一种过表达结核分枝杆菌c-di-AMP合成酶的重组卡介苗rBCG-DisA的应用

一种过表达结核分枝杆菌c-di-amp合成酶的重组卡介苗rbcg-disa的应用
技术领域
1.本发明属于重组卡介苗用于疾病的预防及免疫治疗领域。特别涉及一种过表达结核分枝杆菌c-di-amp合成酶的重组卡介苗rbcg-disa在黑色素瘤及糖尿病的预防和/或治疗中的应用。


背景技术：

2.卡介苗(bacillus calmette-gu
é
rin，bcg)是将牛分枝杆菌毒株接种于人工培养基并连续传代而获得的减毒株。bcg是目前唯一获得批准使用的结核病(tuberculosis，tb)预防疫苗。
3.1.bcg诱导的非特异性免疫应答可用于多种疾病的预防和/或免疫治疗
4.研究表明，bcg接种不仅可预防儿童严重tb，而且降低儿童非mtb感染的多种呼吸道疾病如肺炎、菌血症的发病率和死亡率。bcg对其它细菌(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等)、病毒(流感病毒、呼吸道合胞病毒，单纯疱疹病毒等)和寄生虫(曼氏血吸虫、疟疾)等非同源性病原体感染也具有非特异性的保护作用(moorlag sjcfm,arts rjw,van crevel r,et al.,clin microbiol infect.2019,25(12):1473-1478；covi
á
n c,fern
á
ndez-fierro a,retamal-d
í
az a,et al.,front immunol.2019,10:2806；aspatwar a,gong w,wang s,et al.,int rev immunol.2022,41(2):283-296.)。
5.此外，bcg作为非特异性免疫治疗剂，在临床上已用于非传统目的应用，包括：
①
预防或治疗病毒感染和非结核分枝杆菌感染；
②
癌症免疫治疗，如：浅表性膀胱癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤等；
③
免疫相关性疾病治疗，包括多发性硬化症、糖尿病、哮喘、阿尔兹海默症等疾病(singh ak,netea mg,bishai wr,et al.j clin invest.2021,131(11):e148291；mukherjee n,juli
á
n e,torrelles jb,et al.,vaccine.2021dec 8；39(50):7332-7340)。
6.因此，bcg作为一种免疫调节剂，可用于包括结核病在内的多种感染性疾病、肿瘤以及免疫相关性疾病等的预防和/或治疗。
7.2.bcg诱导的非特异性免疫应答机制
8.bcg的非特异效应机制包括异源性免疫和训练免疫。bcg诱导的异源性免疫包括抗原的交叉反应活性、异源性t细胞免疫、旁观者效应(bystander response)等。bcg作为活细菌疫苗，包含超过4 000个基因，由于共同抗原的存在，其刺激产生的抗体或效应细胞可能识别其他病原体或刺激物相同的表位，产生交叉免疫反应。异源性t细胞免疫主要由于异源性病原体与记忆性t细胞的t细胞受体(tcr)具有交叉反应活性。旁观者效应涉及th1/th17亚群、滤泡辅助性t细胞(tfh和nk细胞)等亚群的激活，从而释放各种细胞因子(lange c,aaby p,behr ma,et al.,lancet infect dis.2022jan；22(1):e2-e12.)。
9.近年研究表明，bcg接种诱导的异源性保护主要与一种固有免疫应答——训练免疫(trained immunity)有关。训练免疫的产生，是由内源性或外源性刺激物诱导固有免疫
细胞长期的功能重编程，细胞恢复到非激活状态，但再次接触刺激物后产生更强的炎症反应。训练免疫与经典的适应性免疫不同，其产生不依赖于t/b细胞，主要由单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、固有淋巴细胞、造血干/组细胞以及血管内皮细胞等介导(t.chavakis,b.wielockx,g.hajishengallis.annu rev physiol.2022；84:183-207.)。训练免疫被认为是进化中选择的一种抵抗感染的机制。bcg接种保护力可持续15～20年。现已证实，细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体及其组分可诱导训练免疫(rusek p,wala m,druszczynska m,et al.,int j mol sci.2018；19(2):456.2018,19(2).)。
10.研究证实，感染性疾病、糖尿病、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、肿瘤的发生和发展与训练免疫水平相关，而bcg接种诱导宿主产生训练免疫应答，可改变宿主免疫应答状态，从而达到免疫治疗效果(lange c,aaby p,behr ma,et al.,lancet infect dis.2022jan；22(1):e2-e12.)。bcg已用于临床上治疗非肌肉浸润性膀胱癌，新近研究表明，bcg抗肿瘤的作用与其诱导尿路上皮细胞产生更多的训练免疫标志性促炎细胞因子有关，说明bcg诱导的训练免疫有助于膀胱癌的治疗(van puffelen jh,keating st,oosterwijk e,et al.,nat rev urol.2022；17(9):513-525.)。对糖尿病患者研究发现，bcg接种对1型糖尿病患者具有良好的抗糖尿病作用，该过程中tnf-α介导的自反应性t细胞死亡以及调节性t细胞(treg)增加，从而恢复了患者的免疫稳态(denise l faustman.diabetes metab res rev.2018jan；34(1).)。多发性硬化症(multiple sclerosis，ms)是一种由异常免疫细胞介导的中枢神经系统炎症性疾病，外周循环中的异常t细胞和b细胞渗透进中枢神经系统引起脱髓鞘、轴突损伤和丢失。临床研究和动物实验表明bcg接种能缓解多发性硬化症的症状及复发，其机制与调节性t细胞介导的免疫应答有关。此外，在神经性疾病阿茨海默病(alzheimer's disease，ad)和帕金森病(parkinsons’disease，pd)中，bcg也具有潜在的治疗价值(faustman dl.j intern med,2020,288(6):641-650)。
11.bcg诱导的训练免疫随接种时间逐渐递减。成人结核病发病率增加，可能与出生时接种的bcg诱导的免疫应答随时间衰减有关(mcshane h.philos trans r soc lond b biol sci.2011,366,2782-2789.)。此外，bcg诱导的训练免疫对再次非特异性刺激产生的免疫应答有所不同，而不同bcg菌株诱导的免疫应答也存在差异。因此，诱导不同免疫应答特别是训练免疫水平的重组bcg(rbcg)菌株，在不同疾病的预防及治疗中的应用效果有所不同。
12.3.过表达结核分枝杆菌c-di-amp合成酶、c-di-amp为内源性佐剂的重组卡介苗(rbcg-disa)可诱导更强的免疫应答且安全性好(1)c-di-amp调控细菌生理及宿主免疫应答
13.环二腺苷酸(cyclic di-adenosine monophosphate，c-di-amp)是仅存在于细菌中的小分子核苷酸类信号分子，真核细胞中未发现该类核苷酸。对多种细菌的研究证实，c-di-amp参与调控细菌生长、离子转运以及细菌毒力等生理过程(yin w,cai x,ma h,et al.,fems microbiol rev.2020；44(6):701-724；commichau fm,gibhardt j,halbedel s,et al.,trends microbiol.2018；26(3):175-185；fahmi t,port gc,cho kh.genes(basel).2017；8(8):197.)。因此，c-di-amp成为抗菌药物的靶点。
14.更重要的是，c-di-amp被认为是固有免疫应答中新发现的病原体相关的分子模式
infect dis.2020,221,1048-1056.)。并且该rbcg对大鼠膀胱癌模型具有更好的免疫治疗效果，其机制与训练免疫相关(singh,a.k.,praharaj,m.,lombardo,k.a.,et al.nat commun.2022,13,878.)。上述研究表明，rbcg-disa可诱导比bcg更强的非特异性免疫应答，尤其是训练免疫。
19.(4)c-di-amp水平升高的rbcg具有更好的安全性
20.国外对disa过表达的rbcg研究表明，与野生株bcg相比，rbcg感染小鼠后的脏器荷菌数降低，且其感染的重度联合免疫缺陷(server combined immune-deficiency，scid)小鼠存活时间更长(dey b,dey rj,cheung ls,et al.,nat med.2015,21,401-406；singh,a.k.,praharaj,m.,lombardo,k.a.,et al.nat commun.2022,13,878.)，表明该rbcg具有良好的安全性。因此，提高bcg中的c-di-amp水平，可降低菌株毒力，从而使rbcg具有更好的安全性。
21.综上所述，bcg诱导的非特异性免疫应答对感染、肿瘤及自身免疫性疾病具有一定的保护作用。bcg诱导的这种非特异性保护作用与其诱导的训练免疫有关。通过过表达bcg中c-di-amp合成酶可提高rbcg中c-di-amp水平，增强rbcg诱导的免疫应答水平，包括训练免疫水平，并且可提高bcg的安全性。因此，过表达结核分枝杆菌c-di-amp合成酶、c-di-amp为内源性佐剂的rbcg-disa可用于肿瘤或其他疾病的预防和治疗制剂的制备。


技术实现要素：

22.本发明提供了一种过表达结核分枝杆菌c-di-amp合成酶的重组卡介苗rbcg-disa的应用。
23.本发明是通过以下技术方案来实现的：一种过表达结核分枝杆菌c-di-amp合成酶的重组卡介苗rbcg-disa作为制备糖尿病预防和/或治疗生物制剂的应用。
24.一种过表达结核分枝杆菌c-di-amp合成酶的重组卡介苗rbcg-disa作为制备黑色素瘤预防和/或治疗生物制剂的应用。
25.与bcg相比，rbcg-disa可产生更多的c-di-amp；c-di-amp作为内源性佐剂，可增强rbcg-disa诱导的免疫应答水平，包括训练免疫，且rbcg-disa呈现出良好的安全性。目前bcg被证实对感染性疾病、肿瘤和糖尿病等具有预防和/或治疗作用。本发明所述的过表达结核分枝杆菌c-di-amp合成酶的rbcg-disa可诱导更强的免疫应答，可用于糖尿病和黑色素瘤的预防和/或治疗生物制剂的制备，因而具有良好的应用前景。
附图说明
26.图1 rbcg-disa免疫治疗i型糖尿病小鼠效果。a，各组小鼠免疫治疗前后的随机血糖水平(stz ip，腹腔注射链脲佐菌素；1
st
/2
nd sc，初次和二次经皮下免疫治疗)；b，各组小鼠胰腺组织he染色(400
×
)；c，各组小鼠胰岛素的ihc染色(40
×
)；d，胰岛素的ihc染色阳性区域定量分析。(*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001)(分组：正常对照组[naive]，i型糖尿病模型组[dm]，bcg免疫治疗dm组[dm bcg]，rbcg-disa免疫治疗dm组[dm rbcg-disa])
[0027]
图2 rbcg-disa免疫诱导i型糖尿病小鼠炎症因子表达。bcg、rbcg-disa免疫治疗小鼠i型糖尿病后，分离小鼠骨髓细胞，诱导为巨噬细胞(bmdms)；采用bcg体外刺激后，提取总rna，qrt-pcr分析bmdms的炎症因子tnf-α(a)、il-β(b)、il-6(c)的转录水平。(*p《
0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)(分组：正常对照组[naive]，i型糖尿病模型组[dm]，bcg免疫治疗dm组[dm bcg]，rbcg-disa免疫治疗dm组[dm rbcg-disa])
[0028]
图3 rbcg-disa免疫诱导i型糖尿病小鼠表观遗传修饰水平变化。bcg、rbcg-disa免疫治疗小鼠i型糖尿病后，分离小鼠动脉血管。a，免疫组织化学染色(ihc)分析各组小鼠动脉血管的h3k4me3(400
×
)；b，各组小鼠动脉血管h3k4me3的ihc染色阳性区域定量分析。(*p《0.05，**p《0.01，ns无统计学差异)(分组：正常对照组[naive]，i型糖尿病模型组[dm]，bcg免疫治疗dm组[dm bcg]，rbcg-disa免疫治疗dm组[dm rbcg-disa])
[0029]
图4 rbcg-disa免疫治疗黑色素瘤小鼠效果。分别在注射肿瘤细胞后1天、3天和11天，经瘤旁注射各菌株三次免疫治疗。a，各组小鼠生存率；b，各组小鼠出瘤情况；c，各组小鼠肿瘤转移情况；d，各组小鼠肿瘤体积。(*p《0.05)(分组：黑色素瘤模型组[me]，bcg治疗黑色素瘤组[me bcg]，rbcg-disa治疗黑色素瘤组[me rbcg-disa])
具体实施方式
[0030]
本专利申请发明人前期构建了c-di-amp为内源性佐剂的rbcg-disa(保藏编号cctcc m 2016335)，发现与bcg相比，rbcg-disa可诱导更强的免疫应答，并且诱导更强的训练免疫，其可用于结核病的预防和/或治疗生物制剂的应用，因此申请了专利zl201610905489.6。进一步，课题组建立了小鼠糖尿病模型、黑色素瘤模型上，评价rbcg-disa接种诱导的免疫应答对两种疾病发生发展的影响。
[0031]
1.rbcg-disa免疫治疗i型糖尿病小鼠的效果评价
[0032]
小鼠i型糖尿病模型构建：将c57bl/6雄性小鼠(6周龄)随机分为4组(n＝5)：正常对照组糖尿病组(dm)、bcg免疫治疗组(dm bcg)、rbcg-disa免疫治疗组(dm rbcg-disa)。小鼠禁食不禁水14h，正常对照组小鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液，dm组、dm bcg、dm rbcg-disa组小鼠腹腔注射链脲佐菌素50mg/kg，连续注射5d天。注射7天后，连续三次血糖浓度≥16.7mm，表明模型建立成功。观察小鼠一般状况，每周测量小鼠体重。
[0033]
rbcg-disa免疫治疗i型糖尿病及治疗效果评价：注射链脲佐菌素14天后，分别采用1
×
106cfu的bcg、rbcg-disa经背部皮下注射免疫治疗糖尿病小鼠，4周后加强免疫一次。模型组和正常对照组注射等体积的pbs。免疫治疗后间隔一周尾静脉采血，使用血糖仪检测小鼠随机血糖水平。加强免疫4周后，处死小鼠，分离小鼠胰腺，用4％多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋。将石蜡包埋组织行连续切片，常规苏木精-伊红(he)染色，封片后于光学显微镜下观察组织病理变化；同时采用免疫组织化学方法(ihc)对胰岛素进行染色，分析胰岛素表达水平。
[0034]
结果显示，糖尿病模型建立前各组小鼠随机血糖均处于正常水平(＜11.1mm)，糖尿病模型建立成功后小鼠血糖水平升高(＞16.7mm)(图1a)。初次免疫治疗后，dm bcg组和dm rbcg-disa组小鼠血糖与免疫前相比均有下降趋势，dm rbcg-disa显著低于组，两治疗组间无统计学差异(图1a)。第二次加强免疫后，dm bcg组和rbcg-disa dm组小鼠血糖与初次免疫相比有所下降，且dm rbcg-disa组血糖低于dm组(图1a)。表明bcg和rbcg-disa免疫治疗均可以降低糖尿病小鼠血糖水平，其中rbcg-disa降低血糖的效果更好。
[0035]
he染色结果显示，与组相比，糖尿病小鼠胰岛明显萎缩，轮廓不规则、扭曲、
变形，边界模糊，胰岛数及胰岛内细胞数量明显减少，排列紊乱，分布稀疏；bcg、rbcg-disa免疫治疗组小鼠胰岛轻度萎缩，胰岛形态较规则，界限清晰，胰岛内细胞数量较多，尤其是rbcg-disa治疗组，部分小鼠胰岛形态完整接近正常组小鼠胰岛，表现出优于bcg的免疫治疗效果(图1b)。
[0036]
2.rbcg-disa免疫诱导i型糖尿病小鼠炎症因子表达情况
[0037]
bcg、rbcg-disa免疫治疗小鼠i型糖尿病后，分离小鼠骨髓细胞，诱导为巨噬细胞(bmdms)；采用bcg体外刺激后，提取总rna，qrt-pcr分析结果表明，i型糖尿病小鼠tnf-α、il-β、il-6转录水平显著低于正常小鼠；bcg免疫治疗后，小鼠bmdms对二次抗原刺激反应性增加，tnf-α、il-β、il-6转录水平显著增加；而rbcg-disa免疫小鼠bmdms的炎症因子转录水平显著高于bcg和糖尿病小鼠组(图2)。以上结果表明，糖尿病小鼠训练免疫标志性炎症因子表达下调，而rbcg-disa免疫可显著诱导上述炎症因子的转录增加，且水平高于bcg组，提示rbcg-disa诱导糖尿病小鼠更强的训练免疫应答(图2)。
[0038]
3.rbcg-disa免疫诱导糖尿病小鼠表观遗传修饰变化
[0039]
bcg、rbcg-disa免疫治疗糖尿病小鼠后，分离小鼠动脉血管。免疫组织化学染色ihc分析各组小鼠动脉血管的h3k4me3表观遗传修饰变化，发现糖尿病小鼠h3k4me3表观遗传修饰水平显著下调，而bcg、rbcg-disa免疫治疗可显著上调h3k4me3修饰水平，rbcg-disa组呈明显上升趋势，可能由于小鼠个体差异太大，与bcg组间无统计学差异(图3)。
[0040]
4.rbcg-disa免疫治疗黑色素瘤小鼠的效果评价
[0041]
小鼠黑色素瘤模型构建：将c57bl/6j雄性小鼠(6周龄)随机分为4组(n＝12)，分别为正常对照组黑色素瘤组(melanoma，me)、bcg免疫治疗组(me bcg)、rbcg-disa免疫治疗组(me rbcg-disa)。me、me bcg、me rbcg-disa组小鼠分别经腹股沟皮下注射3
×
105个小鼠黑色素瘤细胞b16f10，组于相同部位注射0.1ml pbs作为对照。建模后每天观察小鼠出瘤情况及一般状况。
[0042]
rbcg-disa免疫治疗黑色素瘤及治疗效果评价：分别于建模后1天、3天和11天后，me bcg、me rbcg-disa组于瘤旁皮下分别注射0.1ml的bcg、rbcg-disa菌液，细菌数量均为1
×
106cfu/只，me组注射0.1ml pbs。免疫治疗后每天观察并监测小鼠基本行为、肿瘤生长及小鼠存活情况。
[0043]
据观察可知，免疫治疗后未治疗模型组(me)小鼠最先出现精神差、活动度少症状，并于造模后46天生存率为8.3％。bcg治疗组小鼠症状出现较晚且症状较轻，bcg组于第24天首次出现死亡，小鼠46天生存率为50％(图4a)。rbcg-disa治疗组于第23天首次出现死亡，46天时生存率为66.67％，较未治疗组存活率显著延长(p《0.05)(图4a)。以上结果提示，bcg、rbcg-disa免疫治疗均可延长黑色素瘤小鼠的生存率，其中rbcg-disa免疫治疗效果优于bcg组。
[0044]
观察各组小鼠的出瘤时间，未治疗模型组在注射肿瘤细胞9天后首次出现皮下可见肿瘤，并在19天时全部小鼠出现肿瘤。bcg治疗组小鼠7天首次出现皮下可见肿瘤，于9天全部小鼠出现肿瘤，均早于未治疗模型组。而rbcg-disa组9天首次出现肿瘤，晚于bcg组；且32天全部小鼠出现肿瘤，晚于未治疗模型组。表明与bcg相比，rbcg-disa能够延缓小鼠黑色素瘤的出瘤时间(图4b)。
[0045]
小鼠自然死亡后进行解剖，观察肿瘤脏器转移情况。未治疗模型组小鼠中有50％
小鼠全腹腔发生转移；bcg治疗组有25％小鼠的肿瘤累及腹腔其他脏器；rbcg-disa组中仅有16％小鼠肿瘤累及其他脏器(图4c)。肉眼大体可见未治疗模型组小鼠腹腔脏器广泛淤血、坏死，且有若干小型黑色素瘤灶；bcg组小鼠腹腔大部分脏器未被侵袭；rbcg-disa组肿瘤未发生转移的小鼠可见少量腹水。此外，bcg和rbcg免疫治疗小鼠肿瘤体积较未治疗组均呈变小趋势(图4d)。因此，相比较于bcg而言，rbcg-disa一定程度上延缓肿瘤向其他脏器的转移。
[0046]
综上可知，rbcg-disa可诱导更强的免疫应答，尤其是训练免疫，且安全性优于bcg。与bcg相比，rbcg-disa接种可显著降低糖尿病小鼠血糖水平，减轻糖尿病小鼠的胰岛组织损伤；rbcg-disa可提高黑色素瘤小鼠的生存率，延长小鼠生存时间，并一定程度上延缓肿瘤的生长和转移。因此，过表达c-di-amp合成酶的rbcg-disa可用于糖尿病和黑色素瘤的预防和/或治疗生物制剂的制备，具有一定的应用价值。