一种识别铝离子和镓离子的双功能荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种双功能荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.众所周知，铝是地球上第三丰富的金属元素，其化合物广泛应用于临床药物、包装材料、食品添加剂和水处理等各个领域。作为一种人体非必需元素，铝的广泛使用使人们摄入了过多的铝。根据联合国世界卫生组织的建议，人体内铝离子的摄入量应限制在7mg/kg。人体内积累的高水平铝离子会人体健康造成重大危害，包括阿尔茨海默病、骨软化症以及诱发各种癌症。同样，镓离子也与人类生活密切相关。例如，硝酸镓常被用作抗癌药物；砷化镓常用于工业集成电路中。无论是工业用途还是医疗用途，镓离子最容易通过食物链在人体内蓄积，会引起头晕、乏力等毒副作用。鉴于我们生活中铝离子和镓离子的广泛存在及其对人体健康的危害，因此对于环境体系与生命体系中的铝离子和镓离子含量的测定具有重要意义。
3.尽管已经使用了各种方法来检测金属离子，例如原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电化学分析法，电感耦合等离子体质谱分析法等，但与这些方法相比，基于荧光分子传感器检测的方法是一种优良的方法，具有高选择性、快速分析和灵敏度高等优点。更重要的是检测金属离子的过程中方便快捷，对样品无损且还能进行便捷的目视化定性识别。
4.2-(2-羟基苯基)苯并噻唑(hbt)荧光染料由于具有光学性能稳定、stokes位移大等优点，因而经常被用作荧光探针分子的荧光母体。到目前为止，已经开发出许多能够分别检测al
3
和ga
3
的荧光探针。然而，开发同时对al
3
和ga
3
具有高灵敏度的多功能探针仍然充满挑战。基于此，开发新型双功能检测al
3
和ga
3
的荧光探针，给出检测曲线判断铝离子与镓离子水平高低，以及在生命系统中对两种金属离子进行荧光成像诊断分析有着重要的研究价值。


技术实现要素：

5.本发明是要解决现有单独识别铝离子或者镓离子的探针合成步骤繁琐，选择性以及敏感性较低的问题，提供一种识别铝离子和镓离子的双功能荧光探针及其制备方法和应用。
6.本发明一种识别铝离子和镓离子的双功能荧光探针的结构式如下：
[0007][0008]
本发明识别铝离子和镓离子的双功能荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0009]
一、3-甲氧基水杨醛与2-氨基苯硫酚反应得到化合物1：
[0010]
将3-甲氧基水杨醛溶解在n，n-二甲基甲酰胺中，再依次加入焦亚硫酸钠和2-氨基苯硫酚，油浴中搅拌，油浴温度为110～120℃，反应3～4h，用tcl板检测反应，反应完全后，冷却至室温后向溶液中加入去离子水有沉淀析出，将沉淀过滤，洗涤，干燥后得到化合物1；
[0011]
其中3-甲氧基水杨醛与2-氨基苯硫酚的摩尔比为1:1；3-甲氧基水杨醛与焦亚硫酸纳的摩尔比为(0.6～1.2):1；
[0012]
二、将步骤一得到的化合物1与溴乙酸乙酯反应得到化合物2：
[0013]
向乙腈中加入化合物1、溴乙酸乙酯和k2co3，加热温度为85～90℃，反应2～3h，停止反应后，冷却至室温，将沉淀过滤，用去离子水洗涤，过硅胶柱提纯，干燥后得到化合物2；
[0014]
其中化合物1、溴乙酸乙酯和k2co3的摩尔比为1:(1～1.05)：(1.5～2)；
[0015]
三、将步骤二得到的化合物2和水合肼反应得到化合物3：
[0016]
将化合物2与水合肼加入乙醇中，加热回流，加热温度为80～85℃，反应6～7h，用tcl板检测反应，反应完全后，冷却至室温，将沉淀过滤，用乙醇洗涤，干燥后得到化合物3；其中化合物2与水合肼的摩尔比为1：1；
[0017]
四、将步骤三得到的化合物3和5-甲基水杨醛反应得到目标化合物bmp：
[0018]
将化合物3与5-甲基水杨醛加入乙醇中，加热回流，加热温度为80～85℃，反应2～3h，用tcl板检测反应，反应完全后，冷却至室温，将沉淀过滤，用乙醇洗涤，干燥后得到目标化合物bmp；其中化合物3与5-甲基水杨醛的摩尔比为1：1。
[0019]
进一步的，步骤四中在将化合物3与5-甲基水杨醛加入乙醇中后，还加入冰乙酸至反应体系的ph为5～6。冰乙酸的作用是催化剂，加快反应速率。
[0020]
本发明铝离子与镓离子的双功能荧光探针在重金属离子检测中的应用。用于水环境体系中对铝离子与镓离子的含量传感检测，所述的传感检测包含荧光检测、紫外比率检测、目视定性检测、镓离子可逆检测、试纸检测；用于细胞中对铝离子与镓离子进行荧光成像检测。
[0021]
还可通过加入na2edta实现对镓离子的重复检测。
[0022]
本发明铝离子与镓离子的双功能荧光探针的制备反应式如下：
[0023][0024]
反应式中1为化合物1，2为化合物2，3为化合物3，bmp为铝离子与镓离子的双功能荧光探针。本发明的有益效果：
[0025]
1)探针的合成只需要四步就可以完成，且原料经济，后处理过程相对简单；
[0026]
2)本发明实现了探针即可识别铝离子又可对镓离子的传感检测，并且选择性好，抗其它金属离子干扰能力强，检测限低。铝离子：荧光检测限为1.5162
×
10-6
m，紫外检测限为9.4011
×
10-8
m。镓离子：荧光检测限为4.2816
×
10-6
m，紫外检测限为3.2019
×
10-8
m。
[0027]
此外，在紫外灯下可以观察到显著的荧光颜色变化，并且可通过不同荧光颜色区分对铝离子与镓离子的识别，是一种具有生色传感功能的荧光探针。相比于其它单纯通过荧光光谱定量检测金属离子的荧光探针，本探针还可以通过紫外光谱进行紫外比率定量检测。基于其特异性且显著的颜色变化，该试剂可作为显示水溶液中铝离子或镓离子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。并且更为重要的是对于镓离子的传感检测可通过使用na2edta实现快速可逆重复检测。此外，本发明还可应用于细胞中对铝离子或镓离子进行荧光成像识别。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的铝离子与镓离子双功能检测试剂，在水样环境以及生命系统领域具有广阔的应用前景。
附图说明
[0028]
图1为是探针bmp(浓度为1
×
10-5
mol/l)在dmf/h2o下对不同金属离子的选择性；
[0029]
图2为共存离子对铝离子测定的影响；
[0030]
图3为共存离子对镓离子测定的影响；
[0031]
图4为探针bmp(浓度为1
×
10-5
mol/l)在dmf/h2o下对不同浓度al
3
的荧光光谱响应图；
[0032]
图5为探针bmp(浓度为1
×
10-5
mol/l)在dmf/h2o下对不同浓度al
3
的紫外光谱响应图；
[0033]
图6为探针bmp(浓度为1
×
10-5
mol/l)在dmf/h2o下对不同浓度ga
3
的荧光光谱响应图；
[0034]
图7为探针bmp(浓度为1
×
10-5
mol/l)在dmf/h2o下对不同浓度ga
3
的紫外光谱响应
图；
[0035]
图8为探针bmp分别加入铝离子与镓离子后在紫外灯365nm下的荧光发射图；
[0036]
图9为探针bmp对镓离子识别的可逆性变化图；
[0037]
图10为以试纸浸染的方式对铝离子与镓离子的裸眼可视化检测图；
[0038]
图11为探针bmp应用于细胞中对铝离子与镓离子的荧光识别图。
具体实施方式
[0039]
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0040]
具体实施方式一：本实施方式一种识别铝离子和镓离子的双功能荧光探针的结构式如下：
[0041][0042]
本实施方式所述检测铝离子与镓离子的双功能荧光探针记为探针bmp，探针本身由于pet机制与c＝n异构化作用导致自身无荧光，所述荧光探针bmp与铝离子与镓离子作用后，抑制了pet机制与与c＝n异构化作用，从而导致检测体系荧光的增强以及荧光颜色的变化。
[0043]
具体实施方式二：识别铝离子和镓离子的双功能荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0044]
一、3-甲氧基水杨醛与2-氨基苯硫酚反应得到化合物1：
[0045]
将3-甲氧基水杨醛溶解在n，n-二甲基甲酰胺中，再依次加入焦亚硫酸钠和2-氨基苯硫酚，油浴中搅拌，油浴温度为110～120℃，反应3～4h，用tcl板检测反应，反应完全后，冷却至室温后向溶液中加入去离子水有沉淀析出，将沉淀过滤，洗涤，干燥后得到化合物1；
[0046]
其中3-甲氧基水杨醛与2-氨基苯硫酚的摩尔比为1:1；3-甲氧基水杨醛与焦亚硫酸纳的摩尔比为(0.6～1.2):1；
[0047]
二、将步骤一得到的化合物1与溴乙酸乙酯反应得到化合物2：
[0048]
向乙腈中加入化合物1、溴乙酸乙酯和k2co3，加热温度为85～90℃，反应2～3h，停止反应后，冷却至室温，将沉淀过滤，用去离子水洗涤，过硅胶柱提纯，干燥后得到化合物2；
[0049]
其中化合物1、溴乙酸乙酯和k2co3的摩尔比为1:(1～1.05)：(1.5～2)；
[0050]
三、将步骤二得到的化合物2和水合肼反应得到化合物3：
[0051]
将化合物2与水合肼加入乙醇中，加热回流，加热温度为80～85℃，反应6～7h，用tcl板检测反应，反应完全后，冷却至室温，将沉淀过滤，用乙醇洗涤，干燥后得到化合物3；其中化合物2与水合肼的摩尔比为1：1；
[0052]
四、将步骤三得到的化合物3和5-甲基水杨醛反应得到目标化合物bmp：
[0053]
将化合物3与5-甲基水杨醛加入乙醇中，加热回流，加热温度为80～85℃，反应2～3h，用tcl板检测反应，反应完全后，冷却至室温，将沉淀过滤，用乙醇洗涤，干燥后得到目标化合物bmp；其中化合物3与5-甲基水杨醛的摩尔比为1：1。
[0054]
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤二中用去离子水洗涤5次。其它与具体实施方式二相同。
[0055]
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤二中用乙酸乙酯/石油醚作为洗脱剂经硅胶柱色谱法分离纯化。其它与具体实施方式二或三相同。
[0056]
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤三和四中均用乙醇洗涤3-5次。其它与具体实施方式二至四之一相同。
[0057]
具体实施方式六：本实施方式双功能荧光探针在重金属离子检测中的应用。
[0058]
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述双功能荧光探针具体用于水环境体系中对铝离子与镓离子的含量传感检测。其它与具体实施方式四相同。
[0059]
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七不同的是：所述的传感检测包含荧光检测、紫外比率检测、目视定性检测、镓离子可逆检测或试纸检测。其它与具体实施方式六或七相同。
[0060]
本实施方式可通过用试纸浸染的方式实现对铝离子与镓离子的裸眼可视化检测。
[0061]
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六至八之一不同的是：还加入na2edta实现对镓离子的重复检测。其它与具体实施方式六至八之一相同。
[0062]
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六至九之一不同的是：所述双功能荧光探针用于细胞中对铝离子与镓离子进行荧光成像检测。其它与具体实施方式六至九之一相同。
[0063]
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0064]
实施例1：
[0065]
本实施例识别铝离子和镓离子的双功能荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0066]
(1)化合物1的合成：
[0067][0068]
将3-甲氧基水杨醛(0.85g，5.60mmol)溶解在15mldmf中，再依次加入焦亚硫酸钠(1.28g，6.72mmol)和2-氨基苯硫酚(0.60ml，5.60mmol)，110℃油浴中搅拌。tlc监测反应进程，待反应完全后，将混合液冷却至室温，向混合液中倒入20ml温度为0℃的去离子水，有大量黄色固体析出，过滤沉淀，所得滤饼用无水乙醇洗涤5次，干燥后得到化合物1，浅黄色固体，产率80.5％。
[0069]
(2)化合物2的合成：
[0070][0071]
向装有25ml乙腈的圆底烧瓶中加入化合物1(0.46g，1.80mmol)，再依次加入碳酸钾(1.28g，3.60mmol)和溴乙酸乙酯(0.20ml，1.83mmol)，加热回流至反应结束(tlc监测)，加热温度为90℃。待反应液冷却后过滤，用去离子水洗涤，得到粗产物，用乙酸乙酯/石油醚作为洗脱剂经硅胶柱色谱法分离纯化，干燥后得到化合物2，白色固体，产率76.0％。
[0072]
(3)化合物3的合成：
[0073][0074]
将化合物2(0.41g，1.20mmol)溶于20ml无水乙醇中，室温下加入1.20mmol水合肼，加热回流至原料点消失(tlc跟踪反应)，加热温度为80℃。停止反应，静置30min，析出大量沉淀，过滤并用无水乙醇洗涤沉淀三次，干燥后得到化合物3，白色固体，产率91.1％。
[0075]
(4)目标化合物的合成：
[0076][0077]
将化合物3(164mg，0.50mmol)与5-甲基水杨醛(68mg,0.50mmol)加入15ml无水乙醇中，向其中滴加两滴冰乙酸，加热回流，加热温度为80℃，反应2.5h，用tcl板检测反应，反应完全后，冷却至室温，将沉淀过滤，用无水乙醇洗涤5次，干燥后得到目标化合物bmp，产率81.3％。
[0078]
实施例2：
[0079]
识别铝离子和镓离子的双功能荧光探针bmp的应用。
[0080]
将实施例1中合成的铝离子和镓离子双功能识别的荧光探针bmp溶于dmf中，配制浓度为1
×
10-5
mol/l的dmf/h2o(2/3,v/v)，利用分光光度计检测其对不同金属离子的荧光选择性，图1为荧光选择性光谱图，图1中可以看出，探针自身在370nm波长激发下，几乎无荧光发射；加入不同金属离子后，用荧光分光光度计检测其荧光强度变化，结果如图1所示，加入铝离子后，在472nm处观察到荧光最大发射波长，荧光强度显著增强；加入镓离子后荧光最大发射波长为482nm，荧光强度显著增强，而其他金属离子的加入几乎无变化。
[0081]
为进一步确定，在与其它金属离子共存情况下不影响对铝离子和镓离子的选择性，进行了竞争性荧光实验，结果图2和图3所示，荧光光谱分析表明，与其它金属离子共存情况下不影响探针对铝离子和镓离子的识别。
[0082]
图2是共存离子对铝离子测定的影响，在图2中标“al
3 ”为1.0
×
10-5
mol/l的铝离子单独存在时体系的荧光强度，其余为同等浓度铝离子与相同浓度倍数的各种金属离子共存时体系的荧光强度。黑色柱条表示探针以及探针单独加入各种金属离子时的荧光强度，灰色斜柱条表示为同等浓度铝离子与相同浓度倍数的各种金属离子共存时体系的荧光强度。由图可见，加入al
3
后探针荧光增强，上述共存离子的存在并没有明显地改变该探针分子对于铝离子的检测结果。
[0083]
图3是共存离子对镓离子测定的影响，在图3中标“ga
3 ”为1.0
×
10-5
mol/l的镓离子单独存在时体系的荧光强度，其余为同等浓度镓离子与相同浓度倍数的各种金属离子共存时体系的荧光强度。黑色柱条表示探针以及探针单独加入各种金属离子时的荧光强度，灰色斜柱条表示为同等浓度铝离子与相同浓度倍数的各种金属离子共存时体系的荧光强度。由图可见，加入ga
3
后探针荧光增强，上述共存离子的存在并没有明显地改变该探针分子对于镓离子的检测结果。
[0084]
不同浓度的铝离子加入到溶液中，检测其荧光强度以及紫外吸收强度的变化，如图4、图5所示荧光光谱分析表明，在加入铝离子浓度为0到5
×
10-5
mol/l范围内，荧光强度以及紫外吸收强度变化分别与加入浓度有良好的线性关系曲线，实现了对铝离子的定量检测。
[0085]
图4为探针bmp(浓度为1
×
10-5
mol/l)在dmf/h2o(2/3,v/v)下对不同浓度al
3
的荧光光谱响应图。在图4中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度，激发波长为370nm。铝离子浓度由0到5
×
10-5
mol/l，检测限为1.5162
×
10-6
m。
[0086]
图5为探针bmp(浓度为1
×
10-5
mol/l)在dmf/h2o(2/3,v/v)下对不同浓度al
3
的紫外光谱响应图。在图5中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为紫外吸收强度。铝离子浓度由0到5
×
10-5
mol/l，检测限为9.4011
×
10-8
m。
[0087]
不同浓度的镓离子加入到溶液中，检测其荧光强度以及紫外吸收强度的变化，如图6、图7所示荧光光谱分析表明，在加入镓离子浓度为0到1.5
×
10-4
mol/l范围内，荧光强度以及紫外吸收强度变化分别与加入浓度有良好的线性关系曲线，实现了对镓离子的定量检测。
[0088]
图6为探针bmp(浓度为1
×
10-5
mol/l)在dmf/h2o(2/3,v/v)下对不同浓度ga
3
的荧光光谱响应图。在图6中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度，激发波长为370nm。镓离子浓度由0到1.5
×
10-4
mol/l，检测限为4.2816
×
10-6
m。
[0089]
图7为探针bmp(浓度为1
×
10-5
mol/l)在dmf/h2o(2/3,v/v)下对不同浓度ga
3
的紫外光谱响应图。在图7中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为紫外吸收强度。镓离子浓度由0到1.5
×
10-4
mol/l，检测限为3.2019
×
10-8
m。
[0090]
图8为探针bmp分别加入铝离子与镓离子后在紫外灯365nm下的荧光发射图。向1
×
10-5
mol/l探针溶液中加入5
×
10-5
mol/l铝离子以及5
×
10-5
mol/l镓离子后的放置在紫外灯下365nm照射下荧光颜色变化(由无荧光分别变为蓝色以及蓝绿色荧光)，实现了对铝离子及镓离子的目视定性检测。由图可见，加入铝离子后，溶液可发射出蓝色荧光；加入镓离子
后，溶液可发射出蓝绿色荧光。
[0091]
图9为向1
×
10-5
mol/l探针溶液中加入5
×
10-5
mol/l镓离子后再加入5
×
10-5
mol/l na2edta后的可逆性变化，可以对镓离子实现3次以上循环检测。探针bmp对镓离子识别的可逆性变化，在bmp溶液中加入镓离子后，荧光显著增加，再加入等量na2edta后荧光恢复淬灭状态，并且探针bmp对镓离子的可逆性识别至少可重复循环3次。
[0092]
图10为以试纸浸染的方式实现对铝离子与镓离子的裸眼可视化检测，上排从左至右分别为bmp、5μmal
3
、10μmal
3
、15μmal
3
、20μmal
3
；下排从左至右分别为10μmga
3
、20μmga
3
、40μmga
3
、80μmga
3
。将试纸放入含有探针bmp(10μm)及不同浓度的al
3
(0-20μm)或者ga
3
(0-80μm)溶液中，浸染两小时后取出置于空气中干燥。将干燥试纸放于紫外灯365nm照射下，随着al
3
或者ga
3
浓度的增加，试纸显示出从无色到亮蓝色或者无色到蓝绿色的可见颜色变化。这一现象表明，探针bmp可加载于试纸上对al
3
或者ga
3
进行荧光比色检测。
[0093]
图11为探针bmp应用于细胞中对铝离子与镓离子的荧光识别，将bmp(100μm)以及铝离子或镓离子分别与a549细胞共孵育后，可通过激光共聚焦荧光显微镜观察到细胞内荧光发射。选用a549细胞为研究对象。细胞先用al
3
或者ga
3
(50μm)培养2h后，用无血清培养基洗3遍后加入4％多聚甲醛对细胞进行固定。1h后，用pbs洗去多聚甲醛，并进一步与探针bmp(10μm)共孵育2h后用pbs淋洗三遍，最后置于激光共聚焦下进行成像。荧光成像结果显示，仅当探针bmp与al
3
或者ga
3
进行共孵育的实验组能观察到荧光信号，表明探针bmp可对细胞内al
3
或者ga
3
进行荧光成像识别。