与谷胱甘肽特异性结合的脱氧核糖核酸适配体及其用途的制作方法

1.本发明涉及与谷胱甘肽特异性结合的脱氧核糖核酸(dna)适配体及其用途，更详细地，涉及与谷胱甘肽特异性结合的脱氧核糖核酸适配体以及利用该适配体的谷胱甘肽的抗氧化及稳定方法，还有该适配体在药品、化妆品及食品等多种领域中的应用。


背景技术：

2.谷胱甘肽(glutathione，gsh)为由谷氨酸，半胱氨酸、甘氨酸等三种氨基酸构成的三肽，已知为具有预防因自由基、过氧化物、脂质过氧化物以及重金属之类的活性氧簇引起对细胞重要成分的损伤的抗氧化剂(anti-oxidant)、抗炎(anti-inflammatory)、抗癌剂(anti-carcinogen)、抗老化(anti-aging)及免疫功能增强的营养素。
3.但是，在通常的剂型中，随着时间的流逝，谷胱甘肽(gsh)的巯基(thiol)易于被氧化而形成谷胱甘肽二硫化物(glutathione disulfide，gssg)，从而降低稳定性。由于谷胱甘肽通过细胞膜的能力很低，因此谷胱甘肽向细胞内的吸收很低，由于在中性或碱性环境下的不稳定性而使其生物体利用率很低，因此具有利用率很低的问题。因此，长久以来一直存在抑制谷胱甘肽的氧化的新型方法以及物质的需求。
4.现有专利文献
5.韩国公开专利第10-2018-0054508号


技术实现要素：

6.技术问题
7.本发明因上述需求而提出，本发明的目的在于，提供防止谷胱甘肽氧化并使其稳定的方法。
8.本发明的再一目的在于，提供起到防止谷胱甘肽氧化的作用的物质。
9.本发明的还有一目的在于，提供起到使谷胱甘肽稳定的物质。
10.本发明的另一目的在于，提供将起到防止谷胱甘肽氧化并使其稳定的物质用作化妆品、保健功能食品的用途。
11.本发明的又一目的在于，提供通过保持谷胱甘肽的还原状态并使其稳定来长期保持其功能的物质。
12.本发明的又一目的在于，利用通过保持谷胱甘肽的还原状态并使其稳定来长期保持其抗氧化功能的方法制备化妆品、保健功能食品以及食品。
13.技术方案
14.为了实现上述目的，本发明提供一种选自由序列1至序列26表示的碱基序列组成的组中的脱氧核糖核酸适配体，通过与谷胱甘肽结合来抑制上述谷胱甘肽的氧化或稳定上述谷胱甘肽。
15.并且，本发明提供向谷胱甘肽处理上述本发明的适配体来稳定上述谷胱甘肽的方法。
16.并且，本发明提供包含上述本发明的适配体作为有效成分的化妆品组合物。
17.并且，本发明提供包含上述本发明的适配体作为有效成分的食品组合物。
18.在本发明的一实例中，优选地，上述食品为选自由饮料、饼干类、糖果类、乳制品、口香糖类、酱类、面包类以及冰淇淋组成的组中的食品，但不限定于此。
19.并且，本发明提供包含上述本发明的适配体作为有效成分的药物组合物。
20.在本发明中，aptamin定义为保护抗氧化物质的适配体。例如，aptamin g为与谷胱甘肽特异性结合的脱氧核糖核酸适配体，是指防止谷胱甘肽氧化并使其稳定的适配体。
21.1.基于aptamin g的化妆品应用例
22.本发明提供作为与谷胱甘肽特异性结合的脱氧核糖核酸适配体的aptamin g。
23.本发明提供作为防止谷胱甘肽氧化并使其稳定的适配体的aptamin g。
24.并且，本发明提供包含aptamin g的化妆品。
25.在本发明的一实例中，优选地，包含上述aptamin g的化妆品的特征在于，具有防止皮肤老化、去除皱纹、美白、保湿效果，但不限定于此。
26.并且，本发明提供通过上述本发明的方法制备的包含aptamin g的化妆品。
27.在本发明的一实例中，优选地，上述aptamin g的特征在于，在其末端附着有特定成分，上述特定成分具有防止皮肤老化、去除皱纹、美白、保湿效果，但不限定于此。
28.并且，本发明的特定成分可以使用化妆品中使用的所有原料，无论为任何种类的提取物或活性物质。其例有对美白有好处的绿茶提取物、甘草提取物、构树提取物、桑白皮提取物、黄金提取物、葛提取物、红参提取物、对预防老化有好处的杏提取物、油提取物、橙子提取物、柠檬提取物、竹提取物、番石榴提取物、迷迭香提取物、山茱萸提取物、灵芝提取物、银杏提取物、玉容西施散提取物、滋阴丹提取物、对保湿有好处的木瓜提取物、仙人掌果提取物、红灯笼辣椒提取物、芦荟提取物、丝瓜瓤提取物、海草提取物、具有抗氧化效果的胡萝卜提取物、大豆提取物、西柚籽提取物、葡萄籽提取物、马齿苋提取物、对皱纹改善有帮助的鱼子酱、石榴、人参提取物、对皮肤再生有帮助的桃提取物、川穹提取物、对过敏有好处的积雪草提取物、甘菊提取物、紫草根提取物、苦参提取物、当归提取物、对痤疮有好处的薄荷提取物、三白草提取物、鱼腥草提取物、芍药提取物、对抗炎及抗菌有好处的木醋液、蒲公英提取物、金盏花提取物、黄柏皮提取物、枳提取物、黄金提取物，茴香提取物、聚合草提取物、对收缩毛孔有帮助的栗皮提取物、绿茶提取物、具有保湿功能的甘油、泛醇、透明质酸、神经酰胺、β-葡聚糖、具有美白效果的熊果苷、维生素c、whitense、视黄醇、虾青素、花青素、多酚、对弹性有好处的弹性蛋白、胶原蛋白、辅酶q10、效应素、egf、作为抗炎抗菌剂的抗炎蜂胶、尿囊素、phytostan、膨胀酸、抗氧化剂维生素e(天然生育酚)、roe(迷迭香油提取物)、葡萄柚籽提取物等多种提取物。
29.并且，本发明提供包含本发明的aptamin g的化妆品组合物。
30.并且，本发明提供的包含本发明的aptamin g的化妆品原料/材料的用途略述如下。
31.众所周知，谷胱甘肽为用作功能性化妆品的主要材料的非常不稳定的物质，在暴露于空气的情况下，易于与氧结合并分解，从而迅速丧失其功能。通过aptamin g捕捉这些物质来抑制它们与氧的结合，从而起到使这些物质最大限度稳定地保持下去的作用。
32.为根据皮肤分泌的特定物质的量调节皮肤活性物质的释放(release)成分的功
能。称为适配体感应(aptasensing)的技术为通过感知皮肤的多种状态来与该状态相应地释放所需物质的方法，为能够用在美容剂治疗等方面的方法。适配体可以在根据皮肤的温度感知以不同浓度分泌的腺嘌呤核苷三磷酸(atp)，或者感知根据皮肤状态分泌的细胞因子(cytokines)等后，实现分泌与之相应的活性成分的系统。可以据此分泌适当量的抗老化物质，设计为调节持续时间或者减少对皮肤不必要的过度负荷的方式。
33.适配体为利用单链脱氧核糖核酸或核糖核酸(rna)的三维结构来检测特定物质的方法，虽与抗原-抗体反应类似，但其尺寸小得多，可以通过多种方法调节其活性，与抗体相比，具有易于生产和保管的优点。并且，与抗体不同，还可以合成与尺寸非常小的化学物质(谷胱甘肽)等结合的适配体，通过化学合成制备，易于在一定程度上保持其功效。
34.谷胱甘肽为由谷氨酸，半胱氨酸、甘氨酸等三种氨基酸构成的三肽，存在还原型和巯基被氧化的谷胱甘肽二硫化物的氧化型。
35.可以通过构成本发明的适配体的碱基和谷胱甘肽的巯基来保持谷胱甘肽的还原状态(图1)。
36.可以在包含胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸等的霜剂类型或水凝胶类型等多种剂型的皮肤美容用组合物和保健功能食品中使用通过与本发明的aptamin g结合来保持还原状态的谷胱甘肽。
37.并且，本发明包括如下方法，即，通过根据皮肤的状态或外部刺激(例如紫外线、皮肤的温度或酸度)发生不同反应的适配体(适配体感应)根据皮肤的多种状态缓缓释放谷胱甘肽的方法。例如，包括适配体的结构根据皮肤的紫外线照射发生改变而释放结合的谷胱甘肽的方法，或者在腺嘌呤核苷三磷酸的量随皮肤温度或酸度的变化而变化的情况下与之结合的aptamin g的结构发生变化来释放谷胱甘肽的方法等。
38.并且，本发明包括使用包含上述本发明的aptamin g与谷胱甘肽作为有效成分的多种剂型(血清(serum)、凝胶(gel)、洗剂(lotion)、霜剂(cream)、爽肤水(toner)、面膜(mask pack)等)的化妆品
39.在本发明的一实例中，优选地，上述化妆品组合物还包含胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸以及肽中的一种以上，但不限定于此。
40.2.利用aptamin g或aptamin g与谷胱甘肽成分复合物的保健功能食品
41.本发明提供包含上述本发明的aptamin g与谷胱甘肽复合物或者单独包含aptamin g作为有效成分的保健功能食品组合物。
42.适合本发明的保健功能食品的谷胱甘肽的例为谷胱甘肽、维生素a、维生素c、维生素d、维生素e、维生素k、维生素b6、维生素b12、维生素b1、维生素b2、维生素h、叶酸、盐酸、泛酸、它们的混合物等。保健功能食品组合物所包含的适当的矿物质营养素的例为选自钠、钾、钙、镁、磷、硫、氯、铁、铜、碘、锌、硒、锰、铬、钼、氟、钴、它们的化合物中的一种以上。
43.多种草本植物也可以用作保健功能食品。通常，从具有多种医药或饮食辅助剂特性的草本植物中进行选择。通常，草本植物为能够用作药用或是风味用的芳香族植物或植物的一部分。
44.并且，本发明提供通过将谷胱甘肽与aptamin g结合来保持包含谷胱甘肽的抗氧化物质的还原状态以延迟氧化速度的方法。
45.以下，说明本发明。
46.与谷胱甘肽一样，本发明也可以通过将维生素c(vitamin c)、维生素a(vitamin a)(视黄醇(retinol))、维生素e(vitamin e)、虾青素、白藜芦醇、多酚、辅酶q10、肽、油(oil)等对氧化十分不稳定的抗氧化物质与适配体结合来制备保健功能食品并使用。通过此来防止物质的氧化(腐败)，从而最大限地保持该物质所需的效果。并且，通过适配体感应在目标条件下释放该物质，从而可以最大限度地增加该物质的效果。
47.并且，本发明可以提供与抗氧化成分相应开发的适配体与抗氧化成分的复合物，或者单独提供活性状态的适配体和抗氧化成分。
48.在本发明的一实例中，优选地上述包含谷胱甘肽的抗氧化物质为选自由维生素c、维生素a、视黄醇、维生素e、虾青素、白藜芦醇、4
’‑
乙酰白藜芦醇(acetoxy resveratrol)、儿茶素、各种多酚、各种多酚类、表没食子儿茶素没食子酸酯、辅酶q10、泛醇、泛醌、欧米伽3以及油组成的组中的物质，但不限定于此。
49.3.利用aptamin g和/或aptamin g与谷胱甘肽成分复合物的饮料及食品组合物
50.本发明提供包含上述本发明的aptamin g与谷胱甘肽复合物作为有效成分或者在饮料中单独包含aptamin g的饮料组合物。
51.在本发明的一实例中，优选地，上述组合物还包含胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸以及肽中的一种以上，但不限定于此。
52.并且，本发明提供包含上述本发明的适配体和/或抗氧化物质作为有效成分的食品组合物。
53.在本发明的一实例中，优选地，上述食品组合物还包含胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸以及肽中的一种以上，但不限定于此。
54.在本发明的一实例中，优选地，上述食品组合物为饼干类、糖果类、乳制品、口香糖类、酱类、面包类或冰淇淋，但不限定于此。
55.并且，本发明提供通过向食品中添加上述本发明的aptamin g来制备食品的方法。
56.在本发明的其他实例中，优选地，当上述食品、饮料组合物被吸收入体内而改变aptamin g的结构时释放结合的谷胱甘肽，或者根据腺嘌呤核苷三磷酸的量随体内环境变化而变化使与之结合的aptamin g的结构发生变化而释放谷胱甘肽，但不限定于此。
57.并且，与现有的方法相比，利用适配体防止谷胱甘肽的氧化并使其稳定的方法为安全且几乎接近革新的新型方法，可以应用于各种产业中制备来使其效果最大化。
58.尤其，将成为将现有基于化学的化妆品、食品、动物、制药市场划时代地变化为基于脱氧核糖核酸的市场的催化剂。并且，已在各种产业等的多种领域中应用。将来，预计会提供脱氧核糖核酸市场的爆发式增长和革新性的解决方案。
59.4.利用aptamin g或aptamin g与谷胱甘肽复合物的药物组合物
60.在本发明的组合物为药物组合物的情况下，可以用在背景技术中提及的显出谷胱甘肽的药理效果的适应症中。为了本发明组合物的给药，除上述记载的有效成分以外，还可以包含药学上可接收的载体、赋形剂或稀释剂。上述载体、赋形剂及稀释剂可以为乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油等。
61.本发明的药物组合物可以分别根据通常的方法配制为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊
g4(序列18)、aptamin g12(序列19)的酪氨酸酶活性的柱状图；
72.图5为与谷胱甘肽特异性结合的aptamin g1(序列24)、aptamin g4(序列25)、aptamin g12(序列26)的抗氧化功效试验(dtnb assay)曲线图；
具体实施方式
73.以下，通过非限制性的实施例详细说明本发明。但下述实施例仅出于例示本发明的目的，而不应解释为通过下述实施例限定本发明的范围。
74.在本发明中，为了不使目标(谷胱甘肽)迅速氧化，将所有缓冲液和溶液在chelex 100 resin(biorad公司)中搅拌1小时后，通过0.2μm的过滤的screen展示器过滤后，使用氮气(n
2 gas)(praxair公司)撒布10分钟并使用去除偶发性金属的分子生物学级别的水(phenix research公司)来制备。
75.实施例1：脱氧核糖核酸适配体(dna aptamer)的筛选及序列分析
76.谷胱甘肽指数富集的配体系统进化技术(glutathione selex)：
77.对谷胱甘肽以～10
15
的方式使用由独特的寡核苷酸构成的脱氧核糖核酸文库(dna library)进行9轮次的指数富集的配体系统进化技术。所使用的缓冲液的组成如下：50mm的乙酸钠(sodium acetate，ph5.5)(sigma公司)，包含1mm的mgcl2的磷酸盐缓冲溶液(phosphate-buffered saline(pbs))，0.05％的吐温20(tween 20)(sigma公司)，1％的牛血清白蛋白(bsa)(sigma公司)以及1mm的谷胱甘肽(sigma公司)。通过指数富集的配体系统进化技术的严格性减少适配体对目标的结合时间，变更缓冲液的组成并在自由分子溶出中通过减少目标的浓度来变更(图2)。
78.筛选脱氧核糖核酸适配体
79.通过分析由指数富集的配体系统进化技术生成的丰富的文库的生物信息获得候补适配体，从上位26个中筛选从氧化中保护谷胱甘肽的能力，结果如下述表1所述。
80.表1
81.[0082][0083]
实施例2：美白功效试验(体外酪氨酸酶活性(in vitro tyrosinase activity))(n＝5)
[0084]
在本实验中，各成分的最终浓度为20μm的谷胱甘肽，0.2μm的apt g，0.01％的熊果苷(arbutin)。
[0085]
实验方法如下。
[0086]
将通过上述指数富集的配体系统进化技术获得的与谷胱甘肽特异性结合的适配体溶于三次蒸馏水后在95℃的温度下加热5分钟后慢慢降温至常温来以形成三维结构的方式进行准备。
[0087]
将300μm的谷胱甘肽与3μm的上述准备好的适配体(摩尔浓度100∶1)溶于三次蒸馏水中后反应30分钟来进行准备。
[0088]
向96孔培养板(96 well plate)中依次加入200μl的0.1m的磷酸钾缓冲溶液
(potassium phosphate buffer)(ph6.5)、20μl的样品(sample)、20μl的2ku/ml的酪氨酸酶(tyrosinase)、60μl的1.0mm的酪氨酸(tyrosine)后在37℃的温度下反应10分钟。
[0089]
反应后，利用酶标仪(plate reader)在490nm的波长下测量吸光度。
[0090]
结果如图3所示。图3为确认与谷胱甘肽特异性结合的aptamin g1(序列24)、aptamin g4(序列25)、aptamin g12(序列26)的酪氨酸酶活性的柱状图。
[0091]
通过图3的结果确认，谷胱甘肽抑制约75％的酪氨酸酶的活性，当与上述aptamin g序列形成复合物(complex)时，谷胱甘肽抑制酪氨酸酶活性的功效进一步提高10％以上。
[0092]
作为参考，作为本发明中使用的g1序列的序列24(cgaacagcatggaggcgcgcccgttgtgccgtgc)为专利申请内的序列2的一部分，
[0093]
作为g4序列的序列25(cgagtgaacgacgaggcgcgtcacactgcg)为专利申请内序列5的一部分。
[0094]
实施例4：美白功效试验(细胞外基于细胞的酪氨酸酶活性(in vitro cell-based tyrosinase activity))(n＝5，仅熊果苷(arb)n＝3)
[0095]
在本实验中，各成分的最终浓度为100μm的谷胱甘肽，1μm的apt g，0.01％的熊果苷。
[0096]
实验方法如下。
[0097]
将通过上述指数富集的配体系统进化技术获得的与谷胱甘肽特异性结合的适配体溶于三次蒸馏水后在95℃的温度下加热5分钟后慢慢降温至常温来以形成三维结构的方式进行准备。将100μm的谷胱甘肽与1μm的上述准备好的适配体(摩尔浓度100∶1)溶于培养基(media)中后在常温下反应30分钟来准备。
[0098]
在6孔培养板中(6 well plate)放入mnt-1细胞(cell)后在37℃、5％的co2的恒温箱(incubator)中培养24小时。
[0099]
分别处理准备好的样品后，重新在37℃、5％的co2的恒温箱中培养72小时。
[0100]
培养结束后，使用冰镇的裂解缓冲液(ice-cold lysis buf.)(ripa缓冲液(buf.) 蛋白酶抑制剂(protease inhibitor))从培养板(plate)中摘出细胞，将摘出的细胞移到ep-tube后通过离心分离只获取上清液。
[0101]
向96孔培养板中放入溶胞产物(lysate)、l-dopa、磷酸钾缓冲溶液(ph6.5)并混合(各试验组通过蛋白质(protein)定量使用相同量的蛋白质)。
[0102]
在37℃、5％的co2的恒温箱中培养1小时后，利用酶标仪在475nm的波长下测量吸光度。
[0103]
结果如图4所示。
[0104]
图4为通过细胞试验确认与谷胱甘肽特异性结合的aptamin g1(序列17)、aptamin g4(序列18)、aptamin g12(序列19)的酪氨酸酶活性的柱状图。
[0105]
图4的结果显出谷胱甘肽不能抑制酪氨酸酶的活性的倾向，确认到当与上述aptamin g序列形成复合物时，谷胱甘肽抑制约25％的酪氨酸酶的活性，与作为阳性对照组(positive control)的0.01％的熊果苷显出差不多的抑制功效。
[0106]
实施例6：抗氧化功效试验(测定巯基(sulfhydryl group(-sh)determination)，n＝5)
[0107]
在本实验中，各成分的最终浓度为125μm的谷胱甘肽，1.25μm的aptamin g。
[0108]
实验方法如下。
[0109]
将通过上述指数富集的配体系统进化技术获得的与谷胱甘肽特异性结合的适配体溶于三次蒸馏水后在95℃的温度下加热5分钟后慢慢降温至常温来以形成三维结构的方式进行准备。
[0110]
将250μm的谷胱甘肽与2.5μm的上述准备好的适配体(摩尔浓度图100∶1)溶于三次蒸馏水中并在常温下反应30分钟来准备。
[0111]
在严苛的条件(37℃)下保管上述谷胱甘肽-aptamin g复合物一段时间，以间隔4天的方式取得样品，共检测16天。
[0112]
在检测样品之前准备10mm的dtnb(4mg/ml，缓冲液(buffer)：0.1m的磷酸钾缓冲液，ph8.0)，混合样品(50μl)与相同体积(50μl)的dtnb溶液(solution)后进行振荡培养(shaking incubation)。
[0113]
反应后，利用酶标仪在412nm波长，ref波长605nm的条件下测量紫外吸光度(uv absorbance)值。
[0114]
结果如图5所示。
[0115]
图5为与谷胱甘肽特异性结合的aptamin g1(序列24)、aptamin g4(序列25)、aptamin g12(序列26)的抗氧化功效试验曲线图。
[0116]
通过图5的结果确认，虽然经16天的氧化，谷胱甘肽的量剩余约60％，但在第16天，谷胱甘肽通过aptamin g1、g4、g12(分别为序列24、序列25及序列26的适配体)约有85％以上未被氧化。