胆酸复合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种胆酸复合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.非酒精性脂肪肝(nafld)是以肝实质细胞脂肪变性和脂肪蓄积为特征的一类疾病，目前世界上25％的人口患有nafld，非酒精性脂肪肝炎(nash)是nafld的亚型，其以肝细胞炎症损伤为特征，是单纯性脂肪肝向肝硬化及肝癌转变过程中的重要限速环节。然而，目前国际上针对nash的治疗方法十分局限，治疗药物更是空白，多个治疗nash的药物在临床实验中夭折，包括被赋予巨大希望的法尼醇x受体(fxr)激动剂奥贝胆酸(oca)。分析这些药物失败的原因，多为单一化合物无法针对复杂性疾病发挥全面作用，且往往会产生一些不良反应(如皮肤瘙痒等)。
3.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一在于提供一种胆酸复合物，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
5.本发明的目的之二在于提供上述胆酸复合物的应用。
6.本发明的目的之三在于提供上述胆酸复合物的制备方法。
7.本发明的目的之四在于提供一种包含上述胆酸复合物的药物。
8.本发明的目的之五在于提供上述药物的应用。
9.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
10.本发明提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸27～45份和牛磺鹅去氧胆酸15～25份；以及牛磺胆酸、胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸和牛磺石胆酸中的至少一个。
11.进一步的，所述胆酸复合物包括：牛磺熊去氧胆酸30～40份和牛磺鹅去氧胆酸16～22份；以及牛磺胆酸7～20份、胆酸0.1～1份、熊去氧胆酸0.05～1份、鹅去氧胆酸0.05～0.5份、去氧胆酸0.05～0.5份和牛磺石胆酸0.05～0.5份中的至少一个。
12.进一步的，所述胆酸复合物包括：牛磺熊去氧胆酸30～37份和牛磺鹅去氧胆酸17～21份；以及牛磺胆酸8～15份、胆酸0.3～0.6份、熊去氧胆酸0.09～0.4份、鹅去氧胆酸0.1～0.3份、去氧胆酸0.08～0.2份和牛磺石胆酸0.08～0.2份中的至少一个。
13.本发明还提供了上述的胆酸复合物在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。
14.进一步的，所述非酒精性脂肪肝病包括非酒精性脂肪肝炎。
15.本发明还提供了上述的胆酸复合物的制备方法，所述制备方法包括：将配方量的牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸，以及牛磺胆酸、胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸和牛磺石胆酸中的至少一个混合均匀，得到所述胆酸复合物。
16.本发明还提供了上述的胆酸复合物的另一种制备方法，所述制备方法包括：利用羟基类固醇脱氢酶对禽胆汁或禽胆粉进行生物转化后，经醇提、浓缩干燥，制备得到所述胆酸复合物；
17.其中，所述羟基类固醇脱氢酶包括7α-羟基类固醇脱氢酶和/或7β-羟基类固醇脱氢酶。
18.此外，本发明还提供了一种治疗非酒精性脂肪肝病的药物，包括上述的胆酸复合物及药学上可接受的辅料。
19.进一步的，所述药物的剂型包括口服制剂或注射制剂。
20.进一步的，所述药物的有效给药剂量为39～312mg/kg，优选为156mg/kg。
21.进一步的，所述非酒精性脂肪肝病包括非酒精性脂肪肝炎。
22.本发明还提供了上述的治疗非酒精性脂肪肝病的药物在制备治疗非酒精性脂肪肝病的产品中的应用；
23.优选地，所述非酒精性脂肪肝病包括非酒精性脂肪肝炎。
24.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
25.本发明的发明人通过大量实验发现，本发明提供的胆酸复合物，能有效改善模型小鼠肝脏回声，减轻肝脏病理损伤及降低nas评分，减少肝脏脂质沉积，减轻血清及肝脏的炎症反应，从而对非酒精性脂肪肝病有显著治疗作用。本发明通过选择特定的胆酸种类与特定的胆酸用量相配合，克服了单一化合物无法针对复杂性疾病发挥全面作用的技术问题，实现了对非酒精性脂肪肝病的有效治疗，为临床用药提供数据支持，也为其进一步研究开发奠定了基础。
26.本发明提供的治疗非酒精性脂肪肝病的药物，其活性成分为本发明提供的胆酸复合物，因此，基于胆酸复合物的有益效果，该药物也能够对非酒精性脂肪肝病起到明显的预防和/或治疗作用，同时安全无毒，副作用小。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为本发明实验例提供的造模8周体重变化趋势的结果图；
29.图2为本发明实验例提供的给药8周体重变化趋势的结果图；
30.图3为本发明实验例提供的造模8周肝脏超声图；
31.图4为本发明实验例提供的给药4周后腹部超声肝脏回声对比图；
32.图5为本发明实验例提供的给药4周后腹部超声肝脏回声评分统计图；
33.图6为本发明实验例提供的给药8周后腹部超声肝脏回声对比图；
34.图7为本发明实验例提供的给药8周后腹部超声肝脏回声评分统计图；
35.图8为本发明实验例提供的造模8周后肝大体形态图；
36.图9为本发明实验例提供的造模8周后肝脏系数结果图；
37.图10为本发明实验例提供的给药8周后肝大体形态图；
38.图11为本发明实验例提供的给药8周后肝脏系数结果图；
39.图12为本发明实验例提供的造模8周后小鼠肝脏he病理染色图(
×
200)；
40.图13为本发明实验例提供的给药8周后小鼠肝脏he病理染色图(
×
200)；
41.图14为本发明实验例提供的给药8周后小鼠肝脏he病理染色图(
×
400)；
42.图15为本发明实验例提供的造模8周后小鼠肝脏油红o染色图；
43.图16为本发明实验例提供的给药8周后小鼠肝脏油红o染色图(
×
200)；
44.图17为本发明实验例提供的造模8周后小鼠血清中tc，alt，ast含量水平结果图；
45.图18为本发明实验例提供的给药4周后小鼠血清中tc，alt，ast含量水平结果图。
具体实施方式
46.除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本技术中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
47.一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
48.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
49.根据本发明的一个方面，提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸；以及牛磺胆酸、胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸和牛磺石胆酸中的至少一个。
50.需要说明的是，本发明提供的胆酸复合物的主要活性成分为牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸，除主要活性成分外，还包括牛磺胆酸、胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸和牛磺石胆酸中的至少一个作为配合活性成分。例如可以选择牛磺胆酸、或者胆酸、或者熊去氧胆酸、或者鹅去氧胆酸、或者去氧胆酸、或者牛磺石胆酸；也可以选择牛磺胆酸和胆酸二者组合，或者选择去氧胆酸和牛磺石胆酸二者组合，或者选择牛磺胆酸和熊去氧胆酸二者组合，或者其他由两种配合活性成分组成的组合；也可以选择牛磺胆酸、胆酸和熊去氧胆酸三者组合，或者熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸和去氧胆酸三者组合，或者牛磺胆酸、去氧胆酸和牛磺石胆酸三者组合，或者其他由三种配合活性成分组成的组合；也可以选择牛磺胆酸、胆酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸四者组合，或者熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸和牛磺石胆酸四者组合，或者其他由四种配合活性成分组成的组合；也可以选择牛磺胆酸、胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸和去氧胆酸五者组合，或者其他由五种配合活性成分组成的组
合；另外，还可以选择牛磺胆酸、胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸和牛磺石胆酸全部作为配合活性成分。
51.其中，牛磺熊去氧胆酸(tudca)的含量为27～45份，例如可以为，但不限于27份、30份、32份、35份、38份、40份、42份或45份；牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)的含量为15～25份，例如可以为，但不限于15份、18份、20份、22份或25份。此外，还可以通过用量比对上述主要活性成分的含量进行限定，例如牛磺熊去氧胆酸与牛磺鹅去氧胆酸的含量比值可以为1.3～2.0:1。
52.本发明的发明人通过大量实验发现，本发明提供的胆酸复合物，能有效改善模型小鼠肝脏回声，减轻肝脏病理损伤及降低nas评分，减少肝脏脂质沉积，减轻血清及肝脏的炎症反应，从而对非酒精性脂肪肝病有显著治疗作用。本发明通过选择特定的胆酸种类与特定的胆酸用量相配合，克服了单一化合物无法针对复杂性疾病发挥全面作用的技术问题，实现了对非酒精性脂肪肝病的有效治疗，为临床用药提供数据支持，也为其进一步研究开发奠定了基础。
53.通过对本发明提供的胆酸复合物的活性成分用量进行调整和优化，优选所述胆酸复合物包括：牛磺熊去氧胆酸30～40份和牛磺鹅去氧胆酸16～22份；以及牛磺胆酸7～20份、胆酸0.1～1份、熊去氧胆酸0.05～1份、鹅去氧胆酸0.05～0.5份、去氧胆酸0.05～0.5份和牛磺石胆酸0.05～0.5份中的至少一个。优化后的胆酸复合物对非酒精性脂肪肝病的治疗效果更为显著。
54.对于可选择的配合活性成分，每种组分的用量牛磺胆酸(tca)的含量例如可以为，但不限于7份、8份、10份、12份、15份、18份或20份；胆酸(ca)的含量例如可以为，但不限于0.1份、0.2份、0.5份、0.8份或1份；熊去氧胆酸(udca)的含量例如可以为，但不限于0.05份、0.08份、0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份、0.6份、0.7份、0.8份、0.9份或1份；鹅去氧胆酸(cdca)的含量例如可以为，但不限于0.05份、0.08份、0.1份、0.2份或0.5份；去氧胆酸(dca)的含量例如可以为，但不限于0.05份、0.08份、0.1份、0.2份、0.3份、0.4份或0.5份；牛磺石胆酸(tlca)的含量例如可以为，但不限于0.05份、0.08份、0.1份、0.2份、0.3份、0.4份或0.5份。
55.在此基础上，本发明对该胆酸复合物的配方进行了进一步的优化，作为优选实施方式的胆酸复合物包括：牛磺熊去氧胆酸30～37份和牛磺鹅去氧胆酸17～21份；以及牛磺胆酸8～15份、胆酸0.3～0.6份、熊去氧胆酸0.09～0.4份、鹅去氧胆酸0.1～0.3份、去氧胆酸0.08～0.2份和牛磺石胆酸0.08～0.2份中的至少一个。
56.根据本发明的第二个方面，提供了上述的胆酸复合物在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。特别地，本发明提供的胆酸复合物在非酒精性脂肪肝炎的治疗中效果尤其显著。
57.根据本发明的第三个方面，提供了上述胆酸复合物的制备方法，包括：将配方量的牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸，以及牛磺胆酸、胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸和牛磺石胆酸中的至少一个混合均匀，得到所述胆酸复合物。
58.本发明提供的胆酸复合物的制备方法工艺简单，操作方便，且无需特定技术人员或昂贵设备，可有效节约成本。
59.此外，本发明还提供了上述胆酸复合物的另一种制备方法，包括：
60.利用羟基类固醇脱氢酶对禽胆汁或禽胆粉进行生物转化后，经醇提、浓缩干燥，制备得到所述胆酸复合物；
61.其中，所述羟基类固醇脱氢酶包括7α-羟基类固醇脱氢酶和/或7β-羟基类固醇脱氢酶。
62.本发明提供的胆酸复合物的制备方法工艺简单，操作方便，基于醇溶剂可回收利用的特性，还具有绿色环保的优点，可有效节约成本。
63.当使用此方法对胆酸复合物进行制备时，所述胆酸复合物还包括胆固醇、胆色素、氨基酸、多肽、蛋白质、金属元素中的至少一种，优选包括胆固醇、胆色素、氨基酸、多肽、蛋白质和金属元素全部。
64.当所述胆酸复合物包括上述物质时，优选地，其中的牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸和牛磺石胆酸在所述胆酸复合物中的质量百分数为60％～85％，例如可以为，但不限于60％、65％、70％、75％、80％或85％。
65.此外，根据上述应用，本发明还提供了一种治疗非酒精性脂肪肝病的药物，所述药物包括上述的胆酸复合物及药学上可接受的辅料。
66.本发明提供的治疗非酒精性脂肪肝病的药物，其活性成分为本发明提供的胆酸复合物，因此，基于胆酸复合物的有益效果，该药物也能够对非酒精性脂肪肝病起到明显的预防和/或治疗作用，同时安全无毒，副作用小。
67.其中，药学上可接受的辅料是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。在本发明提供的药物中添加的药学上可接受的辅料，能够起到赋型、充当载体或提高稳定性的作用，此外，还具有增溶、助溶或缓控释等重要功能。
68.典型但非限制性的药学上可接受的辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、ph调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂或释放阻滞剂中的一种或多种。
69.在一个优选的实施方式中，药物的剂型包括口服制剂或注射制剂。
70.当口服用药时，上述药物可制成任意口服可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂。
71.其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。口服混悬剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。
72.任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
73.当以注射的形式给药时，上述药物可制成任意注射可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于注射液或粉针剂。
74.其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
75.在一个优选的实施方式中，所述药物的有效给药剂量为39～312mg/kg，例如可以
为，但不限于39mg/kg、78mg/kg、156mg/kg或312mg/kg，当给药剂量为156mg/kg时，在证疗效的基础上，能够有效控制用药量。
76.本发明还提供了上述的治疗非酒精性脂肪肝病的药物在制备治疗非酒精性脂肪肝病的产品中的应用；
77.优选地，所述非酒精性脂肪肝病包括非酒精性脂肪肝炎。
78.下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
79.实施例1
80.本实施例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸27份、牛磺鹅去氧胆酸25份、牛磺胆酸7份、胆酸1份、熊去氧胆酸0.05份、鹅去氧胆酸1份、去氧胆酸0.05份和牛磺石胆酸0.5份。
81.实施例2
82.本实施例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸45份、牛磺鹅去氧胆酸15份、牛磺胆酸20份、胆酸0.1份、熊去氧胆酸0.5份、鹅去氧胆酸0.1份、去氧胆酸0.5份和牛磺石胆酸0.05份。
83.实施例3
84.本实施例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸40份、牛磺鹅去氧胆酸22份、牛磺胆酸10份、胆酸0.6份、熊去氧胆酸0.09份、鹅去氧胆酸0.3份、去氧胆酸0.08份和牛磺石胆酸0.2份。
85.实施例4
86.本实施例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸30份、牛磺鹅去氧胆酸21份、牛磺胆酸8份、胆酸0.6份、熊去氧胆酸0.09份、鹅去氧胆酸0.3份、去氧胆酸0.08份和牛磺石胆酸0.2份。
87.实施例5
88.本实施例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸37份、牛磺鹅去氧胆酸17份、牛磺胆酸15份、胆酸0.3份、熊去氧胆酸0.4份、鹅去氧胆酸0.1份、去氧胆酸0.2份和牛磺石胆酸0.08份。
89.实施例6
90.本实施例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸32份、牛磺鹅去氧胆酸18份、牛磺胆酸11份、胆酸0.4份、熊去氧胆酸0.2份、鹅去氧胆酸0.2份、去氧胆酸0.1份和牛磺石胆酸0.1份。
91.实施例7
92.本实施例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸35份、牛磺鹅去氧胆酸20份、牛磺胆酸13份、胆酸0.5份、熊去氧胆酸0.3份、鹅去氧胆酸0.22份、去氧胆酸0.15份和牛磺石胆酸0.15份。
93.实施例8
94.本实施例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸32份、牛磺鹅去氧胆酸18份和牛磺胆酸11份。
95.实施例9
96.本实施例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸32份、牛磺鹅去氧胆酸18份、熊去氧胆酸0.2份和鹅去氧胆酸0.2份。
97.实施例10
98.本实施例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸32份、牛磺鹅去氧胆酸18份、胆酸0.4份、去氧胆酸0.1份和牛磺石胆酸0.1份。
99.实施例11
100.本实施例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸32份、牛磺鹅去氧胆酸18份、牛磺胆酸11份、熊去氧胆酸0.2份、鹅去氧胆酸0.2份和牛磺石胆酸0.1份。
101.实施例12
102.本实施例提供了一种胆酸复合物，由以下方法制备得到：
103.将7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶与鸡胆精膏混合均匀，以酶菌体为例，7α酶菌体：7β酶菌体＝1:1-1:5，调节ph至6.5-9，室温反应过夜，加入乙醇至终浓度80
±
5％，16℃以下醇沉4h以上，过滤或离心收集清液，真空浓缩干燥成粉，温度低于80℃。
104.鸡胆汁准备：鸡胆去除杂质，过滤，取汁，加入乙醇至终浓度80
±
5％，16℃以下醇沉4h以上，过滤或离心收集清液，浓缩；浓缩清膏添加弱极性溶剂乙酸乙酯萃取3次，二者的体积比为1:2，收集水相浓缩为鸡胆精膏，备用。
105.对比例1
106.本对比例提供了一种胆酸复合物，包括：牛磺熊去氧胆酸30份、牛磺鹅去氧胆酸30份、牛磺胆酸8份、胆酸2份、熊去氧胆酸0.01份、鹅去氧胆酸2份、去氧胆酸0.01份和牛磺石胆酸1份。
107.对比例2
108.本对比例提供了一种胆酸复合物，与实施例4的区别在于，将熊去氧胆酸替换为石胆酸。
109.对比例3
110.本对比例提供了一种胆酸复合物，由如下重量份的组分组成：胆酸37.2份、牛磺熊去氧胆酸29.4份、牛磺鹅去氧胆酸25.4份和牛磺胆酸4份。
111.上述实施例1-11及对比例1-3的胆酸复合物的制备方法均为将配方量的各组分混合均匀得到。
112.实验例
113.主要仪器与试剂：
[0114][0115]
[0116][0117]
一、模型建立、动物分组与给药
[0118]
采用健康雄性spf级c57bl/6小鼠，鼠龄8-10周，购自：中国食品药品检定研究院(大兴)，许可证号：scxk(京)2017-0005；接收人员验收合格后，动物饲养在中国中医科学院中医基础理论研究所动物房，许可证号：syxk(京)2021-0017。每笼4-5只，动物房相对湿度范围50-60％；温度22℃至25℃，12h/12h明暗模拟昼夜交替。
[0119]
正常饮食饮水，适应性饲养1周后除正常组外通过高脂饲料和高糖饮水(containing 21.1％fat,41％sucrose,and 1.25％cholesterol and a high sugar solution(23.1g/l d-fructose and 18.9g/l d-glucose))模拟西方饮食喂养16周，前8周每周腹腔注射1次四氯化碳(0.2μl(0.32μg/g)，造模成功后即随机分组：正常组、模型组、实施例4提供的胆酸复合物各剂量组(39mg/kg；78mg/kg；156mg/kg；312mg/kg)、实施例1-3、5-12及对比例1-3组(156mg/kg)、引流熊胆粉(78mg/kg)对照组、阳性药吡格列酮组(30mg/kg)，具体分组给药剂量见下表1，正常组、模型组给予cmc-na作为对照，各给药组持续给药8周。
[0120]
表1给药剂量表
[0121]
5min-无水乙醇ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。
[0131]
2、苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。
[0132]
3、伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。
[0133]
4、脱水封片：切片依次放入无水乙醇i 5min-无水乙醇ii 5min-无水乙醇ⅲ5min-二甲苯ⅰ5min-二甲苯ⅱ5min透明，中性树胶封片。
[0134]
5、显微镜镜检，图像采集。
[0135]
6、半定量评分标准(nas积分)
[0136]
nas积分(0～8分)：
①
肝细胞脂肪变：0分(＜5％)；1分(5％～33％)；2分(34％～66％)；3分(＞66％)。
②
小叶内炎症(20倍镜计数坏死灶)：0分，无；1分(＜2个)；2分(2～4个)；3分(＞4个)。
③
肝细胞气球样变：0分，无；1分，少见；2分，多见。
[0137]
nas为半定量评分系统而非诊断程序，nas＜3分可排除nash，nas＞4分则可诊断nash，介于两者之间者为nash可能。规定不伴有小叶内炎症、气球样变和纤维化但肝脂肪变＞33％者为nafl，脂肪变达不到此程度者仅称为肝细胞脂肪变。
[0138]
4.油红o染色
[0139]
分别于造模8周和给药8周后对小鼠肝脏进行油红o染色。
[0140]
1、新鲜冰冻切片固定：将冰冻切片复温干燥，固定液中固定15min，自来水洗，晾干。
[0141]
2、油红染色：切片入油红染液浸染8-10min(加盖避光)。
[0142]
3、背景分化：取出切片，停留3s后依次浸入两缸60％异丙醇分化，各3s、5s。切片依次浸入2缸纯水中浸洗，各10s。
[0143]
4、苏木素染色：取出切片，停留3s后浸入苏木素复染3-5min，3缸纯水浸洗，各5s、10s、30s。分化液(以60％酒精为溶剂)分化2-8s，2缸蒸馏水洗各10s，返蓝液返蓝1s，将切片轻轻浸入2缸自来水中浸洗，各5s、10s，镜检染色效果。
[0144]
5、封片：甘油明胶封片剂封片。
[0145]
6、显微镜镜检，图像采集分析。
[0146]
5.小鼠肝脏超声检测
[0147]
分别于造模后8周(n＝4)，给药4周(n＝6)，8周(n＝6)进行肝脏超声检测。检测前隔夜禁食，次日以三溴乙醇进行腹腔注射麻醉后，于剑突下3cm上腹部使用脱毛膏进行脱毛，充分暴露腹部，取仰卧位固定，涂抹充足的耦合剂，使探头与腹壁充分接触，采用vevo 2100小动物超声仪进行腹部肝脏超声检查，使用ms400探头，探头频率为30mhz，在相同条件下(固定相同的深度，宽度和增益值)分别截取b model下的肝脏切面(选取三个标志性切面)进行灰度值评价。
[0148]
各组随机抽取小鼠进行肝脏超声检测，通过肝肾回声对比强度，评价肝脏损伤状况。肝脏回声高于肾脏回声代表肝脏损伤严重(-1分)；肝脏回声稍高于肾脏回声代表肝脏损伤较轻( 1分)；肝脏回声与肾脏回声差不多，以及弱于肾脏回声代表肝脏没有明显损伤( 2分)。
[0149]
6.血清生化指标检测
[0150]
分别于造模后8周(n＝4)，给药4周(n＝6)，8周(n＝6)对小鼠眼眶采血(约100μl)，室温静置4h后，4℃，3500rpm，离心15min后将上层血清吸出。按照试剂说明书操作进行测定分别检测肝功指标：谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、碱性磷酸酶(alp)、直接胆红素(dbil)、总胆红素(tbil)；血脂tc、tg、hdl、ldl。炎症因子白介素1β(il-1β)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)。
[0151]
7.肝脏生化指标检测
[0152]
于给药8周(n＝6)取小鼠肝脏，制备匀浆，使用日立7600全自动生化仪进行生化指标检测炎症因子tnf-α，il-1β；纤维化相关指标tgf-β；脂质相关指标tc，tg，ldl-c。
[0153]
8.统计分析
[0154]
数据计算表示为使用graphpad prism 8软件，对数据进行单因素方差分析(anova)，后检验使用sidak检验；当p《0.05时判定两组间具有显著性差异。
[0155]
二、实验结果
[0156]
1.胆酸复合物对nash模型小鼠动物状态及体重的影响
[0157]
造模8周小鼠体重如图1所示，模型组体重相比于正常组略有下降，但无显著性差异。
[0158]
给药8周分组后小鼠体重如图2所示(a：实施例4胆酸复合物a组；b：实施例4胆酸复合物b组；c：实施例4胆酸复合物c组；d：实施例4胆酸复合物d组)，与正常组相比，在给药后1周(实验第9周)模型组小鼠体重显著降低(p《0.05)，但给药2-8周与正常组相比均无显著性差异；与模型组相比，在给药后1周，胆酸复合物各个剂量组和引流熊胆粉组小鼠体重均有不同程度下降，其中实施例4胆酸复合物c，d两组体重降低明显(p《0.05；p《0.01)，且具有显著统计学差异；给药后2周实施例4胆酸复合物d剂量组体重显著下降(p《0.05)；给药后第4周c，d两组体重显著降低(p《0.01；p《0.05)；而阳性药吡格列酮组在给药后第1、2、3、5、7周与模型组相比小鼠体重均有不同程度升高，但无统计学差异，而第4周，6周，和8周有所降低，可能与相应时间点超声检测动物麻醉有关。
[0159]
2.胆酸复合物对nash模型小鼠肝脏超声指标的影响
[0160]
造模8周后，从正常组和模型组中随机抽取4只进行小动物肝脏超声检测，在bmodel模式下截取三个肝脏代表性固定切面。如图3所示，与正常组相比，模型组肝脏回声呈弥漫性细点状增强。
[0161]
给药4周，结果如图4(a：实施例4胆酸复合物a组；b：实施例4胆酸复合物b组；c：实施例4胆酸复合物c组；d：实施例4胆酸复合物d组)、图5(1control；2model；3引流熊胆粉组；4吡格列酮组；a：实施例4胆酸复合物a组；b：实施例4胆酸复合物b组；c：实施例4胆酸复合物c组；d：实施例4胆酸复合物d组)所示：各给药组均具有一定降低肝脏异常回声的作用，从肝肾超声回声对比强度评分可以看出：阳性药(吡格列酮)药效最好，与模型组相比具有显著差异(p《0.01)，其次各给药组均有不同程度改善，其中实施例4胆酸复合物d，c剂量组较为明显，但无统计学差异。
[0162]
给药8周，如图6(a：实施例4胆酸复合物a组；b：实施例4胆酸复合物b组；c：实施例4胆酸复合物c组；d：实施例4胆酸复合物d组)、图7(1control；2model；3引流熊胆粉组；4吡格列酮组；a：实施例4胆酸复合物a组；b：实施例4胆酸复合物b组；c：实施例4胆酸复合物c组；
d：实施例4胆酸复合物d组)所示，各个给药组与模型组相比，均具有一定药效，从肝肾超声回声对比强度评分可以得出：实施例4胆酸复合物c，b剂量组能够显著改善肝脏回声(p《0.01；p《0.05)。从给药4周和8周结果来看：吡格列酮组在4周给药中具有显著的疗效，但给药8周后药效反而不明显。
[0163]
3.胆酸复合物对nash模型小鼠肝脏大体和肝脏系数的影响
[0164]
造模8周后正常组、模型组随机选取4只小鼠眼球取血后，取小鼠肝脏拍照，如图8。
[0165]
结果所示，正常对照组小鼠肝脏组织色鲜红，表面滑润和致密；模型组，颜色微发白，肝脏表面出现许多微小的乳白色颗粒且肝脏外观粗糙。
[0166]
造模8周后肝脏系数如图9所示：与正常组相比，模型组肝脏系数显著增加(p《0.001)，表明肝脏可能存在水肿、充血或增生肥大。
[0167]
给药8周后肝大体结果如图10(a：实施例4胆酸复合物a组；b：实施例4胆酸复合物b组；c：实施例4胆酸复合物c组；d：实施例4胆酸复合物d组)所示，正常组小鼠肝脏组织颜色鲜红，表面滑润光泽，质地致密；模型组肝脏组织颜色发白，肝脏组织出现白色网状纹理，尾状叶形态异常疑似被脂质包裹；与模型组相比，各给药组中肝脏的颜色，质地以及脂质包裹现象均得到一定改善。其中实施例4胆酸复合物c，d剂量组肝脏组织颜色与模型组相比明显偏红，表面纹理变浅，改善最为明显，优于引流熊胆粉组和阳性药吡格列酮组。
[0168]
给药8周后肝脏系数结果如图11(1control；2model；3引流熊胆粉组；4吡格列酮组；a：实施例4胆酸复合物a组；b：实施例4胆酸复合物b组；c：实施例4胆酸复合物c组；d：实施例4胆酸复合物d组)所示，与正常组相比，模型组肝脏系数增加，但无明显差异，与造模4周时肝脏系数相比数值有所降低；与模型组相比，实施例4胆酸复合物a，c，d剂量组肝脏系数有下降趋势，其中c，d剂量组下降最为明显，但也无统计学意义。
[0169]
4.胆酸复合物对nash模型小鼠肝脏组织病理学的影响
[0170]
血清alt正常并不意味着无肝组织炎症损伤，alt增高亦未必是nash。肝活组织检查至今仍是诊断nash的金标准。造模8周后进行小鼠肝脏组织he染色，观察nash模型小鼠肝脏病理学改变，如图12所示，正常组肝脏组织被膜由厚薄均匀的富含弹性纤维致密结缔组织构成，肝小叶分界明显，排列规则，肝小叶中央为中央静脉，周围是大致呈放射状排列的肝细胞和肝血窦，肝细胞圆润、饱满；肝板排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压；相邻肝小叶之间的门管区无明显异常；未见明显的炎性改变。模型组组织中广泛可见中央静脉周围有大量肝细胞脂肪变性，胞质中可见大小不一的圆形空泡(1)；大量中央静脉周围可见结缔组织增生(2)，少见淋巴细胞浸润(3)；局部可见少量肝细胞气球样变性，细胞肿胀，核居中，胞质空泡化(4)。
[0171]
依据nash半定量评分系统，造模8周时各组评分见表2，nash模型组大鼠的肝脂肪变、小叶内炎症评分及nas总分均显著高于正常组(p《0.05；p《0.01；p《0.0001)；气球样变无明显差异。其中正常组nas总评分为0分，模型组nas总评分均≥4分，可明确诊断为nash，说明nash造模成功。
[0172]
表2造模8周后nash病理评分表(n＝4)
[0173][0174]
给药8周后如图13(a：实施例4胆酸复合物a组；b：实施例4胆酸复合物b组；c：实施例4胆酸复合物c组；d：实施例4胆酸复合物d组)，图14(a：实施例4胆酸复合物a组；b：实施例4胆酸复合物b组；c：实施例4胆酸复合物c组；d：实施例4胆酸复合物d组)所示，模型组大量肝细胞脂肪变性，胞质内可见大小不一的圆形空泡，少量肝细胞气球样变性，小叶内及静脉周围可见炎性细胞小灶性浸润，少见核内包涵体。所有药物对脂肪变性均具有一定的改善，其中实施例4胆酸复合物c剂量组改善最为明显(p《0.05)。依据nash半定量评分系统，各组评分见表3。
[0175]
nash模型组大鼠的肝脂肪变、小叶内炎症评分及nas总分均均显著高于正常组(p《0.0001；p《0.001；p《0.0001)；气球样变无明显差异。其中与模型组相比，实施例4胆酸复合物c在改善脂肪变性和nas总分上具有显著统计学差异(p《0.05；p《0.01)；引流熊胆粉组nas总分显著低于模型组(p《0.05)。吡格列酮组在给药8周后药效不明显。
[0176]
表3给药8周后nas病理评分表(n＝10)
[0177]
[0178][0179]
5胆酸复合物对nash模型小鼠肝脏脂质聚集的影响
[0180]
油红o脂肪染色法是显示组织内的脂肪含量的常用方法之一，油红o为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色。
[0181]
造模8周后小鼠肝脏组织冰冻切片油红o染色结果显示(图15)肝脏组织中存在大
量红色脂滴(黑色箭头)，有大量甘油三酯蓄积。
[0182]
给药8周后，见图16(a：实施例4胆酸复合物a组；b：实施例4胆酸复合物b组；c：实施例4胆酸复合物c组；d：实施例4胆酸复合物d组)，与正常组相比，模型组小鼠肝脏组织出现大量红色脂滴弥散性分布；与模型组相比，各个给药组小鼠肝脏脂滴均有一定改善，其中b，c剂量组改善最为明显。
[0183]
6.胆酸复合物对nash模型小鼠血清生化指标的影响
[0184]
血清生化指标是临床上常用辅助诊断nash的标准之一。谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、碱性磷酸酶(alp)以表征肝脏损伤程度；直接胆红素(dbil)、总胆红素(tbil)反映肝细胞代谢；血脂tc、tg、ldl与肝脏脂质代谢密切相关。
[0185]
造模8周后使用酶标仪，按照生化试剂盒说明书检测血清中tc，alt，ast含量，结果如图17所示，与正常组相比，模型组小鼠肝脏脂质代谢，肝损伤明显(p《0.0001)，但模型组中有个别只小鼠指标明显异常(耳标15，57号)，判断是未成模小鼠，因此在后期药效试验前剔除。
[0186]
给药4周后再次检测血清中tc，alt，ast含量，结果如图18(a：实施例4胆酸复合物a组；b：实施例4胆酸复合物b组；c：实施例4胆酸复合物c组；d：实施例4胆酸复合物d组；1control；2model；3引流熊胆粉组；4吡格列酮组)所示，正常组和模型组小鼠血清中tc含量较4周前明显升高，但两者之间无统计学差异；各给药组与模型组相比血清中tc含量也无明显差异。与正常组相比，模型组小鼠血清肝功指标alt，ast水平显著增高(p《0.05)；与模型组相比，实施例4胆酸复合物a，c组和吡格列酮组均能明显降低alt，ast水平(p《0.05)；实施例4胆酸复合物b和引流熊胆粉组能够显著降低ast水平(p《0.05)，对alt无明显改善作用。
[0187]
给药8周后，使用全自动生化分析仪进行血清的生化指标检测，结果如表4所示。
[0188]
表4给药8周后血清中生化指标含量水平
[0189]
[0190][0191]
肝损伤指标方面，模型组与正常组相比，alt，ast水平均有不同程度升高，但无统计学差异，各个给药组与模型组相比alt，ast水平无明显改变，无统计学差异。
[0192]
胆汁代谢指标方面，与正常组相比，模型组小鼠血清alp水平显著增高(p《0.05)；与模型相比，胆酸复合物各剂量组对alp水平有不同程度降低，但无统计学意义。与正常组相比，模型组小鼠血清tbil水平显著增高(p《0.05)，胆酸复合物各剂量组和阳性药组与模型组相比，tbil水平有不同程度降低，其中实施例4胆酸复合物c组与吡格列酮组有统计学差异(p《0.05；p《0.01)。与正常组相比，模型组dbil无明显改变，但实施例4胆酸复合物a，c，吡格列酮组与模型组相比均能显著降低dbil水平(p《0.05；p《0.01；p《0.0001)。
[0193]
脂质代谢指标方面，与正常组相比，模型组小鼠血清总胆固醇(tc)水平显著增高(p《0.05)，而各给药组没有降低tc的趋势。各个给药组血清中tg、ldl水平均无降低的趋势，无显著差异。
[0194]
炎症指标方面，与正常组相比，模型组小鼠il-1β、tnf-α水平显著升高(p《
0.0001)；与模型组相比，各个给药组il-1β水平均显著降低(p《0.0001；p《0.0001；p《0.01；p《0.001；p《0.05；p《0.001)；与模型组相比，各给药组tnf-α水平均降低，除引流熊胆粉组外，其余各组均具有显著差异(p《0.0001；p《0.0001；p《0.01；p《0.01；p《0.05)。各个给药组之间无差异。
[0195]
7.胆酸复合物对nash模型小鼠肝脏生化指标的影响
[0196]
给药8周后，使用全自动生化分析仪进行肝组织匀浆的生化指标检测，结果如表5所示。
[0197]
表5给药8周后肝脏中生化指标含量水平
[0198][0199][0200]
脂质代谢方面，与正常组相比，模型组小鼠肝脏组织tc、tg、ldl水平均显著升高(p《0.0001)；与模型组相比，各给药组tc水平均降低，其中实施例4胆酸复合物c(p《0.0001)、d组(p《0.001)和引流熊胆粉组(p《0.001)有显著差异；与模型组相比，各给药组tg水平均降低，其中实施例4胆酸复合物c组、引流熊胆粉组有显著差异(p《0.05)；与模型组相比，各给药组ldl水平均降低，其中实施例4胆酸复合物c(p《0.0001)、d组(p《0.001)和引流熊胆粉组(p《0.001)有显著差异。值得一提的是，脂质代谢指标中，实施例4胆酸复合物c剂量组对于tc和ldl-c的降低显著优于吡格列酮组(p《0.05；p《0.01)；其中实施例4胆酸复合物c剂量组对于ldl-c的降低作用明显优于实施例4胆酸复合物a剂量组(p《0.05)。
[0201]
炎症方面，与正常组相比，模型组小鼠tnf-α(p《0.0001)和转化生长因子β(tgf-β)(p《0.001)水平均显著升高。与模型组相比，各给药组tnf-α水平均降低，除实施例4胆酸复合物b组外，其余各个给药组均有统计学差异(p《0.05)。与模型组相比，各给药组tgf-β水平均降低，其中实施例4胆酸复合物a、b组与引流熊胆粉组均有显著差异(p《0.01)。炎症因子
如il-1β在对照组、模型组和模型组、给药组的比较中均无趋势和差异。
[0202]
以上实验结果表明，本发明提供的胆酸复合物或应用本发明提供的制备方法制备得到的胆酸复合物能有效改善模型小鼠肝脏回声，减轻肝脏病理损伤及降低nas评分，减少肝脏脂质沉积，减轻血清及肝脏的炎症反应，从而对非酒精性脂肪肝炎有显著治疗作用。本实验结果为胆酸复合物的临床用药提供数据支持，为其进一步研究开发奠定基础。
[0203]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。