nbd标记的脂质，并通过imagequanttl(gehealthcare公司，英国圣吉尔斯(chalfontstgiles,uk))进行定量。活性值计算为在1分钟内通过1mg酶使底物转化成产物的μmol(μmol.mg-1.min-1)。[0411]实施例1[0412]pross-生成变体[0413]通过使用pross算法设计了六个gcase变体(设计2-7，即d2-7，分别在seqidnos:4、6、8、10、12和14中列出，参见图1a)，pross算法已经成功用于提高几种其他蛋白质的表达水平和稳定性[参见pct/il2016/050812和goldenzweiga.等人，分子细胞(mol.cell.)(2016)63:337-346，通过引用并入本文]。这些变体中的4个，d2、d4、d6和d7在大肠杆菌中表达，并使用合成底物p-np-glc测试酶活性(数据未示出)。图1b(seqidno:2)示出了wtgcase的序列，下面的行示出了在d7变体(seqidno:14)中发生的突变，其具有最高的突变数量，即30个突变。它也是显示出最高酶活性的构建体。为了进一步的工作，d7变体在hek293t细胞中表达，其能够进行蛋白质糖基化。[0414]实施例2[0415]变体d7gcase的表达和纯化[0416]wthgcase和d7变体均在hek293t细胞中表达，并从细胞沉淀(细胞内)或从培养基(分泌的)中分离。wt和d7gcase均在细胞内表达，但d7变体显示比wt更高的表达。图2b和2c显示了使用考马斯蓝染色从单个制备物获得的三个洗脱液级分的sds-page，通过蛋白质印迹和ms将gcase鉴定为主要条带(用箭头标记)。只有d7gcase被分泌。通过使用flag珠粒的一步纯化获得了分泌的d7gcase的高度纯化的制剂(图2c)。[0417]随后，将样品上样到superdex200柱上。sec揭示了分泌的d7gcase的显著寡聚化(图3a-b)。细胞内wt和d7gcase也观察到类似的模式。单体的位置通过用分子量标记校准柱来确定，作为在大约15ml处具有吸光度最大值的峰(峰1，图3a-b)。单体峰也显示为具有最高比活性的级分。将对应于单体的级分合并、浓缩，并用于稳定性和活性测定。在下文中，给出的数据是通过两步纯化从分泌的级分中获得的d7单体。由于分泌的wtgcase的产量极低，将d7gcase获得的数据与在cho细胞(从r&d系统公司获得)中表达的重组wtgcase的类似数据和(由sanofigenzyme公司生产，其具有带有单个arg495his取代的wt序列)进行比较。[0418]实施例3[0419]变体d7gcase的热稳定性[0420]使用差示扫描荧光测定法(dsf)测定d7gcase的熔融温度(tm)。dsf测量了蛋白质去折叠(proteinunfolding)时酪氨酸和色氨酸残基的荧光变化，这导致它们暴露于水性环境中。[0421]下表1示出了所分析制剂的平均tm值。在ph7.4的tris缓冲液和ph6.1的柠檬酸缓冲液中，测定的d7gcase的tm值分别为71.8±2.4℃和61.4±1.9℃。d7gcase显示出比wtgcase更高的热稳定性。当在ph7.4和ph6.1时，与相比，稳定性分别增加了大约20℃和大约11℃。使用dsf获得的和wtgcase的值与先前报道的通过差示扫描量热法获得的的tm值非常一致，即在ph7.1时为51.30±0.02℃，在ph5.4时为57.67±0.04℃[weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299–308，同上]。[0422]表1：通过差示扫描荧光测定法测量的tm(℃)[0423][0424]显示了wtgcase、d7gcase和在两种不同ph值下的值。[0425]实施例4[0426]变体d7gcase的比活性[0427]将米氏方程(michaelis-mentenequation)拟合到允许获得km和kcat值的实验数据(下表2，代表性的酶促动力学数据如图4所示)。基于双分子速率常数kcat/km，比较了各种制剂的总催化效率。所得数据表明，d7和wt的催化活性没有显著差异，它们的kcat/km值分别为0.28×106和0.27×106m-1min-1。因此，该数据证实了所采用的方案，并与人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷进行了比较分析。[0428]表2：动力学参数[0429]km(mm)kcat(min-1)kcat/km(m-1min-1)gcasewt1.22±0.38(n＝2)347±49(n＝2)0.28×106gcased70.89±0.26(n＝3)244±102(n＝3)0.27×106[0430]值得注意的是，通过将米氏曲线拟合到测量的数据点，获得了gcase制剂对对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的活性的动力学参数。[0431]实施例5[0432]其他pross-生成的变体[0433]使用pross算法设计了葡糖神经酰胺酶(gcase)的另外三个变体(d13、d14和d15)，pross算法已经成功用于提高几种其他蛋白质的表达水平和稳定性[参见pct/il2016/050812和goldenzweiga.等人，(2016)同上(supra)，通过引用并入本文]。gcase变体d13、d14和d15在hek293t细胞中表达，并从培养基中分离。通过使用flag标签(flagtag)(dykddddk标签(dykddddktag)，seqidno：16)或标签(seqidno:29)通过一步纯化获得gcase设计的高度纯化的制剂。使用gcase的荧光标记类似物(nbd葡萄糖基神经酰胺(d18:1/6:0)(c6nbdglccer))测试所有变体的酶活性(数据未示出)。具有最高酶活性的设计，即变体d15gcase(如图5a-b所示)用于进一步表征。如下所述，将新的d15gcase的热稳定性和酶活性与先前表征的d7gcase和sanofigenzyme公司生产的进行比较，具有具有带有单个arg495his取代的wt序列。所有酶均保存在4℃下溶解在含有187mmd-甘露糖醇和0.1％(v/v)吐温80,ph6.1的柠檬酸钠/柠檬酸盐缓冲液中。[0434]实施例6[0435]变体d15gcase的热稳定性[0436]使用差示扫描荧光测定法(dsf)测定d15gcase的熔融温度(tm)。dsf测量了蛋白质去折叠(proteinunfolding)时酪氨酸和色氨酸残基的荧光变化，这导致它们暴露于水性环境中。用溶解在柠檬酸盐缓冲液(ph6.1)中的酶进行实验(如上所述)。先前已经示出d7gcase具有比高约10℃的更高的温度。观察到变体d15gcase的熔融温度进一步升高。d15gcase测得的平均tm值比高17℃，反映了蛋白质热稳定性的显著提高(下表3)。测得的的tm值与先前报道的通过差示扫描量热法获得的tm值非常一致，即在ph7.1时为51.30±0.02℃[weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299-308，同上]。[0437]表3：通过差示扫描荧光测定法测量的tm(℃)[0438][0439]实施例7[0440]变体d15gcase的比活性[0441]通过两种方法测定比活性：(i)使用gcasec6nbdglccer的荧光标记的天然底物(在ph5.5下)和(ii)使用人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(β-np-glc)(在ph5.9下)。在第一种方法中，底物和产物通过薄层色谱进行分离，并通过nbd荧光进行定量。在后者中，通过在405nm处吸收产生的对硝基苯基，对底物进行光谱定量。由两种底物测定的比酶活性与市售和d15gcase相当。活性值计算为在1分钟内通过1mg酶使底物转化成产物的μmol(μmol.mg-1.min-1；下表4a)。c6nbdglccer测定的底物浓度为20μm，p-np-glc测定的底物浓度为0.4、1.5和3mm(图6)。[0442]表4a：比活性(μmol.mg-1.min-1)[0443][0444]*值得注意的是，使用flag标签纯化gcased15[0445]进行进一步的实验以比较wtgcase、市售gcase和d15gcase的酶促动力学。通过将米氏曲线拟合到测量的数据点，获得了gcase制剂对对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(β-np-glc)的活性的动力学参数。允许获得km和kcat值的实验数据(下表4b)。基于双分子速率常数kcat/km，比较了各种制剂的总催化效率。所得数据表明，d15的催化活性与相当，它们的kcat/km值分别为1.49×106m-1min-1和1.53×106m-1min-1，而d7的催化活性与wtgcase相当，它们的kcat/km值分别为0.27×106和0.28×106m-1min-1。[0446]表4b：动力学参数[0447][0448]实施例8[0449]另外的gcase变体-d16[0450]使用pross算法设计了葡糖神经酰胺酶(gcase)的另外的变体(d16)，pross算法已经成功用于提高几种其他蛋白质(包括gcase(设计d7和d15))的表达水平和稳定性[goldenzweiga.等人，(2016)同上(supra)，通过引用并入本文]。d16gcase在hek293t细胞中表达，并从培养基中分离。通过使用标签(seqidno:29)通过一步纯化获得gcase设计的高度纯化的制剂。[0451]如下所述，将新的d16gcase的热稳定性和酶活性与先前表征的d15gcase(使用标签(seqidno:29))sanofigenzyme公司生产的进行比较，具有带有单个arg495his取代的wt序列。所有酶均保存在4℃下溶解在含有187mmd-甘露糖醇和0.1％(v/v)吐温80,ph6.1的柠檬酸钠/柠檬酸盐缓冲液中。[0452]实施例9[0453]变体d16gcase的热稳定性[0454]使用差示扫描荧光测定法(dsf)测定gcase的熔融温度(tm)。dsf测量了蛋白质去折叠(proteinunfolding)时酪氨酸和色氨酸残基的荧光变化，这导致它们暴露于水性环境中。先前已经示出gcased15具有比高约17℃的更高的温度，反映了蛋白质热稳定性的显著提高(上表3和下表5)。与gcased15相比，新的gcased16的tm略微升高，即升高2.5℃。此处测得的的tm值与先前报道的通过差示扫描量热法获得的tm值非常一致，即在ph7.1时为51.30±0.02℃[weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299-308，同上]。[0455]表5：通过差示扫描荧光测定法测量的tm(℃)[0456][0457]实施例10[0458]变体d16gcase的比活性[0459]使用人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(β-np-glc)(在ph5.9中)测定比活性。在该测定中，通过在405nm处吸收产生的对硝基苯基，对底物进行光谱定量。底物浓度为3mm。新的gcased16变体的比酶活性高于商业cerezyme所测定的比酶活性，并且与gcased15相当。活性值计算为在1分钟内通过1mg酶使底物转化成产物的μmol(μmol.mg-1.min-1；下表6)。[0460]表6：比活性(μmol.mg-1.min-1)[0461][0462]*值得注意的是，使用纯化gcased15和gcased16[0463]尽管已经结合本发明的特定实施方式描述了本发明，但是显然，许多替换、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，本发明旨在包括落入所附权利要求的精神和宽泛范围内的所有这些替换、修改和变化。[0464]本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地通过引用并入本文。此外，在本发明中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认该参考文献可作为本发明的现有技术。就所使用的章节标题而言，它们不应被解释为必要的限制。[0465]此外，本发明的任何优先权文件通过引用整体并入本文。当前第1页12当前第1页12
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：：6.本发明在其一些实施方式中涉及β-葡糖脑苷脂酶(β-glucocerebrosidase，gcase)的变体，更具体地但不排他地涉及其用于治疗β-葡糖脑苷脂酶缺乏症(包括戈谢病)的用途。7.溶酶体贮积症(lysosomalstoragedisorders，lsds)包括约50种不同的遗传疾病。由溶酶体酶或转运蛋白的缺陷引起，导致未降解代谢物在溶酶体内积聚。在lsd中，戈谢病(gaucherdisease，gd)是最普遍的；它是由gba1基因中的突变(mutation)引起的。gba1基因编码β-葡糖脑苷脂酶(也称为酸性β葡萄糖苷酶(acidbeta-glucosidase)、d-葡萄糖基-n-酰基鞘氨醇葡萄糖水解酶(d-glucosyl-n-acylsphingosineglucohydrolase)，或gcase)，这是一种具有葡糖神经酰胺酶(glucosylceramidase)活性的溶酶体酶，需要通过水解来切割糖脂代谢的中间产物葡萄糖基神经酰胺(glucosylceramide，glccer，也称为葡糖脑苷脂(glucocerebroside))的β-葡萄糖苷键，糖脂代谢中的中间体。结果，细胞积累了大量的glccer，最终死亡。8.从临床角度来看，根据发病年龄和神经系统参与的迹象，gd可分为三个亚型。1型gd是该疾病最常见的形式，其主要症状是脾和肝肿大、贫血、血小板减少和骨骼病变。2型和3型gd(gd(ngd)的神经性形式)的神经病形式，根据神经症状的发作时间和进展速度进行分类。2型，急性神经性形式，通常指在6个月龄之前表现出神经异常并在2-4岁时死亡的儿童。在3型(亚急性、慢性神经性形式)中，患者表现出与2型中观察到的症状相似的症状，但发病较晚且较严重。9.通常采用酶替代疗法(enzymereplacementtherapy，ert)治疗1型gd患者。第一个用于gd靶向ert(胎盘衍生产品)的药物(阿糖脑苷酶(alglucerase))在1991年被fda获批，并因重组dna技术制成的如下同类药物的获批而退出市场：于1995年获批的伊米苷酶(imiglucerase)2010年获批的维拉西酶α(velagluceraseα)和2012年获批的他利苷酶-α(taligluceraseα)这些疗法不能治愈gd，也就是说，它们不能纠正潜在的遗传缺陷。因此，为了从治疗中受益，有症状的患者需要终身继续接受ert。10.除了上述ert治疗外，美格鲁特(miglustat)(ogt918，n-丁基-脱氧野尻霉素(n-butyl-deoxynojirimycin))一种小分子，可口服药物，于2002年获批，提供了用于治疗gd的基板减低疗法(substratereductiontherapy，srt)。通过减少身体产生的鞘糖脂(glycosphingolipids，gsls)的量来减少整个身体的糖鞘脂(gsls)的有害积聚。此外，2014年获批的依利格鲁司特(eliglustat)也是一种用于治疗gd的小分子药物。被认为是通过抑制葡萄糖基神经酰胺合酶而起作用的。11.对1型gd的美格鲁特(miglustat)的回顾性分析发现，联合治疗可以为gd患者提供更好的疾病控制(通过采用一种以上的作用机制对抗细胞中葡萄糖基神经酰胺的积聚)，可以通过允许使用降低剂量的ert和美格鲁特来降低成本，并且可以提供可接受的生活质量[machaczkam.等人，乌普萨拉医学科学杂志(upsalajournalofmedicalsciences)(2012)117,28-34]。技术实现要素：[0012]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种经基因修饰(geneticallymodified)的人β-葡糖脑苷脂酶(β-glucocerebrosidase，gcase)：(i)包含与seqidno:2至少85％相同的氨基酸序列；(ii)包含坐标l34p、k224n/g、t369e和n370d处的突变，其中所述坐标对应于所述seqidno:2；和(iii)能够催化糖脂葡萄糖基神经酰胺(glucosylceramide，glccer)的水解。[0013]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码本发明一些实施方式所述的经基因修饰的人gcase的核酸序列。[0014]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含本发明一些实施方式所述的分离的多核苷酸和用于指导核酸序列在细胞中表达的顺式作用调节元件。[0015]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种分离的细胞，所述分离的细胞包含本发明一些实施方式所述的多核苷酸或本发明一些实施方式所述的构建体。[0016]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的本发明一些实施方式所述的经基因修饰的人gcase、本发明一些实施方式所述的分离的多核苷酸、本发明一些实施方式所述的构建体，或本发明一些实施方式所述的细胞，以及药学上可接受的载体或稀释剂。[0017]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种在有需要的主体中治疗与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病的方法，所述方法包括向所述主体施用治疗有效量的本发明一些实施方式所述的经基因修饰的人gcase、本发明一些实施方式所述的分离的多核苷酸、本发明一些实施方式所述的构建体或本发明一些实施方式所述的细胞，从而治疗主体中与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病。[0018]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了治疗有效量的本发明一些实施方式所述的经基因修饰的人gcase、本发明一些实施方式所述的分离的多核苷酸、本发明一些实施方式所述的构建体或本发明一些实施方式所述的细胞，用于在有需要的主体中治疗与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病。[0019]根据本发明一些实施方式的一个方面，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k和/或l372n，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0020]根据本发明的一些实施方式，经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w和/或h495r，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0021]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：i130t、a168s和/或d263n，其中坐标对应于seqidno:2。[0022]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：r211n和/或k303r，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0023]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和/或l420m/i，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0024]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：v78i、a95k、v191m、a322d、v343t、m361e、s364a、h374w、t410e、h451n和/或l480i，其中坐标对应于seqidno:2。[0025]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：h162k、s181a、t297s、m335f、k346h、s431a、s465d和/或a476d，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0026]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：r47k、l51r、q70h、l91i、g115e、a124g、d140n/g、s196t和/或v437s，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0027]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase还包含以下突变中的至少一个：t36q、s38a、q143e、t183a、l185m、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、e300r、k321e、v376t、k408r、q440e、m450q和/或i483v，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0028]根据本发明的一些实施方式，坐标d127、f128、w179、n234、e235、y244、f246、q284、y313、e340、s345、w381、n396处的氨基酸未被修饰，其中所述坐标对应于seqidno:2。[0029]根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列与选自由seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22和27组成的组的序列相同。[0030]根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列如seqidno:14所示。[0031]根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列如seqidno:22所示。[0032]根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列如seqidno:27所示。[0033]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase能够催化人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-d-glucopyranoside，p-np-glc)的水解。[0034]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase能够以至少约0.2×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer的水解。[0035]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase能够以至少约0.5×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer的水解。[0036]根据本发明的一些实施方式，所述经基因修饰的人gcase能够以至少约1.5×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer的水解。[0037]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比gcase多肽高5至20℃温度范围的热稳定性。[0038]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比野生型多肽高5至20℃温度范围的热稳定性。[0039]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比野生型多肽高至少5℃温度范围的热稳定性。[0040]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比野生型多肽高至少10℃温度范围(例如高至少12℃温度范围)的热稳定性。[0041]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比多肽高5至20℃高温度范围的热稳定性。[0042]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比多肽高至少10℃温度范围(例如高至少11℃温度范围)的热稳定性。[0043]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase具有比多肽高至少15℃温度范围(例如高至少17℃温度范围)的热稳定性。[0044]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，所述经基因修饰的人gcase在真核细胞中具有比野生型多肽高至少2倍的细胞内表达水平。[0045]根据本发明的一些实施方式，在相同条件下，与不分泌的野生型多肽相比，所述经基因修饰的人gcase是从真核细胞分泌的。[0046]根据本发明的一些实施方式，所述分离的多核苷酸包含seqidno:3、5、7、9、11、13、17、19、21、23或26所示的核酸序列。[0047]根据本发明的一些实施方式，所述顺式作用调节元件包含启动子。[0048]根据本发明的一些实施方式，与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的所述疾病是戈谢病(gaucherdisease)。[0049]根据本发明的一些实施方式，所述主体是人。[0050]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实施方式的实践或测试中，可以使用与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料，下文描述示例性的方法和/或材料在下面描述。如有冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而非限制性的。[0051]附图的简要说明[0052]本文仅通过示例的方式参考附图描述了本发明的一些实施方式。现在具体参照附图详图，需要强调的是，所示的细节是示例，是为了对本发明的实施方式进行说明性的讨论。在这一点上，结合附图进行的描述使得本领域技术人员清楚如何实施本发明的实施方式。[0053]在附图中：[0054]图1示出了野生型(wt，seqidno:2，包含如(赛诺菲健赞(sanofigzyme))提供的单个r495h突变)和变体(variants)d2-d7gcase(分别在seqidno:4、6、8、10、12和14中列出)的氨基酸序列。在每个序列中，酶的活性位点残基用下划线标出。由pross引入d2-d7gcase变体序列的所有突变都以粗体突出显示。[0055]图1b示出了野生型(wt)和变体d7gcase的氨基酸序列。gcasewt的完整氨基酸序列显示在上面的行(seqidno:2)，由pross引入d7序列的突变显示在下面的行(seqidno:14)。[0056]图2a是用于hek293t细胞中用于gcase表达的pcdna3.1载体内gcase序列位置的示意图。[0057]图2b-2c是示出通过纯化从wt和gcase沉淀中分离的gcase获得的三个洗脱部分的硫酸盐/聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)(图2b)，以及和在flag珠粒上纯化的分泌型gcase的sds-page(图2c)的照片。值得注意的是，只有d7变体产生一种分泌酶。箭头表示通过质谱(massspectrometry，ms)识别的gcase带的位置。[0058]图3a-b示出了使用flag珠粒一步纯化后d7gcase的体积排除色谱(sizeexclusionchromatography，sec)。将从具有flag肽的flag珠粒上洗脱的蛋白质级分合并，并上样到superdex200柱上。通过280nm处的吸光度监测蛋白质。收集、浓缩对应于每个峰的级分，并通过sds-page分析。值得注意的是，峰1对应于单体gcase。[0059]图4是示出wtgcase(三角形，实线)和d7gcase(圆圈，虚线)的代表性米氏图(michaelis-mentenplots)的图。将底物转化为产物的速率(y轴)归一化为1μg/ml蛋白质。[0060]图5a示出了野生型(wt,seqidno:2)和变体d7、d13、d14和d15gcase(分别在seqidno:14、18、20和22中列出)的氨基酸序列。在每个序列中，酶的活性位点残基用下划线标出。由pross引入d7、d13、d14和d15gcase变体序列的所有突变都以粗体突出显示。[0061]图5b示出了野生型gcase(上面的序列，如seqidno:2所示)和pross设计的变体d15gcase(下面的序列，如seqidno:22所示)的氨基酸序列的比较。突变的氨基酸以粗体突出显示，对应于酶催化位点的氨基酸用下划线标出。[0062]图6示出了使用p-np-glc作为底物估计的变体d15gcase(空心圆圈)和(黑色圆圈)的比活性。测定活性的底物浓度：0.4、1.5和3mmp-np-glc。[0063]图7示出了野生型(wt,seqidno:2，包含如(赛诺菲健赞(sanofigzyme))提供的单个r495h突变)，野生型(wt,seqidno:25)和变体d7、d13、d14、d15和d16gcase(分别在seqidno:14、18、20和22中列出)的氨基酸序列。在每个序列中，酶的活性位点残基用下划线标出。由pross引入d7、d13、d14和d15gcase变体序列的所有突变都以粗体突出显示。[0064]本发明具体实施方式的描述[0065]本发明在其一些实施方式中涉及β-葡糖脑苷脂酶(β-glucocerebrosidase，gcase)的变体，更具体地但不排他地涉及其用于治疗β-葡糖脑苷脂酶缺乏症(包括戈谢病(gd))的用途。[0066]可以参考附图和所附的说明书来更好地理解本发明的原理和操作。[0067]在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解的是，本发明在其应用中不一定局限于以下描述中阐述的细节或由实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方式或者能够以各种方式实践或实现。而且，应当理解，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应当被认为是限制性的。[0068]gd是一种由β-葡萄糖脑苷脂酶(β-glucocerebrosidase，gcase)功能缺陷引起的no:25至少86％相同的氨基酸序列。[0084]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少88％相同的氨基酸序列。[0085]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少90％相同的氨基酸序列。[0086]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少95％相同的氨基酸序列。[0087]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少96％相同的氨基酸序列。[0088]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少97％相同的氨基酸序列。[0089]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少98％相同的氨基酸序列。[0090]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:2或seqidno:25至少99％相同的氨基酸序列。[0091]同源性(homology)(例如，同源性百分比(percenthomology)，序列同一性 序列相似性)可以使用计算双序列比对(pairwisesequencealignment)的任何同源性比较软件来进行确定。[0092]如本文所用，在上下文中两个核酸或多肽序列的“序列同一性(sequenceidentity)”或“同一性(identity)”包括指两个序列中比对时相同的残基。当序列同一性百分比用于指蛋白质时，认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列被认为具有“序列相似性(sequencesimilarity)”或“相似性(similarity)”。用于进行这种调整的方式(means)是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守取代作为部分错配而不是完全错配进行评分，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，当相同的氨基酸评分为1，而非保守取代评分为0时，保守取代的评分介于0-1之间。保守取代的评分是根据例如henikoffs和henikoffjg[来自蛋白质块的氨基酸取代矩阵(aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks)美国国家科学研究院期刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)1992,89(22):10915-9]。[0093]同一性(identity)(例如，同源性百分比(percenthomology))可以使用任何同源性比较软件来确定，包括例如，国家生物技术信息中心(nationalcenterofbiotechnologyinformation，ncbi)的blastn软件，例如通过使用默认参数来确定。[0094]根据本发明的一些实施方式，同一性是总体同一性(globalidentity)，即，本发明的整个氨基酸或核酸序列上的同一性，而不是其部分的同一性。[0095]根据本发明的一些实施方式，术语“同源性(homology)”或“同源的(homologous)”是指两个或多个核酸序列的同一性；或两个或多个氨基酸序列的同一性；或氨基酸序列与一个或多个核酸序列的同一性。[0096]根据本发明的一些实施方式，同源性是总体同源性(globalhomology)，即，本发明的整个氨基酸或核酸序列的同源性，而不是其部分的同源性。[0097]两个或多个序列之间的同源性或同一性的程度可以使用各种已知的序列比较工具来进行确定。下面是可以与本发明的一些实施方式一起使用的这种工具的非限制性描述。[0098]双序列全局比对(pairwiseglobalalignment)由s.b.needleman和c.d.wunsch,“(适用于寻找两种蛋白质的氨基酸序列相似性的一般方法(ageneralmethodapplicationstothesearchofsimilarityintheaminosequenceoftwoproteins))”,(分子生物学期刊(journalofmolecularbiology)),1970，第443-453页，第48卷)。[0099]当从多核苷酸序列开始并与其它多核苷酸序列比较时，可以使用emboss-6.0.1needleman-wunsch算法(可从emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/needle.html获得)。[0100]根据一些实施方式，同源性程度的确定还需要采用史密斯-沃特曼算法(smith-watermanalgorithm)(用于蛋白质-蛋白质比较或核苷酸-核苷酸比较)。[0101]根据本发明的一些实施方式，在对感兴趣的多肽或多核苷酸进行总体同源性(globalhomology)(例如，整个序列上的80％总体同源性)之前，对通过与感兴趣的多肽或多核苷酸的局部同源性预先选择的序列进行总体同源性(例如，超过60％序列长度的60％同一性)。例如，使用blast软件选择同源序列，第一阶段使用blastp和tblastn算法作为过滤器，第二阶段使用针(needle)(emboss程序包(embosspackage))或frame 算法比对。局部同一性(localidentity)(blast比对)的定义具有非常宽松的截止值-在60％序列长度的跨度上有60％的同一性，因为它仅用作总体比对阶段的过滤器。在该特定实施方式中(当使用局部同一性时)，不使用blast程序包包的默认过滤(通过设置参数“‑ff”)。在第二阶段中，基于与核心基因多肽序列至少80％的总体同一性来定义同源物。[0102]根据本发明的一些实施方式，gcase多肽的长度为470-520个氨基酸。[0103]根据本发明的一些实施方式，gcase多肽的长度为480-510个氨基酸。[0104]根据本发明的一些实施方式，gcase多肽的长度为490-510个氨基酸。[0105]根据本发明的一些实施方式，gcase多肽的长度为495-500个氨基酸。[0106]根据具体的实施方式，gcase多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列含有480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504或505个氨基酸残基。[0107]根据具体的实施方式，gcase多肽包含的氨基酸序列含有497个氨基酸残基。[0108]本文所用的术语“多肽(polypeptide)”包括修饰，所述修饰使得与天然gcase序列(即seqidno:2或seqidno:25)相比，多肽在动物或人体内高度表达、在体外(vitro)和体内(vivo)更稳定或更能渗透入细胞。[0109]这种修饰包括但不限于n末端修饰、c末端修饰、多肽键修饰、主链修饰和残基修饰。制备肽模拟物化合物的方法是本领域公知的，并且在例如定量药物设计(quantitativedrugdesign)，c.a.ramsdengd.，第17.2章，f.choplinpergamonpress(1992)中详细进行了说明，其通过引用并入本文中，如同在本文中完全阐述一样。下文提供了关于这一方面的进一步的细节。[0110]术语“分离的(isolated)”是指至少部分地与自然环境(例如，人体)分离。根据一个实施方式，分离的多肽基本上不含污染的细胞成分，例如碳水化合物、脂质或自然界中与多肽相关的其它蛋白质杂质。然而，术语“分离的”不排除以替代的物理形式存在相同的多肽，例如二聚体或替代的糖基化或衍生的形式。[0111]术语“氨基酸(aminoacid或aminoacids)”应理解为包括20种天然存在的氨基酸；那些通常在体内翻译后被修饰的氨基酸，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其它不寻常的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素(isodesmosine)、正缬氨酸(nor-valine)、正亮氨酸(nor-leucine)和鸟氨酸。[0112]根据一个实施方式，氨基酸是“等效氨基酸残基(equivalentaminoacidresidue)”。等效氨基酸残基是指能够取代多肽中的另一个氨基酸残基而基本上不改变多肽的结构和/或功能性(例如催化葡萄糖基神经酰胺/glccer的水解的能力)的氨基酸残基。因此，等效氨基酸具有相似的性质，如侧链的体积、侧链极性(极性或非极性)、疏水性(疏水性或亲水性)、ph(酸性、中性或碱性)和碳分子(芳香族/脂肪族)的侧链组织(sidechainorganization)。因此，“等效氨基酸残基”可以被认为是“保守性氨基酸置换(conservativeaminoacidsubstitutions)”。[0113]在术语“等效氨基酸置换(equivalentaminoacidsubstitution)”的含义内，一个氨基酸可以被下文所示的氨基酸组内的另一个氨基酸取代：[0114]i)具有极性侧链的氨基酸(asp、glu、lys、arg、his、asn、gln、ser、thr、tyr、cys)；[0115]ii)具有非极性侧链的氨基酸(gly、ala、val、leu、ile、phe、trp、pro、met)；[0116]iii)具有非极性脂肪族侧链的氨基酸(gly、ala、val、leu、ile)；[0117]iv)具有环状侧链的氨基酸(phe、tyr、trp、his、pro)；[0118]v)具有芳香族侧链的氨基酸(phe、tyr、trp)；[0119]vi)具有酸性侧链(acidicsidechains)的氨基酸(asp、glu)；[0120]vii)具有碱性侧链(basicsidechains)的氨基酸(lys、arg、his)；[0121]viii)具有酰胺侧链的氨基酸(asn、gln)；[0122]ix)具有羟基侧链的氨基酸(ser、thr)；[0123]x)具有含硫侧链的氨基酸(cys、met)；[0124]xi)中性，弱疏水性氨基酸(pro、ala、gly、ser、thr；[0125]xii)亲水性氨基酸(arg、asn、asp、glu、gln、his、lys、ser、thr、tyr)；[0126]xiii)疏水性氨基酸(ala、cys、gly、ile、leu、met、phe、pro、trp、val)；以及[0127]xiv)带电荷的氨基酸(arg、lys、asp、glu)。[0128]由于本发明的多肽被用于需要肽呈可溶性形式的治疗中，本发明一些实施方式的多肽优选包括一种或多种非天然或天然极性氨基酸，包括但不限于丝氨酸，由于其含羟基的侧链，其能够增加多肽的溶解度。[0129]根据一个具体的实施方式，与seqidno:2相比，gcase变体的氨基酸序列包含突变，例如取代(substitution)。[0130]根据一个具体的实施方式，与seqidno:25相比，gcase变体的氨基酸序列包含突变，例如取代。[0131]根据一个实施方式，突变在seqidno:25上。[0132]本发明一些实施方式的多肽可以包含本文所述的突变，只要修饰的区域不是催化结构域的一部分，例如不修饰形成活性位点(如上所述)的催化结构域的3d结构，或糖基化位点(如上所述)的3d结构，即seqidno:2或seqidno:25的3d结构。[0133]根据一个实施方式，gcase多肽在seqidno:2或seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含4-80、4-75、4-70、4-60、4-50、4-45、4-40、4-35、4-30、4-25、4-20、4-15、4-10、4-5、6-80、6-75、6-70、6-60、6-50、6-40、6-35、6-30、6-25、6-20、6-15、6-10、9-80、9-75、9-70、9-60、9-50、9-40、9-35、9-30、9-25、9-20、9-15、9-10、12-80、12-75、12-70、12-60、12-50、12-40、12-35、12-30、12-25、12-20、12-15、16-80、16-75、16-70、16-60、16-50、16-40、16-35、16-30、16-25、16-20、19-80、19-75、19-70、19-60、19-50、19-40、19-35、19-30、19-25、19-20、21-80、21-75、21-70、21-60、21-50、21-45、21-40、21-35、21-30、21-25、25-80、25-75、25-70、25-60、25-50、25-45、25-40、25-35、25-30、30-80、30-75、30-70、30-60、30-50、30-45、30-40、30-35、40-80、40-70、40-60、40-50、50-80、50-70、50-55、55-60、60-70或70-80个突变。[0134]根据一个实施方式，gcase多肽在seqidno:2或seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个突变。[0135]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含4个突变。[0136]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含9个突变。[0137]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含16个突变。[0138]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含15个突变。[0139]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含19个突变。[0140]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含18个突变。[0141]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含21个突变。[0142]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含20个突变。[0143]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含30个突变。[0144]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含29个突变。[0145]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含36个突变。[0146]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含35个突变。[0147]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含46个突变。[0148]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含45个突变。[0149]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含56个突变。[0150]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含55个突变。[0151]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:2所列出的氨基酸序列中包含73个突变。[0152]根据一个具体的实施方式，gcase多肽在seqidno:25(uniprotkb-p04062(glcm_human))所列出的氨基酸序列中包含72个突变。[0153]如上所述，本发明一些实施方式的gcase多肽包含突变l34p、k224n/g、t369e和n370d，其中坐标对应于seqidno:2。本领域技术人员可以通过手动进行的氨基酸序列比对或使用特定的生物信息学工具如fasta、l-align和蛋白blast来调整氨基酸坐标。[0154]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k或l372n，其中坐标对应于seqidno:2。[0155]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的两个：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k或l372n，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h145k/r和i204k；h145k/r和e222k；h145k/r和t334f/y/k；h145k/r和l372n；i204k和e222k；i204k和t334f/y/k；i204k和l372n；e222k和t334f/y/k；e222k和l372n；或t334f/y/k和l372n，其中坐标对应于seqidno:2。[0156]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的三个：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k或l372n，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h145k/r、i204k和e222k；h145k/r、i204k和t334f/y/k；h145k/r、i204k和l372n；h145k/r、e222k和t334f/y/k；h145k/r、e222k和l372n；h145k/r、t334f/y/k和l372n；i204k、e222k和t334f/y/k；i204k、e222k和l372n；i204k、t334f/y/k和l372n；或e222k、t334f/y/k和l372n，其中坐标对应于seqidno:2。[0157]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的四个：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k或l372n，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：i204k、e222k、t334f/y/k和l372n；h145k/r、e222k、t334f/y/k和l372n；h145k/r、i204k、t334f/y/k和l372n；h145k/r、i204k、e222k和l372n；或h145k/r、i204k、e222k和t334f/y/k，其中坐标对应于seqidno:2。[0158]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：h145k/r、i204k、e222k、t334f/y/k和l372n，其中坐标对应于seqidno:2。[0159]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、h145k/r、i204k、e222k、k224n/g、t334f/y/k、t369e、n370d和l372n，其中坐标对应于seqidno:2。[0160]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0161]根据一个具体的实施方式，seqidno:2中的h495r修饰将seqidno:2的单个精氨酸(r)逆转为组氨酸(h)修饰(即，逆转为seqidno:25所示的wt序列)。[0162]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的两个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：n102d/e和l165q；n102d/e和q226t；n102d/e和l241i；n102d/e和s242p；n102d/e和k473w；n102d/e和h495r；l165q和q226t；l165q和l241i；l165q和s242p；l165q和k473w；l165q和h495r；q226t和l241i；q226t和s242p；q226t和k473w；q226t和h495r；l241i和s242p；l241i和k473w；l241i和h495r；s242p和k473w；s242p和h495r；或k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0163]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的三个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：n102d/e、l165q和q226t；n102d/e、l165q和l241i；n102d/e、l165q和s242p；n102d/e、l165q和k473w；n102d/e、l165q和h495r；n102d/e、q226t和l241i；n102d/e、q226t和s242p；n102d/e、q226t和k473w；n102d/e、q226t和h495r；n102d/e、l241i和s242p；n102d/e、l241i和k473w；n102d/e、l241i和h495r；n102d/e、s242p和k473w；n102d/e、s242p和h495r；n102d/e、k473w和h495r；l165q、q226t和l241i；l165q、q226t和s242p；l165q、q226t和k473w；l165q、q226t和h495r；l165q、l241i和s242p；l165q、l241i和k473w；l165q、l241i和h495r；l165q、s242p和k473w；l165q、s242p和h495r；l165q、k473w和h495r；q226t、l241i和s242p；q226t、l241i和k473w；q226t、l241i和h495r；q226t、s242p和k473w；q226t、s242p和h495r；l241i、s242p和k473w；l241i、s242p和h495r；或s242p,k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0164]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的四个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：n102d/e、l165q、q226t和l241i；n102d/e、l165q、q226t和s242p；n102d/e、l165q、q226t和k473w；n102d/e、l165q、q226t和h495r；n102d/e、q226t、l241i和s242p；n102d/e、q226t、l241i和k473w；n102d/e、q226t、l241i和h495r；n102d/e、l241i、s242p和k473w；n102d/e、l241i、s242p和h495r；n102d/e、s242p、k473w和h495r；l165q、q226t、l241i和s242p；l165q、q226t、l241i和k473w；l165q、q226t、l241i和h495r；l165q、l241i、s242p和k473w；l165q、l241i、s242p和h495r；l165q、s242p、k473w和h495r；q226t、l241i、s242p和k473w；q226t、l241i、s242p和h495r；或l241i、s242p、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0165]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的五个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：n102d/e、q226t、l241i、s242p和k473w；n102d/e、q226t、l241i、s242p和h495r；n102d/e、q226t、l241i、k473w和h495r；n102d/e、q226t、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l241i、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l165q、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l165q、l241i、k473w和h495r；n102d/e、l165q、l241i、s242p和h495r；n102d/e、l165q、l241i、s242p和k473w；n102d/e、l165q、q226t、k473w和h495r；n102d/e、l165q、q226t、s242p和h495r；n102d、l165q、q226t、s242p和k473w；n102d、l165q、q226t、l241i和h495r；n102d/e、l165q、q226t、l241i和k473w；q226t、l241i、s242p、k473w和h495r；l165q、l241i、s242p、k473w和h495r；l165q、q226t、s242p、k473w和h495r；l165q、q226t、l241i、k473w和h495r；l165q、q226t、l241i、s242p和h495r；或l165q,q226t、l241i、s242p和k473w，其中坐标对应于seqidno:2。[0166]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的六个：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：n102d/e、q226t、l241i、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l165q、l241i、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l165q、q226t、s242p、k473w和h495r；n102d/e、l165q、q226t、l241i、k473w和h495r；n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p和h495r；n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p和k473w；或l165q、q226t、l241i、s242p、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0167]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：n102d/e、l165q、q226t、l241i、s242p、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0168]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、n102d/e、h145k/r、l165q、i204k、e222k、k224n/g、q226t、l241i、s242p、t334f/y/k、t369e、n370d、l372n、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0169]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：i130t、a168s或d263n，其中坐标对应于seqidno:2。[0170]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的两个：i130t、a168s或d263n，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：i130t和a168s；i130t和d263n；或a168s和d263n，其中坐标对应于seqidno:2。[0171]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：i130t、a168s和d263n，其中坐标对应于seqidno:2。[0172]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、n102d/e、i130t、h145k/r、l165q、a168s、i204k、e222k、k224n/g、q226t、l241i、s242p、d263n、t334f/y/k、t369e、n370d、l372n、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0173]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：r211n或k303r，其中坐标对应于seqidno:2。[0174]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的两个：r211n和k303r，其中坐标对应于seqidno:2。[0175]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、n102d/e、i130t、h145k/r、l165q、a168s、i204k、r211n、e222k、k224n/g、q226t、l241i、s242p、d263n、k303r、t334f/y/k、t369e、n370d、l372n、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0176]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0177]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的两个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h60w和l103n/e/r；h60w和q166a；h60w和h274r；h60w和n333d；h60w和n386d；h60w和r395k；h60w和i406t/a；h60w和l420m/i；l103n/e/r和q166a；l103n/e/r和h274r；l103n/e/r和n333d；l103n/e/r和n386d；l103n/e/r和r395k；l103n/e/r和i406t/a；l103n/e/r和l420m/i；q166a和h274r；q166a和n333d；q166a和n386d；q166a和r395k；q166a和i406t/a；q166a和l420m/i；h274r和n333d；h274r和n386d；h274r和r395k；h274r和i406t/a；h274r和l420m/i；n333d和n386d；n333d和r395k；n333d和i406t/a；n333d和l420m/i；n386d和r395k；n386d和i406t/a；n386d和l420m/i；r395k和i406t/a；r395k和l420m/i；或i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0178]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的三个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h60w、l103n/e/r和q166a；h60w、l103n/e/r和h274r；h60w、l103n/e/r和n333d；h60w、l103n/e/r和n386d；h60w、l103n/e/r和r395k；h60w、l103n/e/r和i406t/a；h60w、l103n/e/r和l420m/i；h60w、q166a和h274r；h60w、q166a和n333d；h60w、q166a和n386d；h60w、q166a和r395k；h60w、q166a和i406t/a；h60w、q166a和l420m/i；h60w、h274r和n333d；h60w、h274r和n386d；h60w、h274r和r395k；h60w、h274r和i406t/a；h60w、h274r和l420m/i；h60w、n333d和n386d；h60w、n333d和r395k；h60w、n333d和i406t/a；h60w、n333d和l420m/i；h60w、n386d和r395k；h60w、n386d和i406t/a；h60w、n386d和l420m/i；h60w、r395k和i406t/a；h60w、r395k和l420m/i；h60w、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a和h274r；l103n/e/r、q166a和n333d；l103n/e/r、q166a和n386d；l103n/e/r、q166a和r395k；l103n/e/r、q166a和i406t/a；l103n/e/r、q166a和l420m/i；l103n/e/r、h274r和n333d；l103n/e/r、h274r和n386d；l103n/e/r、h274r和r395k；l103n/e/r、h274r和i406t/a；l103n/e/r、h274r和l420m/i；l103n/e/r、n333d和n386d；l103n/e/r、n333d和r395k；l103n/e/r、n333d和i406t/a；l103n/e/r、n333d和l420m/i；l103n/e/r、n386d和r395k；l103n/e/r、n386d和i406t/a；l103n/e/r、n386d和l420m/i；l103n/e/r、r395k和i406t/a；l103n/e/r、r395k和l420m/i；l103n/e/r、i406t/a和l420m/i；q166a、h274r和n333d；q166a、h274r和n386d；q166a、h274r和r395k；q166a、h274r和i406t/a；q166a、h274r和l420m/i；q166a、n333d和n386d；q166a、n333d和r395k；q166a、n333d和i406t/a；q166a、n333d和l420m/i；q166a、n386d和r395k；q166a、n386d和i406t/a；q166a、n386d和l420m/i；q166a、r395k和i406t/a；q166a、r395k和l420m/i；h274r,n333d和n386d；h274r、n333d和r395k；h274r、n333d和i406t/a；h274r,n333d和l420m/i；h274r、n386d和r395k；h274r、n386d和i406t/a；h274r、n386d和l420m/i；h274r、r395k和i406t/a；h274r、r395k和l420m/i；h274r、i406t/aa和l420m/i；n333d、n386d和r395k；n333d、n386d和i406t/aa；n333d、n386d和l420m/i；n333d、r395k和i406t/a；n333d、r395k和l420m/i；n333d、i406t/a和l420m/i；n386d、r395k和i406t/aa；n386d、r395k和l420m/i；n386d、i406t/aa和l420m/i；或r395k、i406t/aa和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0179]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的四个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h60w、l103n/e/r、q166a和h274r；h60w、l103n/e/r、q166a和n333d；h60w、l103n/e/r、q166a和n386d；h60w、l103n/e/r、q166a和r395k；h60w、l103n/e/r、q166a和i406t/a；h60w、l103n/e/r、q166a和l420m/i；h60w、q166a、h274r和n333d；h60w、q166a、h274r和n386d；h60w、q166a、h274r和r395k；h60w、q166a、h274r和i406t/a；h60w、q166a、h274r和l420m/i；h60w、q166a、n333d和n386d；h60w、q166a、n333d和r395k；h60w、q166a、n333d和i406t/a；h60w、q166a、n333d和l420m/i；h60w、q166a、n386d和r395k；h60w、q166a、n386d和i406t/a；h60w、q166a、n386d和l420m/i；h60w、q166a、r395k和i406t/a；h60w、q166a、r395k和l420m/i；h60w、q166a、i406t/a和l420m/i；h60w、h274r、n333d和n386d；h60w、h274r、n333d和r395k；h60w、h274r、n333d和i406t/a；h60w、h274r、n333d和l420m/i；h60w、n333d、n386d和r395k；h60w、n333d、n386d和i406t/a；h60w、n333d、n386d和l420m/i；h60w、n386d、r395k和i406t/a；h60w、n386d、r395k和l420m/i；h60w、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r和n333d；l103n/e/r、q166a、h274r和n386d；l103n/e/r、q166a、h274r和r395k；l103n/e/r、q166a、h274r和i406t/a；l103n/e/r、q166a、h274r和l420m/i；l103n/e/r、h274r、n333d和n386d；l103n/e/r、h274r、n333d和r395k；l103n/e/r、h274r、n333d和i406t/a；l103n/e/r、h274r、n333d和l420m/i；l103n/e/r、n333d、n386d和r395k；l103n/e/r、n333d、n386d和i406t/a；l103n/e/r、n333d、n386d和l420m/i；l103n/e/r、n386d、r395k和i406t/a；l103n/e/r、n386d、r395k和l420m/i；l103n/e/r、r395k、i406t/a和l420m/i；或n386d、r395k、i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0180]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的五个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r和n333d；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r和n386d；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r和r395k；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r和i406t/a；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r和l420m/i；h60w、q166a、h274r、n333d和n386d；h60w、q166a、h274r、n333d和r395k；h60w、q166a、h274r、n333d和i406t/a；h60w、q166a、h274r、n333d和l420m/i；h60w、h274r、n333d、n386d和r395k；h60w、h274r、n333d、n386d和i406t/a；h60w、h274r、n333d、n386d和l420m/i；h60w、n333d、n386d、r395k和i406t/a；h60w、n333d、n386d、r395k和l420m/i；h60w、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和n386d；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和r395k；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和i406t/a；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和l420m/i；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d和r395k；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d和i406t/a；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d和l420m/i；l103n/e/r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；l103n/e/r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；l103n/e/r、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；q166a、h274r、n333d、n386d和r395k；q166a、h274r、n333d、n386d和i406t/a；q166a、h274r、n333d、n386d和l420m/i；q166a、n333d、n386d、r395k和i406t/a；q166a、n333d、n386d、r395k和l420m/i；q166a、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；或n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0181]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的六个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可以进一步包含突变：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和n386d；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和r395k；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和i406t/a；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d和l420m/i；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d和r395k；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d和i406t/a；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d和l420m/i；h60w、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；h60w、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；h60w、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和r395k；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和i406t/a；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和l420m/i；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；l103n/e/r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；或h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0182]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的七个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和r395k；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和i406t/a；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d和l420m/i；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；h60w、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/a；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；l103n/e/r、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、r395k、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、i406t/a和l420m/i；l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；或q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0183]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的八个：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a或l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。因此，例如，gcase多肽可进一步包含突变：l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、r395k、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、i406t/a和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和l420m/i；h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k和i406t/aa，其中坐标对应于seqidno:2。[0184]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：h60w、l103n/e/r、q166a、h274r、n333d、n386d、r395k、i406t/a和l420m/i，其中坐标对应于seqidno:2。[0185]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个：：l34p、h60w、n102d、l103n、i130t、h145k/r、l165q、q166a、a168s、i204k、r211n、e222k、k224n、q226t、l241i、s242p、d263n、h274r、k303r、n333d、t334f/y、t369e、n370d、l372n、n386d、r395k、i406t、l420m、k473w、h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0186]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、h60w、n102d、l103n、i130t、h145k/r、l165q、q166a、a168s、i204k、r211n、e222k、k224n、q226t、l241i、s242p、d263n、h274r、k303r、n333d、t334f/y、t369e、n370d、l372n、n386d、r395k、i406t、l420m、k473w和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0187]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：v78i、a95k、v191m、a322d、v343t、m361e、s364a、h374w、t410e、h451n或l480i，其中坐标对应于seqidno:2。[0188]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个：v78i、a95k、v191m、a322d、v343t、m361e、s364a、h374w、t410e、h451n或l480i，其中坐标对应于seqidno:2。[0189]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：v78i、a95k、v191m、a322d、v343t、m361e、s364a、h374w、t410e、h451n和l480i，其中坐标对应于seqidno:2。[0190]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个：l34p、h60w、v78i、a95k、n102e、l103e、i130t、h145k/r、l165q、q166a、a168s、v191m、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、a322d、t334k、v343t、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、i406a、t410e、l420i、h451n、k473w、l480i和/或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0191]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、h60w、v78i、a95k、n102e、l103e、i130t、h145k/r、l165q、q166a、a168s、v191m、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、a322d、t334k、v343t、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、i406a、t410e、l420i、h451n、k473w、l480i和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0192]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：h162k、s181a、t297s、m335f、k346h、s431a、s465d或a476d，其中坐标对应于seqidno:2。[0193]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少2、3、4、5、6或7个：h162k、s181a、t297s、m335f、k346h、s431a、s465d或a476d，其中坐标对应于seqidno:2。[0194]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：h162k、s181a、t297s、m335f、k346h、s431a、s465d和a476d，其中坐标对应于seqidno:2。[0195]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个：l34p、h60w、v78i、a95k、n102e、l103e、i130t、h145k/r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、v191m、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t297s、a322d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、n386d、r395k、i406a、t410e、l420i、s431a、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i和/或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0196]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、h60w、v78i、a95k、n102e、l103e、i130t、h145k/r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、v191m、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t297s、a322d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、n386d、r395k、i406a、t410e、l420i、s431a、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0197]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：r47k、l51r、q70h、l91i、g115e、a124g、d140n/g、s196t或v437s，其中坐标对应于seqidno:2。[0198]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少2、3、4、5、6、7或8个：r47k、l51r、q70h、l91i、g115e、a124g、d140n/g、s196t或v437s，其中坐标对应于seqidno:2。[0199]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：r47k、l51r、q70h、l91i、g115e、a124g、d140n/g、s196t和v437s，其中坐标对应于seqidno:2。[0200]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55个：l34p、r47k、l51r、h60w、q70h、v78i、l91i、a95k、n102e、l103e、g115e、a124g、i130t、d140n/g、h145k/r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、v191m、s196t、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t297s、a322d、n333d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、n386d、r395k、i406a、t410e、l420m、s431a、v437s、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i和/或h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0201]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、r47k、l51r、h60w、q70h、v78i、l91i、a95k、n102e、l103e、g115e、a124g、i130t、d140n/g、h145k/r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、v191m、s196t、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t297s、a322d、n333d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、n386d、r395k、i406a、t410e、l420m、s431a、v437s、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0202]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少一个：t36q、s38a、q143e、t183a、l185m、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、e300r、k321e、v376t、k408r、q440e、m450q和/或i483v，其中坐标对应于seqidno:2。[0203]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个：t36q、s38a、q143e、t183a、l185m、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、e300r、k321e、v376t、k408r、q440e、m450q和/或i483v，其中坐标对应于seqidno:2。[0204]根据一个实施方式，gcase多肽还包含以下突变中的所有突变：t36q、s38a、q143e、t183a、l185m、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、e300r、k321e、v376t、k408r、q440e、m450q和/或i483v，其中坐标对应于seqidno:2。[0205]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72个：l34p、t36q、s38a、r47k、l51r、h60w、q70h、v78i、l91i、a95k、n102e、l103r、g115e、a124g、i130t、d140g、q143e、h145r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、t183a、l185m、v191m、s196t、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、t297s、e300r、k321e、a322d、n333d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、v376t、n386d、r395k、i406a、k408r、t410e、l420m、s431a、v437s、q440e、m450q、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i、i483v和h495r，其中坐标对应于seqidno:2，其中坐标对应于seqidno:2。[0206]根据一个实施方式，gcase多肽包含以下突变中的所有突变：l34p、t36q、s38a、r47k、l51r、h60w、q70h、v78i、l91i、a95k、n102e、l103r、g115e、a124g、i130t、d140g、q143e、h145r、h162k、l165q、q166a、a168s、s181a、t183a、l185m、v191m、s196t、i204k、r211n、e222k、k224g、q226t、l241i、s242p、d263n、t272s、h274k、n275d、l286s、k293q、t297s、e300r、k321e、a322d、n333d、t334k、m335f、v343t、k346h、m361e、s364a、t369e、n370d、l372n、h374w、v376t、n386d、r395k、i406a、k408r、t410e、l420m、s431a、v437s、q440e、m450q、h451n、s465d、k473w、a476d、l480i、i483v和h495r，其中坐标对应于seqidno:2。[0207]如上所述，酶的催化结构域的氨基酸未被修饰。[0208]根据一个实施方式，gcase多肽的坐标：d127、f128、w179、n234、e235、y244、f246、q284、y313、e340、s345、w381、n396处的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸未被修饰，其中坐标对应于seqidno:2。[0209]根据一个实施方式，gcase多肽的所有下列坐标：d127、f128、w179、n234、e235、y244、f246、q284、y313、e340、s345、w381、n396处的氨基酸未被修饰，其中坐标对应于seqidno:2。[0210]根据一个实施方式，gcase多肽包含与选自seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22和27的序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。这种测定可以使用例如ncbi的标准蛋白-蛋白blast(standardprotein-proteinblast)[blastp]软件进行。[0211]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少85％相同的氨基酸序列。[0212]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少90％相同的氨基酸序列。[0213]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少95％相同的氨基酸序列。[0214]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少96％相同的氨基酸序列。[0215]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少97％相同的氨基酸序列。[0216]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少98％相同的氨基酸序列。[0217]根据一个具体的实施方式，经基因修饰的人gcase包含与seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27具有至少99％相同的氨基酸序列。[0218]根据一个实施方式，gcase多肽包含与选自由seqidno:4、6、8、10、12、14、18、20、22或27组成的组的序列相同的氨基酸序列。[0219]根据一个实施方式，gcase多肽包含与seqidno:14至少95％相同的氨基酸序列。[0220]根据一个实施方式，gcase多肽包含seqidno:14所示的氨基酸序列。[0221]根据一个实施方式，gcase多肽包含与seqidno:22至少95％相同的氨基酸序列。[0222]根据一个实施方式，gcase多肽包含seqidno:22所示的氨基酸序列。[0223]根据一个实施方式，gcase多肽包含与seqidno:27至少95％相同的氨基酸序列。[0224]根据一个实施方式，gcase多肽包含seqidno:27所示的氨基酸序列。[0225]本发明一些实施方式的多肽可以通过多肽合成领域技术人员已知的任何技术来合成。根据一个实施方式，可以使用重组dna技术合成本发明的多肽。[0226]优选使用重组技术来产生本发明的多肽。这种重组技术描述于以下文献中：bitter等人,(1987)酶学方法(methodsinenzymol)153:516-544；studier等人，(1990)酶学方法(methodsinenzymol)185:60-89；brisson等人，(1984)自然(nature)310:511-514；takamatsu等人，(1987)欧洲分子生物学学会杂志(emboj.)6:307-311；coruzzi等人(1984)欧洲分子生物学学会杂志(emboj.)3:1671-1680和brogli等人(1984)科学(science)224:838-843；gurley等人(1986)分子细胞生物学(mol.cell.biol.)6:559-565，和weissbach&weissbach,1988,植物分子生物学方法(methodsforplantmolecularbiology)，学术出版社(academicpress)纽约,第viii章，第421-463页。[0227]为了使用重组技术生产本发明的多肽，将编码本发明多肽的多核苷酸连接到核酸表达构建体中，所述核酸表达构建体包括在顺式调节(cis-regulatory)(例如，启动子)序列的转录控制下的多核苷酸序列，所述顺式调节(例如，启动子)序列适于在宿主细胞中指导组成型或诱导型转录，如下文进一步描述。[0228]本教导还提供了编码基因修饰的人gcase多肽的核酸序列。[0229]如本文所用，短语“分离的多核苷酸(anisolatedpolynucleotide)”是指以rna序列、互补多核苷酸序列(complementarypolynucleotidesequence，cdna)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，上述序列的组合)的形式分离和提供的单链或双链核酸序列。[0230]用于表达本发明多肽的示例性多核苷酸序列如seqidnos:3、5、7、9、11、13、17、19、21、23或26所示。[0231]除了包含插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件之外，本发明的表达构建体还可以包括经工程改造以增强所表达的多肽的稳定性、生产、纯化、产量或降低的毒性的序列(即标签)。这样的融合蛋白可以被设计成使得该融合蛋白可以容易地通过亲和层析分离；例如，通过固定在对外源蛋白(heterologousprotein)特异性的柱上。当在肽部分和外源蛋白之间设计切割位点时，可以通过用适当的酶或试剂处理而将肽从色谱柱中释放出来[例如，参见booth等人，(1988)免疫学通讯(immunol.lett.)19:65-70；和gardella等人，(1990)生物化学杂志(j.biol.chem.)265:15854-15859]。[0232]各种原核或真核细胞可用作宿主表达系统以表达多肽编码序列。[0233]原核细胞包括但不限于微生物，例如用含有多肽编码序列的重组噬菌体dna、质粒dna或粘粒dna表达载体转化的细菌。[0234]真核细胞包括真核生物的任何细胞，包括但不限于单细胞和多细胞生物。单细胞真核生物包括但不限于酵母、原生动物、粘菌(slimemolds)和藻类。多细胞真核生物包括但不限于动物(例如哺乳动物、昆虫、无脊椎动物、线虫、鸟类、鱼类、爬行动物和甲壳类动物)、植物、真菌和藻类(例如褐藻、红藻、绿藻)。[0235]根据一个实施方式，细胞是植物细胞。[0236]植物细胞可以来源于任何植物组织，例如果实、花、根、叶、胚胎、胚胎细胞悬浮液、愈伤组织或幼苗组织。[0237]根据一个实施方式，真核细胞不是植物的细胞。[0238]根据一个实施方式，真核细胞是动物细胞。[0239]根据一个实施方式，真核细胞是脊椎动物的细胞。[0240]根据一个实施方式，真核细胞是无脊椎动物的细胞。[0241]根据一个具体的实施方式，无脊椎动物细胞是昆虫、蜗牛、蛤(clam)、章鱼、海星(starfish)、海胆、水母和蠕虫的细胞。[0242]根据一个具体的实施方式，无脊椎动物细胞是甲壳类动物的细胞。示例性甲壳类动物包括但不限于虾(shrimps)、明虾(prawns)、蟹、龙虾(lobsters)和螯虾(crayfishes)。[0243]根据一个具体的实施方式，无脊椎动物细胞是鱼的细胞。示例性的鱼包括但不限于鲑鱼、金枪鱼、鳕鱼(绿青鳕)、鲶鱼(catfish)、鳕鱼(cod)、黑线鳕(haddock)、海鲈鱼(seabass)、罗非鱼(tilapia)、北极碳鱼(arcticchar)和鲤鱼(carp)。[0244]哺乳动物表达系统也可用于表达本发明的多肽。能够糖基化gcase多肽的细胞系统是有利的。[0245]根据一个实施方式，真核细胞是哺乳动物细胞。[0246]根据一个具体的实施方式，哺乳动物细胞是非人类生物体的细胞，例如但不限于啮齿动物、兔、猪、山羊、反刍动物(例如牛、绵羊、羚(antelope)、鹿和长颈鹿)、狗、猫、马和非人类灵长类动物。[0247]根据一个具体的实施方式，真核细胞是人类的细胞。[0248]根据一个实施方式，真核细胞是原代细胞、细胞系、体细胞、生殖细胞、干细胞、胚胎干细胞、成年干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell，ips)、配子细胞(gametecell)、合子细胞(zygotecell)、囊胚细胞(blastocystcell)、胚胎(embryo)、胎儿和/或供体细胞。[0249]根据一个具体的实施方式，所述细胞是人类胚胎细胞。[0250]根据一个具体的实施方式，所述细胞是人类胚胎肾细胞。[0251]根据一个具体的实施方式，所述细胞是hek293t细胞。[0252]根据一个具体的实施方式，细胞能够进行蛋白质糖基化(即修饰的人gcase)。[0253]可以用含有多肽编码序列的重组表达载体来转化真核细胞。例如，用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，camv；烟草花叶病毒，tmv)或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体如ti质粒进行转化。[0254]在任何情况下，转化的细胞在有效条件下培养，这允许表达大量的重组多肽。有效的培养条件包括但不限于允许蛋白质生产的有效培养基、生物反应器、温度、ph和氧气条件。有效的培养基是指在其中培养细胞以产生本发明的重组多肽的任何培养基。这种培养基通常包括具有可同化的碳、氮和磷酸盐源以及适当的盐、矿物质、金属和其它营养物如维生素的水溶液。本发明的细胞可以在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿(microtiterdishes)和培养皿中培养。培养可以在适合重组细胞的温度、ph和氧含量下进行。这种培养条件在本领域普通技术人员的专业知识范围内。[0255]根据用于生产的载体和宿主系统，本发明的所得蛋白可以保留在重组细胞内；被分泌到发酵培养基中；被分泌到两个细胞膜之间的空间中，例如大肠杆菌中的周质空间；或保留在细胞或病毒膜的外表面上。[0256]与野生型人gcase相比，本发明一些实施方式的gcase多肽被赋予了来自细胞(例如，上述宿主表达系统)的更高表达水平和/或更高的分泌水平。[0257]术语“野生型(wild-type)”是指人葡糖神经酰胺酶(humanglucosylceramidase)(人gcase(humangcase))，例如seqidno:2或seqidno:25所示。[0258]根据一个实施方式，与野生型人gcase(例如，在相同的培养条件下)相比，更高的表达水平和/或更高的分泌水平为约5-25％、10-50％、10-100％、20-90％、25-75％、30-80％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、90-99％或95-100％。[0259]根据一个实施方式，与野生型人gcase(例如，在相同的培养条件下)相比，更高的表达水平和/或更高的分泌水平为约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。[0260]根据一个实施方式，如下所述，与相同培养条件下的野生型人gcase(例如来自hek293t细胞)相比，gcase多肽在真核细胞中包含约1.3-5倍(例如3倍)高的细胞内表达水平。[0261]根据一个实施方式，如下所述，与在相同培养条件下不分泌的野生型gcase相比，gcase多肽是从真核细胞(例如，从hek293t细胞)分泌的。[0262]下面讨论评估表达水平的方法。[0263]培养一定时间后，进行重组蛋白的回收。短语“回收重组蛋白(recoveringtherecombinantprotein)”是指收集含有该蛋白的整个发酵培养基，并且不需要另外的分离或纯化步骤。本发明的蛋白质可以使用多种标准蛋白质纯化技术来纯化，例如但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、伴刀豆球蛋白a层析、层析聚焦和差异溶解(differentialsolubilization)。[0264]不管生产gcase变体多肽的方法如何，经基因修饰的人gcase保持人gcase的催化活性。此外，经基因修饰的人gcase包括增加的热稳定性。较高的表达水平和热稳定性以及gcase多肽的持续催化活性有利于酶替代疗法(ert)，特别是有利于戈谢病的治疗(下文讨论)。[0265]如以下实施例部分所讨论的(参见以下实施例4、7和10)，gcase变体d7、d15和d16在分别与野生型gcase和相比时具有相当的酶活性(参见以下表2、4和6)。[0266]根据一个实施方式，gcase多肽在相同条件(即相同的实验条件，例如相同的缓冲液、温度、ph等)下能够类似于野生型gcase催化glccer的水解。[0267]根据一个实施方式，gcase多肽能够以至少约0.1至2.5×106kcat/km(m-1min-1)(例如，0.15至2.0×106kcat/km(m-1min-1))，催化glccer，例如人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)的水解。[0268]根据一个实施方式，gcase多肽能够以至少约0.1×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer，例如人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)的水解。[0269]根据一个实施方式，gcase多肽能够以至少约0.2×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer，例如人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)的水解。[0270]根据一个实施方式，gcase多肽能够以至少约0.3×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer，例如人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)的水解。[0271]根据一个实施方式，gcase多肽能够以至少约0.5×106kcat/km(m-1min-1)催化glccer，例如人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)的水解。[0272]根据一个具体的实施方式，gcase多肽能够以至少约1.0×106kcat/km(m-1min-1)催化p-np-glc的水解。[0273]根据一个具体的实施方式，gcase多肽能够以至少约1.5×106kcat/km(m-1min-1)催化p-np-glc的水解。[0274]根据一个具体的实施方式，gcase多肽能够以至少约1.6×106kcat/km(m-1min-1)催化p-np-glc的水解。[0275]根据一个具体的实施方式，gcase多肽能够以至少约1.7×106kcat/km(m-1min-1)催化p-np-glc的水解。[0276]根据一个具体的实施方式，gcase多肽能够以至少约1.8×106kcat/km(m-1min-1)催化p-np-glc的水解。[0277]测量本文所述的gcase多肽的催化效率的方法是本领域已知的，包括例如原位活性测定(使用例如施加在含有活性酶的细胞上的底物)、体外活性测定(其中在从细胞提取的蛋白质混合物中测量特定酶的活性)。例如，可以使用对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(β-np-glc)作为底物进行酶活性测定[在weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299-308中讨论，通过引用并入本文]。[0278]如在以下实施例部分所讨论的(参见以下实施例3、6和9)，与野生型gcase和gcase变体d7、d15和d16具有更高的热稳定性。具体地，在ph6.1下，d7gcase显示出比野生型gcase高约6-7℃的热稳定性，比(参见下表1)高约11℃的热稳定性。在相同ph水平下，d15gcase显示出比野生型gcase高约12-13℃的热稳定性，比(参见下表1和3)高约17℃的热稳定性。类似地，d16gcase显示出比高约19℃的显著增加的热稳定性(参见下表5)。[0279]根据一个实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽显示出比野生型多肽高约3-22℃(例如15-22℃、10-20℃、5-15℃、7-13℃、9-11℃)温度范围的热稳定性。[0280]相对于野生型多肽，术语“热稳定性(thermalstability)”或“增加的热稳定性(increasedthermalstability)”是指gcase多肽具有增加的热稳定性，即抵抗随着温度的升高而变性的能力。量化热稳定性的标准技术是本领域已知的，包括但不限于圆二色性、差示扫描量热法和表面等离子体共振。[0281]测量本文所述的gcase多肽的热稳定性的方法是本领域已知的，包括，例如，如weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299-308中所讨论的酶稳定性测定(通过引用并入本文)。[0282]根据一个实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃的热稳定性。[0283]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约5℃的热稳定性。[0284]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约7℃的热稳定性。[0285]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约9℃的热稳定性。[0286]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约11℃的热稳定性。[0287]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约13℃的热稳定性。[0288]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约15℃的热稳定性。[0289]根据一个具体的实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比野生型gcase高约17℃的热稳定性。[0290]根据一个实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽显示出比多肽高约3-22℃(例如15-22℃、10-20℃、5-15℃、7-13℃、9-11℃)温度范围的热稳定性。[0291]术语也称为伊米苷酶(imiglucerase)，是一种用于酶替代疗法的商业药物。[0292]根据一个实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃的热稳定性。[0293]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约5℃的热稳定性。[0294]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约7℃的热稳定性。[0295]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约9℃的热稳定性。[0296]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约11℃的热稳定性。[0297]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约13℃的热稳定性。[0298]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约15℃的热稳定性。[0299]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约17℃的热稳定性。[0300]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在6.1的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约19℃的热稳定性。[0301]根据一个实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽显示出比多肽高约15-22℃(例如17-23℃、19-23℃)温度范围的热稳定性。[0302]根据一个实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃的热稳定性。[0303]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约15℃的热稳定性。[0304]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约17℃的热稳定性。[0305]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约20℃的热稳定性。[0306]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约22℃的热稳定性。[0307]根据一个具体实施方式，在相同条件(例如在7.4的ph)下，gcase多肽具有比多肽高约25℃的热稳定性。[0308]如上所述，gcase多肽在真核细胞高度表达和分泌。在真核细胞中的表达能够使gcase糖基化，这对于gcase活性是至关重要的。[0309]根据另一个实施方式，与在相同培养条件下不分泌的野生型多肽相比，gcase多肽是从真核细胞中分泌的。[0310]根据一个实施方式，在相同培养条件下，从真核细胞(例如hek293t细胞)分泌的gcase多肽比野生型gcase高约1.5-10倍(例如，约1.5-2倍、约2-3倍、约3-4倍、约4-5倍、约5-6倍、约6-7倍、约8-9倍、约9-10倍)。[0311]根据一个实施方式，在相同培养条件下，从真核细胞(例如hek293t细胞)分泌的gcase多肽比野生型gcase高约3倍。[0312]根据一个实施方式，在相同培养条件下，从真核细胞(例如hek293t细胞)分泌的gcase多肽比野生型gcase高约5倍。[0313]根据一个实施方式，在相同培养条件下，从真核细胞(例如hek293t细胞)分泌的gcase多肽比野生型gcase高约10倍。[0314]根据一个实施方式，在相同培养条件下(例如，来自hek293t细胞)，gcase多肽在真核细胞中具有比野生型gcase高约1.3-5倍(例如，约1.3-2倍、约1.3-3倍、约2-3倍、约2-4倍、约3-4倍、约4-5倍)的细胞内表达水平。[0315]根据一个实施方式，在相同培养条件下，gcase多肽在真核细胞中具有比野生型gcase高约1.3倍的细胞内表达水平。[0316]根据一个实施方式，在相同培养条件下(例如，来自hek293t细胞)，gcase多肽在真核细胞中具有比野生型gcase高约2倍的细胞内表达水平。[0317]根据一个实施方式，在相同培养条件下(例如，来自hek293t细胞)，gcase多肽在真核细胞中具有比野生型gcase高约3倍的细胞内表达水平。[0318]根据一个实施方式，在相同培养条件下(例如，来自hek293t细胞)，gcase多肽在真核细胞中具有比野生型gcase高约4倍的细胞内表达水平。[0319]如本文所用，短语“表达水平(levelofexpression或expressionlevel)”是指生物样本(例如真核细胞)中基因表达和/或基因产物活性的程度。[0320]应当注意，表达水平可以以任意绝对单位或归一化单位(相对于对照参考的已知表达水平)来确定。[0321]根据一个实施方式，在相同培养条件下，来自真核细胞的gcase多肽的分泌水平可比野生型多肽的分泌水平高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。[0322]根据一个实施方式，在相同培养条件下，真核细胞中gcase多肽的细胞内表达水平可比野生型多肽的细胞内表达水平可高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。[0323]根据具体的实施方式，使用rna和/或蛋白质检测方法测定表达量。[0324]检测细胞中rna表达水平的方法的非限制性示例包括印迹分析(northernblotanalysis)、rt-pcr分析、rna原位杂交染色和原位rt-pcr染色。[0325]检测细胞中特定蛋白质分子的水平和/或活性的方法的非限制性示例包括酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)、蛋白质印迹分析(westernblotanalysis)、免疫沉淀反应(immunoprecipitation，ip)、放射免疫测定(radio-immunoassay，ria)、荧光激活细胞分选(fluorescenceactivatedcellsorting，facs)、免疫组化分析(immunohistochemicalanalysis)、原位活性测定(insituactivityassay)(使用例如施加在含有活性酶的细胞上的底物)。体外活性测定(invitroactivityassays)(其中在从细胞中提取的蛋白质混合物中测量特定酶的活性)和基于分子量的方法。在需要检测分泌蛋白的表达水平的情况下，可以在培养细胞的细胞培养基(即含有细胞分泌内容物的细胞培养基)上进行elisa测定。[0326]根据一个实施方式，提供了包含至少一种外源多核苷酸或构建体(如上所述)的分离的细胞。[0327]根据一个实施方式，分离的细胞是真核细胞(如上所述)。[0328]本发明一些实施方式的经基因修饰的人gcase，一些实施方式的分离的多核苷酸，一些实施方式的构建体，或本发明一些实施方式的细胞，可以施用于生物体本身，或在与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物中施用。[0329]本文所用，“药物组合物(pharmaceuticalcomposition)”是指本文所述的一种或多种活性成分与其它化学成分如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。[0330]本文中，术语“活性成分(activeingredient)”是指负责生物效应的经基因修饰的人gcase。[0331]下文中，短语“生理学上可接受的载体(physiologicallyacceptablecarrier)”和“药学上可接受的载体(pharmaceuticallyacceptablecarrier)”可以互换使用，是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。在这些短语中包括佐剂。[0332]本文中，术语“赋形剂(excipient)”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的惰性物质。赋形剂的示例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。[0333]可以在以下文献中找到药物的配制和给药技术：“雷明登氏药学全书(remington'spharmaceuticalsciences)”，麦克出版公司(mackpublishingco.)，easton,pa，最新版，其通过引用并入本文。[0334]合适的给药途径可以例如包括口服、直肠、经粘膜，特别是经鼻、肠或肠胃外给药，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内，例如进入右室腔或左心室腔，进入普通冠状动脉、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。[0335]用于药物递送至中枢神经系统(centralnervoussystem，cns)的常规方法包括：神经外科策略(例如，脑内注射或脑室内输注)；试图利用bbb的内源性转运途径之一对药剂进行的分子操作(例如，产生嵌合融合蛋白，其包含转运肽，所述转运肽对内皮细胞表面分子具有亲和力，并且与本身不能穿过bbb的试剂组合)；设计用于增加药剂脂溶性的药理学策略(例如，水溶性药剂与脂质或胆固醇载体的结合)；以及通过高渗性破裂(hyperosmoticdisruption)(由甘露醇溶液注入颈动脉或使用血管紧张素肽等生物活性剂引起)对血脑屏障(bbb)完整性的暂时破坏。然而，这些策略中的每一种都有局限性，例如与侵入性外科手术相关的固有风险，由内源性转运系统固有的局限性所造成的尺寸限制，与全身性施用嵌合分子(所述嵌合分子包含在cns外可能有活性的载体基序)相关的潜在的不良生物副作用，以及在bbb被破坏的脑区域内的脑损伤的可能风险。这使它成为一种次优的递送方法。[0336]可替代地，可以以局部方式而非全身的方式施用药物组合物，例如通过将药物组合物直接注射到患者的组织区域中。[0337]本发明的一些实施方式的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封(encapsulating)、包埋(entrapping)或冻干方法。[0338]因此，根据本发明一些实施方式使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包含赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成可药用的制剂。合适的剂型(formulation)取决于所选的给药途径。[0339]对于注射，药物组合物的活性成分可以配制在在水溶液中，优选配制在在生理相容的缓冲液中，例如汉克氏液(hank’ssolution)、林格氏液(ringer’ssolution)或生理盐缓冲液。对于经粘膜给药，在制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的。[0340]对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域公知的药学上可接受的载体组合来容易地配制药物组合物。这种载体使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以供患者口服摄入(oralingestion)。用于口服使用的药物制剂可以使用固体赋形剂制备，任选地研磨所得混合物，如果需要，在加入合适的助剂后，加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，pvp)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。[0341]糖衣丸芯具有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素添加到片剂或糖衣丸包衣中，以用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。[0342]可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合式胶囊(push-fitcapsules)以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊。推入配合式胶囊可含有与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。用于口服给药的所有制剂的的剂量都应适合所选的给药途径。[0343]对于颊内给药(buccaladministration)，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。[0344]对于通过鼻吸入给药，根据本发明一些实施方式使用的活性成分方便地以气溶胶喷雾给药(气溶胶喷雾给药)的形式从加压包装或喷雾器中递送，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以输送计量的量来确定。用于分配器中的例如明胶的胶囊和药筒可以配制成含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。[0345]本文所述的药物组合物可以配制用于肠胃外给药，例如通过弹丸注射(bolusinjection)或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型(unitdosage)形式存在，例如在安瓿中或多剂量容器中，任选地添加防腐剂。组合物可以是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制试剂(formulatoryagents)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。[0346]用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。此外，活性成分的悬浮液可以制备成合适的油基或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)，或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯)，甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液(aqueousinjectionsuspensions)可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。[0347]可替代地，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前与合适的载体，例如无菌、无热原的水基溶液一起配制。[0348]还可以使用例如常规栓剂基质(例如可可脂)或其它甘油酯，将本发明一些实施方式的药物组合物配制成直肠组合物，例如，栓剂或保留灌肠剂。[0349]适用于本发明一些实施方式上下文中的药物组合物包含组合物，该组合物中活性成分的含量能有效达到预期目。更具体地，治疗有效量是指有效预防、减轻或改善病症(例如戈谢病)的症状，或延长被治疗的主体的存活的活性成分(经基因修饰的人gcase)的量。[0350]治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。[0351]对于在本发明方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以最初从体外和细胞培养试验(cellcultureassays)中估计。例如，可以在动物模型中配制剂量以实现所需的浓度或滴定度(titer)。这种信息可用于更准确地确定人体的有效剂量。[0352]例如，可以采用gcase活性的任何体内或体外测定(invivoorinvitroassay)，例如利用farfel-becker等人[farfel-becker，vitner和futerman，疾病模式与机制(dismodelmech)(2011)4(6):746–752]讨论的戈谢病的动物模型。[0353]本文所述活性成分的毒性和治疗效果可通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定。从这些体外和细胞培养试验以及动物研究中获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。剂量可以根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。具体的制剂、给药途径和剂量可以由个体医生根据患者的状况来选择。(参见，例如，fingl等人，1975，“治疗学的药理学基础(thepharmacologicalbasisoftherapeutics)”，第1页第1章(ch.1p.1))。[0354]可以单独调节剂量和间隔，以提供足够量的活性成分来诱导或抑制生物效应(最小有效浓度(minimaleffectiveconcentration)，mec)。每种制剂的mec会有所不同，但是可以从体外数据估计。达到mec所必需的剂量将取决于个体特征和给药途径。检测测定可用于确定血浆浓度。[0355]根据待治疗疾病的严重程度和反应性，给药可以是单次或多次给药，疗程持续几天至几周或直到实现治愈或实现疾病状态的减轻。[0356]当然，组合物的给药量将取决于被治疗的主体、病痛的严重程度、给药方式、处方医生的判断等。[0357]如果需要，本发明一些实施方式的组合物可以存在于包装或分配器装置中，例如fda批准的试剂盒，其可以包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如，包装可以包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有给药说明书。包装或分配器也可以通过与容器相关联的通知以由管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式来容纳，该通知反映了该机构对组合物的形式或人或兽医给药形式的批准。这种通知例如可以是美国食品和药品管理局(u.s.foodanddrugadministration)批准的处方药物的标签或批准的产品说明书(productinsert)。还可以制备在相容的药物载体中配制的包含本发明制剂的组合物，将其置于合适的容器中，并贴上标签用于治疗指定的病症，如上文进一步详述的。[0358]应当理解，试剂盒还可以包含用于治疗戈谢病的另一种治疗组合物，例如用于基板减低疗法(srt)的试剂。[0359]本发明一些实施方式的经基因修饰的人gcase，编码其的多核苷酸，用于其表达的表达构建体，或本发明一些实施方式的细胞，可以用于在有需要的主体中治疗与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病。[0360]本文所用的术语“治疗(treating或treatment)”是指消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上延迟病症的临床症状的出现，基本上改善病症的临床症状，或基本上预防病症的临床症状的出现。本文所用的术语“治疗(treating)”进一步指延长患有病症的患者的存活或延缓其死亡。[0361]如本文所用，短语“主体(subject)”和“有需要的主体(subjectinneedthereof)”在本文中可互换使用，是指处于任何年龄或性别的患有该病症的哺乳动物，优选人。该术语包括有发展为该病症风险的个体。主体可以包括例如新生儿、婴儿、少年(juvenile)、青少年(adolescent)、成人和老年人。[0362]根据一个实施方式，主体已经被诊断患有与gba基因相关的疾病。[0363]根据一个实施方式，主体已经被诊断患有与降低的β-葡糖脑苷脂酶水平和/或活性相关的疾病。[0364]根据一个实施方式，主体已经被诊断患有与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病。[0365]与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的示例性疾病包括但不限于戈谢病、gba相关的帕金森病、gba相关的路易体痴呆和gba相关的多系统萎缩。[0366]根据一个具体的实施方式，与β-葡糖脑苷脂酶缺乏症相关的疾病是戈谢病。[0367]如本文可互换使用的术语“戈谢氏病(gaucher'sdisease)”、“戈谢病(gaucherdisease)”或“gd”在本文中可互换使用，是指溶酶体贮积症(lsd)，特征在于葡萄糖基神经酰胺(glccer，也称为葡糖脑苷脂)在细胞中，特别是在单核细胞谱系的细胞中积聚。葡萄糖基神经酰胺可以在脾、肝、肾、肺、脑和骨髓中聚集。该疾病通常由β-葡糖脑苷脂酶(也称为β葡萄糖苷酶、d-葡萄糖基-n-酰基鞘氨醇葡萄糖水解酶、gcd或gcase；ec3.2.1.45)酶缺乏引起，这是一种具有葡糖神经酰胺酶酶活性的溶酶体酶，是催化葡萄糖基神经酰胺/glccer水解所必需的。[0368]基于疾病的具体症状，gd分成两种主要类型：神经性和非神经性疾病。在非神经性疾病中，可能涉及大多数器官和组织，但不涉及大脑。在神经性疾病(ngd)中，还涉及大脑。[0369]i型(或非神经性类型，gd1)是该疾病最常见的形式，大约每50,000活产儿中有1例发生。它最常发生在德系犹太人后裔中。症状可能始于生命早期或成年期，包括肝脏肿大和脾脏严重肿大(统称为“肝脾肿大”)；脾脏可能会破裂并导致其他并发症。脾肿大和骨髓替代(bonemarrowreplacement)导致贫血、血小板减少和白细胞减少。骨骼虚弱和骨病可能是广泛存在的。大脑在病理上未受影响，但可能有肺损伤，偶尔也有肾功能损伤。这类患者通常容易擦伤(由于血小板水平低)，并且由于红细胞数量少而感到疲劳。根据疾病的发病和严重程度，1型gd患者可能会活到成年。有些患者病情较轻，或者可能没有任何症状。[0370]本文所用的神经病性gd(ngd)包括2型和3型gd。[0371]2型gd，也称为急性婴儿神经性gd，通常在出生的6个月内开始，其发病率约为100,000次活产儿中约1例。症状包括肝脾肿大、广泛和进行性脑损伤(extensiveandprogressivebraindamage)、眼球运动障碍、痉挛、癫痫发作、肢体僵硬，以及吮吸和吞咽能力差。受影响的儿童通常在两岁时死亡。[0372]3型gd，也称为慢性神经性gd，可在儿童期甚至成年期的任何时间开始，在约100,000个活产儿中发生1例。其特征是缓慢进展，但与急性或2型相比神经症状较轻。3型gd被分为两个变体，称为3b型和3a型。3b型早期出现巨大肝脏和脾脏，患者还可能经历直接累及肺和快速进行性骨病。主要症状包括脾和/或肝肿大、癫痫发作、协调不力、骨骼不规则、眼球运动障碍、血液疾病(包括贫血)和呼吸道疾病。患者通常活到十几岁和成年。[0373]根据一个具体实施方式，gd是1型。[0374]根据一个实施方式，本发明一些实施方式的经基因修饰的人gcase用于酶替代疗法。[0375]如本文所用，“酶替代疗法(enzymereplacementtherapy，ert)”是指β-葡糖脑苷脂酶(gcase)的外源性给药。[0376]根据具体实施方式，将经基因修饰的人gcase治疗与基板减低疗法剂组合。[0377]如本文所用，术语“基板减低疗法剂(substratereductiontherapy，srt)”是指抑制gcase(即葡萄糖基神经酰胺(或gl1))的天然底物的合成的试剂(例如小分子)。市场上有许多卫生管理机构批准的srt版本。示例包括但不限于美格鲁特(zavesca.rtm.)和依利格鲁司特(eliglustattartrate)。[0378]预期在从本发明申请开始的专利有效期内，将开发许多相关的srt，术语srt的范围旨在包括所有这些先验(apriori)的新技术。[0379]如本文所用，术语“约(about)”是指±10％。[0380]术语“包括(comprises、comprising、includes、including)”、“具有(having)”及其和同源词(conjugates)是指“包括但不限于(includingbutnotlimitedto)”。[0381]术语“由……组成(consistingof)”是指“包括并限于(includingandlimitedto)”。[0382]术语“基本上由……组成(consistingessentiallyof)”是指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅当另外的成分、步骤和/或部分不会实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征时。[0383]如本文所用，单数形式“一个(a或an)”和“所述(the)”包括复数，除非上下文另有明确指示。例如，术语“一种化合物(acompound)”或“至少一种化合物(atleastonecompound)”可以包括多种化合物，包括其混合物。[0384]在整个本发明中，本发明的各个实施例可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本发明范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围如1至6的描述应被认为具有具体公开的子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。这适用于任何宽度的范围。[0385]每当本文指出数值范围时，其意味着包括在所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“第一指示数字和第二指示数字之间的范围(ranging/rangesbetweenafirstindicatenumberandasecondindicatenumber)”和“从第一指示数字到第二指示数字的范围(ranging/rangesfromafirstindicatenumbertoasecondindicatenumber)”在本文中可互换使用，并且意味着包括第一和第二指示数字以及它们之间的所有分数和整数。temperature，tm)定义为荧光强度(fluorescenceintensity，fi)比率曲线(ratiocurve)的拐点，其中r(fi)＝fi350nm/fi330nm。[0405]使用合成底物(p-np-glc)的酶活性测定[0406]使用对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-np-glc)作为底物测定比酶活性(specificenzymeactivity)。通过将ph升高至10来停止反应，在该ph下释放的对硝基苯酚完全离子化，并且在405nm处显示20000m-1cm-1的摩尔吸收。[0407]活性测定采用wei等人[weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299–308]。简言之，将酶的等分试样与0.1％bsa/0.125％牛磺胆酸钠/0.162％tritonx-100/0.02％叠氮化钠/0.1m磷酸钾(ph5.9)中的0.2-4mmp-np-glc在25℃孵育60分钟。通过在1m甘氨酸缓冲液(ph10)中稀释20-50倍来停止反应，并使用agilentcary3500分光光度计(安捷伦科技有限公司(agilenttechnologies)，美国)在1cm比色皿中在405nm处测量对硝基苯酚的吸光度。将吸光度值转化成对硝基苯酚浓度，并使用origin软件(originlab)构建并拟合米氏图(michaelis-mentenplots)。根据方程kcat＝vmax/c，将从拟合中获得的vmax值转化为kcat值，其中c是gcase催化位点的摩尔浓度。[0408]使用c6nbdglccer的酶活性测定[0409]使用荧光标记的gcase天然底物(nbd葡萄糖基神经酰胺(d18:1/6:0)(c6nbdglccer))测试变体的酶活性。[0410]将蛋白质制剂与20μmc6-nbd-glccer、20μm脱脂bsa在50mmmes缓冲液(ph5.5)中在37℃下孵育5分钟。通过加入750μl氯仿/甲醇(1:2,v/v)，随后加入500μl氯仿和730μl重蒸馏水来停止反应。将样品剧烈涡旋，并在2,000g下离心10分钟。吸出上层相，并在n2流下干燥含有提取的脂质的下层相。将脂质重新悬浮在氯仿/甲醇(9:1,v/v)中，并使用氯仿/甲醇/9.8mmcacl2.2h2o(65/30/8,v/v/v)作为展开溶剂通过tlc进行分离。使用typhoon9410可变模式成像仪观察nbd标记的脂质，并通过imagequanttl(gehealthcare公司，英国圣吉尔斯(chalfontstgiles,uk))进行定量。活性值计算为在1分钟内通过1mg酶使底物转化成产物的μmol(μmol.mg-1.min-1)。[0411]实施例1[0412]pross-生成变体[0413]通过使用pross算法设计了六个gcase变体(设计2-7，即d2-7，分别在seqidnos:4、6、8、10、12和14中列出，参见图1a)，pross算法已经成功用于提高几种其他蛋白质的表达水平和稳定性[参见pct/il2016/050812和goldenzweiga.等人，分子细胞(mol.cell.)(2016)63:337-346，通过引用并入本文]。这些变体中的4个，d2、d4、d6和d7在大肠杆菌中表达，并使用合成底物p-np-glc测试酶活性(数据未示出)。图1b(seqidno:2)示出了wtgcase的序列，下面的行示出了在d7变体(seqidno:14)中发生的突变，其具有最高的突变数量，即30个突变。它也是显示出最高酶活性的构建体。为了进一步的工作，d7变体在hek293t细胞中表达，其能够进行蛋白质糖基化。[0414]实施例2[0415]变体d7gcase的表达和纯化[0416]wthgcase和d7变体均在hek293t细胞中表达，并从细胞沉淀(细胞内)或从培养基(分泌的)中分离。wt和d7gcase均在细胞内表达，但d7变体显示比wt更高的表达。图2b和2c显示了使用考马斯蓝染色从单个制备物获得的三个洗脱液级分的sds-page，通过蛋白质印迹和ms将gcase鉴定为主要条带(用箭头标记)。只有d7gcase被分泌。通过使用flag珠粒的一步纯化获得了分泌的d7gcase的高度纯化的制剂(图2c)。[0417]随后，将样品上样到superdex200柱上。sec揭示了分泌的d7gcase的显著寡聚化(图3a-b)。细胞内wt和d7gcase也观察到类似的模式。单体的位置通过用分子量标记校准柱来确定，作为在大约15ml处具有吸光度最大值的峰(峰1，图3a-b)。单体峰也显示为具有最高比活性的级分。将对应于单体的级分合并、浓缩，并用于稳定性和活性测定。在下文中，给出的数据是通过两步纯化从分泌的级分中获得的d7单体。由于分泌的wtgcase的产量极低，将d7gcase获得的数据与在cho细胞(从r&d系统公司获得)中表达的重组wtgcase的类似数据和(由sanofigenzyme公司生产，其具有带有单个arg495his取代的wt序列)进行比较。[0418]实施例3[0419]变体d7gcase的热稳定性[0420]使用差示扫描荧光测定法(dsf)测定d7gcase的熔融温度(tm)。dsf测量了蛋白质去折叠(proteinunfolding)时酪氨酸和色氨酸残基的荧光变化，这导致它们暴露于水性环境中。[0421]下表1示出了所分析制剂的平均tm值。在ph7.4的tris缓冲液和ph6.1的柠檬酸缓冲液中，测定的d7gcase的tm值分别为71.8±2.4℃和61.4±1.9℃。d7gcase显示出比wtgcase更高的热稳定性。当在ph7.4和ph6.1时，与相比，稳定性分别增加了大约20℃和大约11℃。使用dsf获得的和wtgcase的值与先前报道的通过差示扫描量热法获得的的tm值非常一致，即在ph7.1时为51.30±0.02℃，在ph5.4时为57.67±0.04℃[weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299–308，同上]。[0422]表1：通过差示扫描荧光测定法测量的tm(℃)[0423][0424]显示了wtgcase、d7gcase和在两种不同ph值下的值。[0425]实施例4[0426]变体d7gcase的比活性[0427]将米氏方程(michaelis-mentenequation)拟合到允许获得km和kcat值的实验数据(下表2，代表性的酶促动力学数据如图4所示)。基于双分子速率常数kcat/km，比较了各种制剂的总催化效率。所得数据表明，d7和wt的催化活性没有显著差异，它们的kcat/km值分别为0.28×106和0.27×106m-1min-1。因此，该数据证实了所采用的方案，并与人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷进行了比较分析。[0428]表2：动力学参数[0429]km(mm)kcat(min-1)kcat/km(m-1min-1)gcasewt1.22±0.38(n＝2)347±49(n＝2)0.28×106gcased70.89±0.26(n＝3)244±102(n＝3)0.27×106[0430]值得注意的是，通过将米氏曲线拟合到测量的数据点，获得了gcase制剂对对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的活性的动力学参数。[0431]实施例5[0432]其他pross-生成的变体[0433]使用pross算法设计了葡糖神经酰胺酶(gcase)的另外三个变体(d13、d14和d15)，pross算法已经成功用于提高几种其他蛋白质的表达水平和稳定性[参见pct/il2016/050812和goldenzweiga.等人，(2016)同上(supra)，通过引用并入本文]。gcase变体d13、d14和d15在hek293t细胞中表达，并从培养基中分离。通过使用flag标签(flagtag)(dykddddk标签(dykddddktag)，seqidno：16)或标签(seqidno:29)通过一步纯化获得gcase设计的高度纯化的制剂。使用gcase的荧光标记类似物(nbd葡萄糖基神经酰胺(d18:1/6:0)(c6nbdglccer))测试所有变体的酶活性(数据未示出)。具有最高酶活性的设计，即变体d15gcase(如图5a-b所示)用于进一步表征。如下所述，将新的d15gcase的热稳定性和酶活性与先前表征的d7gcase和sanofigenzyme公司生产的进行比较，具有具有带有单个arg495his取代的wt序列。所有酶均保存在4℃下溶解在含有187mmd-甘露糖醇和0.1％(v/v)吐温80,ph6.1的柠檬酸钠/柠檬酸盐缓冲液中。[0434]实施例6[0435]变体d15gcase的热稳定性[0436]使用差示扫描荧光测定法(dsf)测定d15gcase的熔融温度(tm)。dsf测量了蛋白质去折叠(proteinunfolding)时酪氨酸和色氨酸残基的荧光变化，这导致它们暴露于水性环境中。用溶解在柠檬酸盐缓冲液(ph6.1)中的酶进行实验(如上所述)。先前已经示出d7gcase具有比高约10℃的更高的温度。观察到变体d15gcase的熔融温度进一步升高。d15gcase测得的平均tm值比高17℃，反映了蛋白质热稳定性的显著提高(下表3)。测得的的tm值与先前报道的通过差示扫描量热法获得的tm值非常一致，即在ph7.1时为51.30±0.02℃[weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299-308，同上]。[0437]表3：通过差示扫描荧光测定法测量的tm(℃)[0438][0439]实施例7[0440]变体d15gcase的比活性[0441]通过两种方法测定比活性：(i)使用gcasec6nbdglccer的荧光标记的天然底物(在ph5.5下)和(ii)使用人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(β-np-glc)(在ph5.9下)。在第一种方法中，底物和产物通过薄层色谱进行分离，并通过nbd荧光进行定量。在后者中，通过在405nm处吸收产生的对硝基苯基，对底物进行光谱定量。由两种底物测定的比酶活性与市售和d15gcase相当。活性值计算为在1分钟内通过1mg酶使底物转化成产物的μmol(μmol.mg-1.min-1；下表4a)。c6nbdglccer测定的底物浓度为20μm，p-np-glc测定的底物浓度为0.4、1.5和3mm(图6)。[0442]表4a：比活性(μmol.mg-1.min-1)[0443][0444]*值得注意的是，使用flag标签纯化gcased15[0445]进行进一步的实验以比较wtgcase、市售gcase和d15gcase的酶促动力学。通过将米氏曲线拟合到测量的数据点，获得了gcase制剂对对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(β-np-glc)的活性的动力学参数。允许获得km和kcat值的实验数据(下表4b)。基于双分子速率常数kcat/km，比较了各种制剂的总催化效率。所得数据表明，d15的催化活性与相当，它们的kcat/km值分别为1.49×106m-1min-1和1.53×106m-1min-1，而d7的催化活性与wtgcase相当，它们的kcat/km值分别为0.27×106和0.28×106m-1min-1。[0446]表4b：动力学参数[0447][0448]实施例8[0449]另外的gcase变体-d16[0450]使用pross算法设计了葡糖神经酰胺酶(gcase)的另外的变体(d16)，pross算法已经成功用于提高几种其他蛋白质(包括gcase(设计d7和d15))的表达水平和稳定性[goldenzweiga.等人，(2016)同上(supra)，通过引用并入本文]。d16gcase在hek293t细胞中表达，并从培养基中分离。通过使用标签(seqidno:29)通过一步纯化获得gcase设计的高度纯化的制剂。[0451]如下所述，将新的d16gcase的热稳定性和酶活性与先前表征的d15gcase(使用标签(seqidno:29))sanofigenzyme公司生产的进行比较，具有带有单个arg495his取代的wt序列。所有酶均保存在4℃下溶解在含有187mmd-甘露糖醇和0.1％(v/v)吐温80,ph6.1的柠檬酸钠/柠檬酸盐缓冲液中。[0452]实施例9[0453]变体d16gcase的热稳定性[0454]使用差示扫描荧光测定法(dsf)测定gcase的熔融温度(tm)。dsf测量了蛋白质去折叠(proteinunfolding)时酪氨酸和色氨酸残基的荧光变化，这导致它们暴露于水性环境中。先前已经示出gcased15具有比高约17℃的更高的温度，反映了蛋白质热稳定性的显著提高(上表3和下表5)。与gcased15相比，新的gcased16的tm略微升高，即升高2.5℃。此处测得的的tm值与先前报道的通过差示扫描量热法获得的tm值非常一致，即在ph7.1时为51.30±0.02℃[weir.r.等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011)286:299-308，同上]。[0455]表5：通过差示扫描荧光测定法测量的tm(℃)[0456][0457]实施例10[0458]变体d16gcase的比活性[0459]使用人工底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(β-np-glc)(在ph5.9中)测定比活性。在该测定中，通过在405nm处吸收产生的对硝基苯基，对底物进行光谱定量。底物浓度为3mm。新的gcased16变体的比酶活性高于商业cerezyme所测定的比酶活性，并且与gcased15相当。活性值计算为在1分钟内通过1mg酶使底物转化成产物的μmol(μmol.mg-1.min-1；下表6)。[0460]表6：比活性(μmol.mg-1.min-1)[0461][0462]*值得注意的是，使用纯化gcased15和gcased16[0463]尽管已经结合本发明的特定实施方式描述了本发明，但是显然，许多替换、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，本发明旨在包括落入所附权利要求的精神和宽泛范围内的所有这些替换、修改和变化。[0464]本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地通过引用并入本文。此外，在本发明中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认该参考文献可作为本发明的现有技术。就所使用的章节标题而言，它们不应被解释为必要的限制。[0465]此外，本发明的任何优先权文件通过引用整体并入本文。当前第1页12当前第1页12
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