一种基于脂质体纳米囊泡的酸响应型药物递送平台的制备方法及其应用

1.本公开涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于脂质体纳米囊泡的酸响应型药物递送平台的制备方法及其应用。


背景技术：

2.目前，许多有前景的治疗方法由于给药困难而未能实现临床转化。由于纳米药物递送具有克服较差的溶解性、低稳定性和高毒性的能力，对纳米递送体系的开发是一种创新性的技术，并有可能更新一些“废弃”药物的临床转化潜力，尤其在癌症治疗领域。
3.迄今为止，广泛使用的纳米药物递送策略主要集中在将小分子药物直接化学键合到纳米材料上，或通过物理相互作用(包括疏水和静电相互作用)将药物分子捕获到纳米颗粒中。然而，大多数这些基于药物分子结构的共价修饰策略不允许以其天然形式有效释放到细胞器中，并且依赖于与纳米材料弱物理吸附的药物可能在体内递送至特定靶点之前泄漏，这两者都导致疗效的降低和生物毒性的增加。
4.基于此，本发明提供了一种工艺简单且递送效率优越的脂质体纳米治疗平台，结合了酸敏感的硅烷基醚前药作为靶向释放反应性接头的设计。该平台超越了传统的封装策略，可在弱酸性的肿瘤微环境或炎症部位中触发以实现一系列含有活性羟基的候选药物的位点特异性且可控释放。本发明构建的递送平台将为提高部分前瞻性药物的体内应用和临床转化提供有效可行的新思路。


技术实现要素：

5.本发明基于上述现有技术所存在的问题，提供了一种基于脂质体纳米囊泡的酸响应型药物递送平台的制备方法及其应用，用于至少部分解决一些溶解度差、稳定性低和毒性高的小分子药物在从实验室到临床的转化过程中可能遇到的生物利用度降低和毒性相关障碍等技术问题。
6.本发明基于脂质体纳米囊泡的酸响应型药物递送平台，是由酸敏感的硅烷基醚前药和磷脂类分子在水性溶剂中自组装形成。磷脂类分子在水介质中自组装形成脂质体结构，酸敏感的硅烷基醚前药在水介质中能够自发且精确地锚定在磷脂双分子层中。
7.所述磷脂类分子包括天然磷脂、合成磷脂以及聚乙二醇衍生物类磷脂分子或其组合。所述聚乙二醇衍生物类磷脂分子包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇或其组合。在体系中掺杂聚乙二醇衍生物类磷脂分子可在脂质体表面形成一层水化膜，掩盖脂质体表面的疏水性结合位点，阻碍血浆成分接近脂质体，从而降低网状内皮系统细胞对脂质体的识别和摄取，显著性延长脂质体的体内循环时间。
8.所述水性溶剂如注射用水、生理盐水、林格氏液(ringer's solution)，也可以根据需要包括缓冲剂，如磷酸盐缓冲溶液、tris-盐酸缓冲溶液、乙酸缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶
液和柠檬酸盐缓冲溶剂。这些缓冲剂倾向有助于稳定制剂或降低刺激性。
9.所述酸敏感的硅烷基醚前药是将可自发锚定到磷脂双分子层中且含有羟基的分子、二氯硅烷以及含有活性羟基的小分子药物进行羟基亲核进攻反应，得到酸敏感的硅烷基醚前药。其中以胆固醇作为可自发锚定到磷脂双分子层中以用来封端对应硅烷基醚前药的反应路线示意如下所示：
[0010][0011]
所述可自发锚定到磷脂双分子层中且含有羟基的分子包括但不限于：胆固醇、oh-c-chol、mhapc-chol、1-十四酰-2-羟基卵磷脂、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-pc、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-pc、1-肉豆蔻酰-2-羟基-sn-甘油-3-pe、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-pe、二油酰磷脂酰甘油中的一种或几种的组合。
[0012]
所述二氯硅烷选自二氯二甲基硅烷、二氯二乙基硅烷、二氯二丙基硅烷、二氯二正丁基硅烷、二氯二异丁基硅烷或二氯二叔丁基硅烷。
[0013]
需要说明的是，改变氯硅烷中硅原子上的烷基取代基可调节药物的释放速率。改变磷脂分子的种类和投料比例可以调整脂质体的稳定性以及表面电势。综合考虑脂质体制备过程中磷脂分子和硅烷基醚前药的投料比以优化构建的纳米载体在药物负载率、体内稳定性、递送效率等方面性能，例如，若硅烷基醚前药的投料比过高会使水化后混浊的脂质悬浮液难以挤压过纳米孔径的挤出器。最终得到的纳米囊泡的尺寸主要取决于水化后的脂质悬浮液反复挤压通过的挤出器配备的聚碳酸酯膜的孔径大小以及超声水化过程中的超声功率，超声时间等。
[0014]
所述含有活性羟基的小分子药物选自能与氯硅烷发生羟基亲核进攻反应的广泛分子，包括但不限于：
[0015]
抗肿瘤药，如紫杉醇、卡培他滨、姜黄素、双羟基奥沙利铂、吉西他滨、依托泊苷、洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、羟基喜树碱、microtubule inhibitor 1、檀香醇、1,4
‑ꢀ
二羟基蒽醌、5-氟尿嘧啶核苷、喷司他汀、阿霉素、佐柔比星、长春碱、达沙替尼；
[0016]
放疗增敏剂，如mk1775、二羟基顺铂、米索硝唑、依他硝唑、rsu-1096；
[0017]
免疫调节剂，如ly3200882、洛索立宾、r848、毛兰素、nlg919、毛蕊花糖、imd-biphenylc、 imd-catechol、pd-1-in-18、9-demethyl fr-901235、胸腺五肽、花生四烯酸乙醇胺、 3β,7β,17β-trihydroxyandrost-5-ene、laquinimod、cis-urocanic acid-13c3；
[0018]
光敏剂，如间-四羟基苯基二氢卟吩、金丝桃素、异血卟啉ix、血卟啉ix二甲酯、血卟啉单甲醚、7,12-双(1-羟乙基)-3,8,13,17-四甲基-21h,23h-卟吩-2,18-二丙酸二甲酯；
[0019]
铁死亡诱导剂或抑制剂，如柳氮磺吡啶、fin56、2,6-二叔丁基对甲酚、双羟基顺铂、柠檬酸铁(iii)铵、microtubule inhibitor 2、丁基羟基茴香醚、放线菌酮、chalconesa-n-5；
[0020]
硼中子俘获疗法药物，如对硼烷苯丙氨酸；
[0021]
抗代谢类抗癌药，如羟基脲；
[0022]
激素及调节内分泌功能类药，如雌二醇、戊酸雌二醇、氢化泼尼松、炔雌醇、倍他洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、奈必洛尔、塞吗洛尔、醋丁洛尔、氧烯洛尔、l-丁氨基-3-(2，5-二氯苯氧基)-2-丙醇、l-异丙基氨基-3-(4-(2-环丙基甲氧基乙基) 苯氧基)-2-丙醇、3-异丙基氨基-1-(7-甲基茚满-4-基氧)-2-丁醇、2-(3-叔丁基氨基-2-羟基-丙硫基)-4-(5-氨甲酰基-2-噻吩基)噻唑、阿屈非尼、沙丁胺醇、比托特罗、肾上腺素、间羟异丙肾上腺素、羟孕酮、甘草黄酮c、米索前列醇、氯司替勃、司坦唑醇、甲睾酮、羟基黄体酮、左炔诺孕酮、米非司酮、糖皮质激素、盐皮质激素、曲安西龙、倍他米松、地塞米松、儿茶酚胺、麻黄碱、沙美特罗、克仑特罗；
[0023]
抗组胺药，如特非那定；
[0024]
麻醉药，如奥索卡因、新奥索仿；
[0025]
抗结核药，如乙胺丁醇、利福霉素、利福平；
[0026]
抗心律失常药，如腺苷、贝凡洛尔、阿义马林、普萘洛尔、艾司洛尔、普罗帕酮；
[0027]
抗生素类药物，如粉蝶霉素a、氯霉素、羟氨苄青霉素、沙纳霉素、克拉维酸、金霉素、土霉素、四环素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、红霉素、罗红霉素、氟红霉素、阿奇霉素、地红霉素、泰利霉素；
[0028]
血压药，如纳多洛尔、吲哚洛尔、氯沙坦；
[0029]
强心药，如地高辛、多巴酚丁胺；
[0030]
调血脂药，如洛伐他汀、美伐他汀、依西咪贝；
[0031]
血管痉挛药，如酚妥拉明；
[0032]
抗真菌感染药，如氟康唑；
[0033]
抗病毒药，如扎那米维；
[0034]
血管紧张素ii拮抗剂，如奥美沙坦；
[0035]
抗凝血药，如双嘧达莫、苯丙香豆素；
[0036]
抗糖尿病药，如阿卡波糖、米格列醇、羟苯磺酸；
[0037]
抗hiv药物，如羟基尿素、齐多夫定、司他夫定、沙奎那韦、利托那韦；
[0038]
抗疟药，如甲氟喹、本芴醇、卤泛群、奎宁、奎尼丁、辛可宁、辛可尼丁、双氢青蒿素；
[0039]
精神类药物，如5-羟色胺、羟基安定、γ-羟基丁酸、羟考酮、奥沙西泮、卤加比、多巴胺、奋乃静、氟奋乃静、文拉法辛、吗啡、可待因、埃托啡、喷他佐辛；
[0040]
外周神经系统药物，如毛果芸香碱、加兰他敏、阿托品、山莨菪碱、樟柳碱；
[0041]
解热镇痛药，如对乙酰氨基酚；
[0042]
抗炎药，如氢化可的松、羟布宗；
[0043]
自身免疫性疾病类药物，如硫酸羟基氯奎、2-[[4-[(7-氯喹啉-4-基)氨基]戊基](乙基)氨基] 乙醇；
[0044]
胆囊炎及肝炎治疗药物，如对羟基苯乙酮、水飞蓟宾、熊去氧胆酸。
[0045]
本发明基于脂质体纳米囊泡的酸响应型药物递送平台，是由包括如下步骤的方法制备获得：
[0046]
步骤1：将酸敏感的硅烷基醚前药溶解在有机溶剂中，加入一定比例溶解的磷脂类分子，反应体系混匀后，旋转蒸发去除残留的有机溶剂，得到干燥的脂质膜；
[0047]
步骤2：将所述脂质膜在水性溶剂中超声水化，得到混浊的脂质悬浮液；
[0048]
步骤3：将所述脂质悬浮液通过配备有纳米级聚碳酸酯膜的微型挤出器反复挤压，以获得尺寸均匀的载药脂质体。
[0049]
所述有机溶剂包括对硅烷基醚前药和磷脂类分子具有良好溶解性的有机溶剂，如二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、dmf、dmso、乙腈、乙醇、乙醚等中的一种或几种的混合液。鉴于三氯甲烷溶剂旋转蒸发后在烧瓶内壁上的成膜性能较好，优选有机溶剂为三氯甲烷。
[0050]
所述水性溶剂如注射用水、生理盐水、林格氏液(ringer's solution)，也可以根据需要包括缓冲剂，如磷酸盐缓冲溶液、tris-盐酸缓冲溶液、乙酸缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液和柠檬酸盐缓冲溶剂。这些缓冲剂倾向有助于稳定制剂或降低刺激性。
[0051]
所述聚碳酸酯膜采用avanti polar lipids厂家生产的脂质体挤出器配套的聚碳酸酯膜，尺寸规格有0.03μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.4μm、0.8μm、1μm；根据实验目标脂质体尺寸的要求选取适配规格的聚碳酸酯膜。
[0052]
所述酸响应型药物递送平台中，磷脂类分子的摩尔百分比含量为0.1～99.9％，其中磷脂类分子中聚乙二醇衍生物类磷脂分子的摩尔百分比含量为0～30.0％；酸敏感的硅烷基醚前药的摩尔百分比含量为0.1～99.9％。
[0053]
上述比例取决于不同实施例中实际情况的限制，根据磷脂种类不同、硅烷基醚前药水溶性的差异导致的可承受的挤出压力不同、最终想要获得的脂质体的表面电势不同、以及对肿瘤的递送效率而动态调整投料比。
[0054]
本发明基于脂质体纳米囊泡的酸响应型药物递送平台可以应用在生物纳米医学领域、尤其在癌症治疗领域，或与其他治疗手段联合使用以产生协同作用，显著性优于单药的治疗效果。
[0055]
与现有技术相比，本发明有益效果体现在：
[0056]
本发明提供的酸响应型纳米递送平台，用于位点特异性的可控释放某些分子结构中含有活性羟基的候选药物，具有制造工艺简单、成本低廉、适合工业化生产、递送效率优越和肿瘤穿透深，从而触发显著性优于小分子药物所产生的抗肿瘤反应。鉴于纳米粒子的增强渗透性和保留(epr)效应、药物的ph依赖性持续释放以及脂质体材料的合理设计相结合，最大限度地延长药物体内循环时间、增强肿瘤富集、提高的抗肿瘤功效并减少脱靶毒性。最重要的是，这项技术可以推广到除癌症之外的许多其他疾病的可能治疗，并且至少部分解决了一些溶解度差、稳定性低和毒性高的小分子药物在从实验室到临床的转化过程中可能遇到的生物利用度降低和毒性相关障碍等技术问题。
附图说明
[0057]
图1肿瘤或炎症部位酸性微环境响应型纳米治疗平台的开发和以r848作为模型药物的该酸响应型纳米制剂(resiquimodsomes)的表征。其中：a，酸响应型胆固醇封端硅烷基醚前药(chol-prodrug)的反应方程式示意图；b，chol-r848自组装成resiquimodsomes的示意图； c，resiquimodsomes的dls尺寸分布；d，resiquimodsomes的ph依赖性释放载药r848；e， resiquimodsomes的高分辨率冷冻电镜图像。比例尺，100nm(n＝3个独立实验)。
[0058]
图2根据本发明实施例1制备ph响应型硅烷基醚前药chol-r848的核磁共振氢谱图。
[0059]
图3根据本发明实施例1制备ph响应型硅烷基醚前药chol-r848的核磁共振碳谱图。
[0060]
图4根据本发明实施例1制备ph响应型硅烷基醚前药chol-r848的高分辨质谱图。
[0061]
图5根据本发明实施例2制备ph响应型硅烷基醚前药chol-卡培他滨的核磁共振氢谱图。
[0062]
图6根据本发明实施例2制备ph响应型硅烷基醚前药chol-卡培他滨的高分辨质谱图。
[0063]
图7根据本发明实施例3制备ph响应型硅烷基醚前药chol-nlg919的核磁共振氢谱图。
[0064]
图8根据本发明实施例3制备ph响应型硅烷基醚前药chol-nlg919的高分辨质谱图。
[0065]
图9根据本发明实施例4制备ph响应型硅烷基醚前药chol-辛伐他汀的核磁共振氢谱图。
[0066]
图10根据本发明实施例4制备ph响应型硅烷基醚前药chol-辛伐他汀的高分辨质谱图。
[0067]
图11根据本发明实施例5制备ph响应型硅烷基醚前药chol-mk1775的核磁共振氢谱图。
[0068]
图12根据本发明实施例5制备ph响应型硅烷基醚前药chol-mk1775的高分辨质谱图。
[0069]
图13根据本发明实施例6制备ph响应型r848脂质纳米囊泡(resiquimodsomes)与pd-l1 免疫检查点抑制剂协同抑制小鼠乳腺癌肿瘤生长。其中，a图显示4t1肿瘤细胞的植入(第0 天)和随后的治疗计划；b图接受静脉注射的皮下4t1荷瘤balb/c小鼠(n＝9)的平均肿瘤生长曲线。注射free-r848(2mg kg-1
)、resiquimodsomes(2mg r848 kg-1
)或与腹腔注射αpd-l1 (每只小鼠100μg)；c图不同治疗组在乳腺肿瘤模型中的kaplan-meier生存曲线；d图乳腺肿瘤模型中不同治疗组个体肿瘤生长曲线。
[0070]
图14根据本发明实施例6制备ph响应型r848脂质纳米囊泡(resiquimodsomes)与pd-1 免疫检查点抑制剂协同抑制小鼠黑色素瘤生长。其中，a图显示b16f10肿瘤细胞的植入(第 0天)和随后的治疗计划；b图接受静脉注射的皮下b16f10荷瘤c57bl/6j小鼠(n＝6)的平均肿瘤生长曲线。注射free-r848(2mg kg-1
)、resiquimodsomes(2mg r848 kg-1
)或与腹腔注射αpd-1(每只小鼠100μg)；c图不同治疗组在黑色素瘤模型中的kaplan-meier生存曲线； d图黑色素瘤模型中不同治疗组个体肿瘤生长曲线。
[0071]
图15是实施例9中改变氯硅烷中硅原子上的烷基取代基对药物释放速率的影响。
[0072]
图16是单次静脉注射后的体内ivis成像。将游离cy5.5和cy5.5标记的以r848作为模型药物的该酸响应型纳米制剂(resiquimodsomes)尾静脉注射到皮下4t1荷瘤裸鼠(n＝3 生物学独立小鼠)。
[0073]
图17是单次静脉注射游离cy5.5和cy5.5标记的resiquimodsomes后24小时和48小时4t1荷瘤裸鼠的肿瘤组织的离体成像(n＝3只生物学独立的小鼠)。
[0074]
图18根据本发明实施例11制备ph响应型且多药共递送的mk1775 nlg919脂质纳米囊泡的高分辨率冷冻电镜图像。比例尺，100nm。
具体实施方式
[0075]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
[0076]
本发明基于脂质体纳米囊泡的酸响应型药物递送平台，是由酸敏感的硅烷基醚前药和磷脂类分子在水性溶剂中自组装形成。磷脂类分子在水介质中自组装形成脂质体结构，酸敏感的硅烷基醚前药在水介质中能够自发且精确地锚定在磷脂双分子层中。
[0077]
所述磷脂类分子包括天然磷脂、合成磷脂以及聚乙二醇衍生物类磷脂分子或其组合。所述聚乙二醇衍生物类磷脂分子包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇或其组合。在体系中掺杂聚乙二醇衍生物类磷脂分子可在脂质体表面形成一层水化膜，掩盖脂质体表面的疏水性结合位点，阻碍血浆成分接近脂质体，从而降低网状内皮系统细胞对脂质体的识别和摄取，显著性延长脂质体的体内循环时间。
[0078]
所述水性溶剂如注射用水、生理盐水、林格氏液(ringer's solution)，也可以根据需要包括缓冲剂，如磷酸盐缓冲溶液、tris-盐酸缓冲溶液、乙酸缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液和柠檬酸盐缓冲溶剂。这些缓冲剂倾向有助于稳定制剂或降低刺激性。
[0079]
所述酸敏感的硅烷基醚前药是将可自发锚定到磷脂双分子层中且含有羟基的分子、二氯硅烷以及含有活性羟基的小分子药物进行羟基亲核进攻反应，得到酸敏感的硅烷基醚前药。其中以胆固醇作为可自发锚定到磷脂双分子层中以用来封端对应硅烷基醚前药的反应路线示意如下所示：
[0080][0081]
所述可自发锚定到磷脂双分子层中且含有羟基的分子包括但不限于：胆固醇、 oh-c-chol、mhapc-chol、1-十四酰-2-羟基卵磷脂、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-pc、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-pc、1-肉豆蔻酰-2-羟基-sn-甘油-3-pe、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-pe、二油酰磷脂酰甘油中的一种或几种的组合。
[0082]
所述二氯硅烷选自二氯二甲基硅烷、二氯二乙基硅烷、二氯二丙基硅烷、二氯二正丁基硅烷、二氯二异丁基硅烷或二氯二叔丁基硅烷。
[0083]
需要说明的是，改变氯硅烷中硅原子上的烷基取代基可调节药物的释放速率。改变磷脂分子的种类和投料比例可以调整脂质体的稳定性以及表面电势。综合考虑脂质体制备过程中磷脂分子和硅烷基醚前药的投料比以优化构建的纳米载体在药物负载率、体内稳定性、递送效率等方面性能，例如，若硅烷基醚前药的投料比过高会使水化后混浊的脂质悬浮液难以挤压过纳米孔径的挤出器。最终得到的纳米囊泡的尺寸主要取决于水化后的脂质悬浮液反复挤压通过的挤出器配备的聚碳酸酯膜的孔径大小以及超声水化过程中的超声功率，超声时间等。
[0084]
所述含有活性羟基的小分子药物选自能与氯硅烷发生羟基亲核进攻反应的广泛
分子，包括但不限于：
[0085]
抗肿瘤药，如紫杉醇、卡培他滨、姜黄素、双羟基奥沙利铂、吉西他滨、依托泊苷、洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、羟基喜树碱、microtubule inhibitor 1、檀香醇、1,4
‑ꢀ
二羟基蒽醌、5-氟尿嘧啶核苷、喷司他汀、阿霉素、佐柔比星、长春碱、达沙替尼；
[0086]
放疗增敏剂，如mk1775、二羟基顺铂、米索硝唑、依他硝唑、rsu-1096；
[0087]
免疫调节剂，如ly3200882、洛索立宾、r848、毛兰素、nlg919、毛蕊花糖、imd-biphenylc、 imd-catechol、pd-1-in-18、9-demethyl fr-901235、胸腺五肽、花生四烯酸乙醇胺、 3β,7β,17β-trihydroxyandrost-5-ene、laquinimod、cis-urocanic acid-13c3；
[0088]
光敏剂，如间-四羟基苯基二氢卟吩、金丝桃素、异血卟啉ix、血卟啉ix二甲酯、血卟啉单甲醚、7,12-双(1-羟乙基)-3,8,13,17-四甲基-21h,23h-卟吩-2,18-二丙酸二甲酯；
[0089]
铁死亡诱导剂或抑制剂，如柳氮磺吡啶、fin56、2,6-二叔丁基对甲酚、双羟基顺铂、柠檬酸铁(iii)铵、microtubule inhibitor 2、丁基羟基茴香醚、放线菌酮、chalcones a-n-5；
[0090]
硼中子俘获疗法药物，如对硼烷苯丙氨酸；
[0091]
抗代谢类抗癌药，如羟基脲；
[0092]
激素及调节内分泌功能类药，如雌二醇、戊酸雌二醇、氢化泼尼松、炔雌醇、倍他洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、奈必洛尔、塞吗洛尔、醋丁洛尔、氧烯洛尔、l-丁氨基-3-(2，5-二氯苯氧基)-2-丙醇、l-异丙基氨基-3-(4-(2-环丙基甲氧基乙基) 苯氧基)-2-丙醇、3-异丙基氨基-1-(7-甲基茚满-4-基氧)-2-丁醇、2-(3-叔丁基氨基-2-羟基-丙硫基)-4-(5-氨甲酰基-2-噻吩基)噻唑、阿屈非尼、沙丁胺醇、比托特罗、肾上腺素、间羟异丙肾上腺素、羟孕酮、甘草黄酮c、米索前列醇、氯司替勃、司坦唑醇、甲睾酮、羟基黄体酮、左炔诺孕酮、米非司酮、糖皮质激素、盐皮质激素、曲安西龙、倍他米松、地塞米松、儿茶酚胺、麻黄碱、沙美特罗、克仑特罗；
[0093]
抗组胺药，如特非那定；
[0094]
麻醉药，如奥索卡因、新奥索仿；
[0095]
抗结核药，如乙胺丁醇、利福霉素、利福平；
[0096]
抗心律失常药，如腺苷、贝凡洛尔、阿义马林、普萘洛尔、艾司洛尔、普罗帕酮；
[0097]
抗生素类药物，如粉蝶霉素a、氯霉素、羟氨苄青霉素、沙纳霉素、克拉维酸、金霉素、土霉素、四环素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、红霉素、罗红霉素、氟红霉素、阿奇霉素、地红霉素、泰利霉素；
[0098]
血压药，如纳多洛尔、吲哚洛尔、氯沙坦；
[0099]
强心药，如地高辛、多巴酚丁胺；
[0100]
调血脂药，如洛伐他汀、美伐他汀、依西咪贝；
[0101]
血管痉挛药，如酚妥拉明；
[0102]
抗真菌感染药，如氟康唑；
[0103]
抗病毒药，如扎那米维；
[0104]
血管紧张素ii拮抗剂，如奥美沙坦；
[0105]
抗凝血药，如双嘧达莫、苯丙香豆素；
[0106]
抗糖尿病药，如阿卡波糖、米格列醇、羟苯磺酸；
[0107]
抗hiv药物，如羟基尿素、齐多夫定、司他夫定、沙奎那韦、利托那韦；
[0108]
抗疟药，如甲氟喹、本芴醇、卤泛群、奎宁、奎尼丁、辛可宁、辛可尼丁、双氢青蒿素；
[0109]
精神类药物，如5-羟色胺、羟基安定、γ-羟基丁酸、羟考酮、奥沙西泮、卤加比、多巴胺、奋乃静、氟奋乃静、文拉法辛、吗啡、可待因、埃托啡、喷他佐辛；
[0110]
外周神经系统药物，如毛果芸香碱、加兰他敏、阿托品、山莨菪碱、樟柳碱；
[0111]
解热镇痛药，如对乙酰氨基酚；
[0112]
抗炎药，如氢化可的松、羟布宗；
[0113]
自身免疫性疾病类药物，如硫酸羟基氯奎、2-[[4-[(7-氯喹啉-4-基)氨基]戊基](乙基)氨基] 乙醇；
[0114]
胆囊炎及肝炎治疗药物，如对羟基苯乙酮、水飞蓟宾、熊去氧胆酸。
[0115]
本发明基于脂质体纳米囊泡的酸响应型药物递送平台，是由包括如下步骤的方法制备获得：
[0116]
步骤1：将酸敏感的硅烷基醚前药溶解在有机溶剂中，加入一定比例溶解的磷脂类分子，反应体系混匀后，旋转蒸发去除残留的有机溶剂，得到干燥的脂质膜；
[0117]
步骤2：将所述脂质膜在水性溶剂中超声水化，得到混浊的脂质悬浮液；
[0118]
步骤3：将所述脂质悬浮液通过配备有纳米级聚碳酸酯膜的微型挤出器反复挤压，以获得尺寸均匀的载药脂质体。
[0119]
具体地，如图1a所示，二氯硅烷的两端分别与含有活性羟基的小分子药物以及可自发精确锚定到磷脂双分子层且含有羟基的分子如胆固醇或磷脂发生缩合反应，生成的二硅醚类化合物前药中的-o-si-o-对酸敏感，可响应肿瘤或者炎症部位的微酸性环境以实现药物分子的位点特异性的可控释放。采用脂质体制备中经典的薄膜水化法并将水化后的脂质悬浮液反复挤压通过纳米级别的聚碳酸酯膜以获得尺寸均匀，结构稳定的纳米囊泡。该纳米制剂的系统递送相比于全身给药小分子药物，表现出延长的体内循环时间、增强的肿瘤富集、可控的瘤内释放以及提高的抗肿瘤功效并有望最大限度地减少脱靶毒性。
[0120]
首先制备酸敏感的且能自发、精确锚定在脂质双分子层中的硅烷基醚前药的偶联物。将选取的含有活性羟基的小分子药物、咪唑、4-dmap在无水的反应溶剂中混合，于室温下搅拌5-30min；加入二氯硅烷并再持续反应0.5-4h，得到含有药物小分子的单硅醚类化合物；加入另一分子的可自发锚定到磷脂双分子层中且含有羟基的分子包括但不限于胆固醇或磷脂类分子并持续反应0.5-8h，以得到最终的二硅醚类化合物前药，如图1a所示；减压蒸馏除去溶剂，并用薄层色谱法纯化收集产物。通过控制上述含有羟基小分子与二氯硅烷的投料比，可以得到不同取代的二硅烷基醚前药结构。
[0121]
在上述实施例的基础上，请参见图1a，s1包括：为了验证该酸响应型纳米递送平台的普适性，选取含有活性羟基的小分子药物包括但不限于免疫调节剂r848和nlg919、化疗药物卡培他滨、hmg-coa还原酶的竞争抑制剂辛伐他汀以及放疗增敏剂mk-1775都成功地制备其对应的胆固醇封端的硅烷基醚前药偶联物且能自发、精确锚定在脂质双分子层中以得到载药脂质体纳米制剂。
[0122]
本发明酸响应型纳米递送平台在生物纳米医学领域、尤其在癌症治疗领域有着广泛的用途，或与其他治疗手段联合使用以产生协同作用，显著性优于单药的治疗效果。
[0123]
鉴于纳米粒子的增强渗透性和保留(epr)效应、药物的ph依赖性持续释放以及脂
质体材料的合理设计相结合，提出的该纳米递送体系相比于全身给药小分子药物，表现出最大限度地延长药物体内循环时间、增强肿瘤富集、提高的抗肿瘤功效并减少脱靶毒性。最重要的是，这项技术可以推广到除癌症之外的许多其他疾病的可能治疗，并且至少部分解决了一些溶解度差、稳定性低和毒性高的小分子药物在从实验室到临床的转化过程中可能遇到的生物利用度降低和毒性相关障碍等技术问题。
[0124]
下面通过具体实施方式对本公开作进一步说明。本实施例公开了一类硅烷基醚前药与磷脂分子自组装成脂质体纳米囊泡的酸响应型药物递送平台的设计思路及制备方法仅供示范之用。实施例中使用的试剂均为市售产品，购自国药集团化学试剂有限公司，上海毕得医药科技有限公司，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，avantipolarlipids等。
[0125]
实施例1：ph响应型硅烷基醚前药chol-r848的合成
[0126][0127]
将r848(7.9mg,0.025mmol)、咪唑(3.4mg,0.05mmol)和4-dmap(3.7mg,0.03mmol)加入到1ml无水dmf溶液中并在室温下氮气气氛下搅拌15分钟。加入二氯二甲基硅烷(3.9μl，0.04mmol)并持续反应30分钟后，将溶解在0.5mldmf中的胆固醇(9.7mg，0.025mmol)滴加到反应体系中。将所得混合液在室温下继续搅拌2小时，然后减压除去溶剂。干燥后产物通过薄层色谱法(dcm:meoh＝15:1)纯化并收集得到chol-r848前药(11mg，58.1％产率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.16(d,j＝8.4hz,1h),7.80(d,j＝8.0,1h),7.51
–
7.47(m,1h),7.32
–
7.27(m,1h),5.73(s,2h),5.23
–
5.15(m,1h),4.73(s,2h),3.54(t,j＝7.2hz,1h),3.40
–
3.15(m,1h),1.54
–
0.81(m,50h),0.65(s,3h),
–
0.14(s,6h).
13
cnmr(100mhz,cdcl3)δ151.1,151.0,140.8,135.5,127.4,126.5,126.40,126.37,121.9,121.5,121.2,115.9,75.3,72.2,66.2,65.7,56.7,56.5,56.1,50.0,42.30,42.28,39.8,39.5,37.1,36.4,36.2,35.8,31.9,31.8,31.7,28.2,28.0,24.3,23.8,22.8,22.5,21.0,19.3,18.7,15.1,11.8,0.1,
–
0.1.1hnmrwasinternallyreferencedtocdcl3(7.26ppm),
13
cnmrwasreferencedtocdcl3(77.00ppm).hrms(esi)calcd.forc
46h73
n4o3si[m h]

757.5452,found757.5461.
[0128]
实施例2：ph响应型硅烷基醚前药chol-卡培他滨的合成
[0129]
[0130]
将卡培他滨(9.0mg,0.025mmol)、咪唑(3.4mg,0.05mmol)和4-dmap(3.7mg,0.03mmol)加入到1ml无水dmf溶液中并在室温下氮气气氛下搅拌10分钟。加入二氯二乙基硅烷(6.0μl，0.04mmol)并持续反应1小时后，将溶解在0.5mldmf中的胆固醇(9.7mg，0.025mmol)滴加到反应体系中。将所得混合液在室温下继续搅拌2小时，然后减压除去溶剂。干燥后产物通过薄层色谱法(dcm:meoh＝40:1)纯化并收集chol-卡培他滨前药(7.0mg,33.8％产率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.55(d,j＝5.2hz,1h),5.72
–
5.69(m,1h),5.36
–
5.32(m,2h),4.44
–
4.27(m,1h),4.10
–
4.22(m,2h),3.56
–
3.48(m,1h),2.28
–
2.22(m,4h),2.02
–
1.92(m,4h),1.85
–
1.78(m,4h),1.72
–
1.67(m,3h),1.52
–
1.42(m,10h),1.32
–
0.85(m,34h),0.68
–
0.62(m,8h).1hnmrwasinternallyreferencedtocdcl3(7.26ppm).hrms(esi)calcd.forc
47h76
fn3o7si[m h]

830.55152,found830.5530.
[0131]
实施例3：ph响应型硅烷基醚前药chol-nlg919的合成
[0132][0133]
将nlg919(7.0mg,0.025mmol)、咪唑(3.4mg,0.05mmol)和4-dmap(3.7mg,0.03mmol)加入到1ml无水dmf溶液中并在室温下氮气气氛下搅拌10分钟。加入二氯二乙基硅烷(6.0μl，0.04mmol)并持续反应1.5小时后，将溶解在0.5mldmf中的胆固醇(9.7mg，0.025mmol)滴加到反应体系中。将所得溶液在室温下继续搅拌2小时，然后减压除去溶剂。干燥后产物通过薄层色谱法(hexane:ea＝15:1)纯化并收集得到chol-nlg919前药(chol-nlg919,4.7mg,25％产率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.92(s,1h),7.58(d,j＝7.6hz,1h),7.53(d,j＝7.6hz,1h),7.42
–
7.38(m,1h),7.33
–
7.28(m,1h),7.26
–
7.24(m,1h),5.24
–
5.38(m,3h),4.20
–
4.15(m,1h),3.67
–
3.58(m,1h),2.45
–
1.77(m,10h),1.54
–
1.44(m,9h),1.31
–
1.24(m,8h),1.12
–
0.85(m,30h),0.70
–
0.65(m,8h).1hnmrwasinternallyreferencedtocdcl3(7.26ppm).hrms(esi)calcd.forc
50h77
n2o2si[m h]

753.5754,found753.5755.
[0134]
实施例4：ph响应型硅烷基醚前药chol-辛伐他汀的合成
[0135][0136]
将辛伐他汀(10.5mg,0.025mmol)、咪唑(3.4mg,0.05mmol)和4-dmap(3.7mg,0.03mmol)加入到1ml无水dmf溶液中并在室温下氮气气氛下搅拌10分钟。加入二氯二甲基硅烷(3.9μl，0.04mmol)并持续反应30分钟后，将溶解在0.5mldmf中的胆固醇(9.7mg，
0.025mmol)滴加到反应体系中。将所得溶液在室温下继续搅拌2小时，然后减压除去溶剂。干燥后产物通过薄层色谱法(hexane:ea＝20：1)纯化并收集得到chol-辛伐他汀前药(chol-辛伐他汀，6.5mg，31％产率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.99(d,j＝9.6hz,1h),5.80
–
5.75(m,1h),5.51(s,1h),5.38
–
5.31(m,2h),4.63
–
4.55(m,1h),4.44
–
4.36(m,2h),3.61
–
3.51(m,1h),2.62(d,j＝4.0hz,1h),1.57
–
1.48(m,11h),1.40
–
1.20(m,18h),1.15
–
0.94(m,21h),0.92
–
0.75(m,20h),0.67(s,3h),0.15
–
0.10(m,6h).1hnmrwasinternallyreferencedtocdcl3(7.26ppm).hrms(esi)calcd.forc
54h89
o6si[m h]

861.6428,found861.6414.
[0137]
实施例5：ph响应型硅烷基醚前药chol-mk1775的合成
[0138][0139]
将mk1775(12.5mg,0.025mmol)、咪唑(3.4mg,0.05mmol)和4-dmap(3.7mg,0.03mmol)加入到1ml无水dmf溶液中并在室温下氮气气氛下搅拌10分钟。加入二氯二甲基硅烷(3.9μl，0.04mmol)并持续反应30分钟后，将溶解在0.5mldmf中的胆固醇(9.7mg，0.025mmol)滴加到反应体系中。将所得溶液在室温下继续搅拌2小时，然后减压除去溶剂。干燥后产物通过薄层色谱法(dcm:meoh＝15:1)纯化并收集得到chol-mk1775前药(chol-mk1775,10.8mg,46％产率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.82(s,1h),7.82(t,j＝8hz,1h),7.72(d,j＝8hz,1h),7.59(d,j＝8hz,1h),7.48(d,j＝8hz,1h),6.92(d,j＝8.8hz,1h),5.69
–
5.61(m,1h),4.98(d,j＝9.6hz,1h),4.15
–
4.09(m,1h),3.67
–
3.55(m,1h),4.44
–
4.36(m,2h),3.25(s,3h),2.70(s,3h),2.44(s,3h),2.24
–
2.20(m,5h),1.70
–
1.57(m,14h),1.28
–
1.21(m,30h),0.90
–
0.83(m,12h).1hnmrwasinternallyreferencedtocdcl3(7.26ppm).hrms(esi)calcd.forc
56h83
n8o3si[m h]

943.6357,found943.6331.
[0140]
实施例6：自组装的ph响应型r848脂质纳米囊泡(resiquimodsomes)的制备
[0141]
请参见图1b，r848纳米囊泡是通过薄膜水化加挤出的方法制备的。简而言之，将所有磷脂类分子以10mgml-1
的浓度溶解在氯仿溶液中，然后以6:4:0.5的摩尔比将dopg、chol-r848、dspe-mpeg
2000
添加到10ml圆底烧瓶中。旋转蒸发去除残留氯仿后，将所得10mg干燥的脂质膜中加入1mlpbs溶液(10mm，ph＝7.4)并在100w输出功率的超声浴下进一步水化5分钟。最后，将混浊的脂质悬浮液通过配备有100nm聚碳酸酯膜(avantipolarlipids)的微型挤出机反复挤出至少10个挤出循环，以获得尺寸均匀的纳米囊泡。使用超滤管(30kdamwcutoff,millipore)离心去除未负载的r848。
[0142]
实施例7：resiquimodsomes的ph触发r848释放行为的体外评估
[0143]
请参见图1d，对于释放动力学，将0.5mgml-1
的6mlr848脂质体纳米囊泡溶液等分到30个slide-a-lyzermini透析杯(20,000mwco，thermoscientific)，然后分别放入到
ph＝ 5.5或7.4的4l缓冲液中在37℃下轻轻搅拌进行透析。在释放过程中每24小时更换一次新鲜缓冲液。在每个指定的时间点，平行地从三个透析杯中的各收集100μlr848脂质体纳米囊泡溶液，并与一定体积的dmf/hcl(100/3，v/v)混合，以通过紫外/可见吸收光谱法在310nm 处定量r848浓度(spectramax m3，molecular devices)。
[0144]
实施例8：采用本公开酸响应纳米递送平台的设计所制备的resiquimodsomes药效试验及其增敏免疫检查点抑制剂的联合治疗
[0145]
将250,000个4t1细胞悬浮在100μl与等体积基质胶(bd biosciences)混合的无血清 1640培养基中，然后在第0天皮下注射到balb/c小鼠的右侧。当肿瘤体积达到50-100mm3时，将小鼠随机分成不同的组，并接受无菌pbs缓冲液(阴性对照)、小分子free-r848(2mgr848 kg-1
)和resiquimodsomes(2mg r848 kg-1
)或每只小鼠腹腔注射100μg免疫检查点抑制剂(αpd-l1，clone 10f.9g2，bioxcell)。详细的给药日程表请参见图13a。当肿瘤体积大于3000mm3或肿瘤的某一方面长度超过2.0cm时处死动物。
[0146]
肿瘤生长曲线表明，resiquimodsomes显着增强了r848的抗肿瘤功效(图13b，d)。同时，pbs组和αpd-l1单药组中的肿瘤生长迅速，显示出4t1肿瘤的侵袭性以及对免疫检查点抑制剂单药治疗反应不佳的局限性。此外，resiquimodsomes和αpd-l1联合治疗更显着地抑制了肿瘤进展，有效提高了小鼠的存活率，在实验组中有2/3的小鼠根除肿瘤(图13c)。
[0147]
实施例9：改变氯硅烷中硅原子上的烷基取代基调节药物的释放速率
[0148]
分别对用二氯二乙基硅烷共价连接的洛索立宾前药(chol-dichlorodiethylsilane-loxoribine) 和二异丙基二氯硅烷共价连接的洛索立宾前药(chol-diisopropyldichlorosilane-loxoribine)制备的载药脂质体进行洛索立宾释放行为的研究。ph＝5.0和ph＝7.2-7.4缓冲溶液分别模拟肿瘤或者发炎部位的酸性微环境和正常的生理条件。实验结果如图15所示，随着硅原子周围空间位阻体积的增加，药物释放的速度大大降低了，即二异丙基二氯硅烷作为连接体的药物释放速率明显低于以二氯二乙基硅烷作为连接体的药物释放速率。此外，在模拟肿瘤或者发炎部位的酸性微环境(ph＝5.5)显示出比正常生理条件(ph＝7.2-7.4)显著更快的洛索立宾的释放速率，这进一步证明了本发明提出的递送平台的位点特异性的可控释放。
[0149]
实施例10：改变磷脂分子的种类和投料比例调整脂质体的稳定性以及表面电势
[0150]
脂质体的粒径大小(z-average)及其单分散指数(pdi)与制剂稳定性直接相关，是评价脂质体稳定性的重要参数。高质量脂质体粒径大小、分布应较为稳定,粒径呈正态分布,且分布范围窄。zeta电位是体系中颗粒之间相互排斥或吸引强度的衡量标准,适宜的zeta电位能够减少脂质体的聚集和融合,且在脂质体与药物之间具有稳定作用。脂质体的表面电势通常由磷脂分子的头部基团决定，可以带正电或带负电或两性离子。中性脂质体多为卵磷脂等中性磷脂构成，如dlpc、大豆卵磷脂、p-lysopc、m-lysopc、dopc、dmpc、s-lysopc、 popc、dppc、蛋黄卵磷脂pl-100m等；负电性脂质体通常在磷脂分子中掺入磷脂酰丝氨酸等酸性磷脂，如dopg、dpps、dops等；而阳离子脂质体可在磷脂分子中掺入如dotma、 dotap、dop-deda、dlin-mc38-dma、dodma等阳离子脂质分子。如下表所示，dopg 作为常见的阴离子性磷脂分子，其在水中可自组装成负电性的脂质体。脂质体中掺入dotap 这类阳离子脂质分子，可极大提高脂质体的正电势。
[0151]
实验结果详见下表：
[0152][0153]
实施例11：本发明酸响应型纳米药物递送平台的设计可实现多种硅烷基醚前药的共递送，如共递送mk1775与nlg919纳米制剂的制备
[0154]
简而言之，将所有磷脂类分子以10mg ml-1
的浓度溶解在氯仿溶液中，然后以 6:1.59:1.41:0.5的摩尔比将dopg、chol-mk1775、chol-nlg919和dspe-peg
2000
添加到10ml 圆底烧瓶中。旋转蒸发去除残留氯仿后，将所得10mg干燥的脂质膜中加入1ml pbs溶液 (10mm，ph＝7.4)并在100w输出功率的超声浴下进一步水化40分钟。最后，将混浊的脂质悬浮液通过配备有100nm聚碳酸酯膜(avanti polar lipids)的微型挤出机反复挤出至少 10个挤出循环，以获得尺寸均匀的纳米囊泡。使用超滤管(30kda mw cutoff,millipore)离心去除未负载的mk1775或nlg919。
[0155]
以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。