用于诊断肝纤维化的非侵入方法

1.本发明属于肝功能领域，特别是肝纤维化及其诊断和分期，更特别是在患有非酒精性脂肪肝的患者中。


背景技术：

2.由于肥胖和代谢综合征，非酒精性脂肪肝病(nafld)是增长最快的流行病。目前没有fda批准的治疗nafld的药物。肝活检是非酒精性脂肪性肝炎(nash)的“金标准”诊断测试。迫切需要非侵入性生物标志物的鉴定，不仅可以早期发现nash患者，还可以预测疾病纤维化的进展。正在广泛评估成像技术和血液生物标志物，但它们中的大多数无法区分纤维化的不同阶段，有些由于成本高而难以使用。
3.在本领域中，活检被认为是测定nafld患者纤维化程度的“金标准”。它是侵入性的、定性的并且与风险相关，这些都是本领域的缺点。此外，它成本高且难以重复。nafld不会均匀地影响肝脏，因此采样错误很常见。样品质量差和分析偏差是与活检相关的进一步缺点。这些是本领域的严重问题。
4.诸如瞬态弹性成像(te)、超声扫描(uss/声像图)和磁共振成像(mri)等成像技术也用于诊断nafld的疾病进展。te和uss都依赖于运营商。uss不能区分纤维化程度。mri虽然高敏感度和特异性，但成本非常高。此外，mri可能需要注射昂贵的造影剂以及在扫描仪的幽闭恐恐惧环境中待较长时间，这两者都可能产生患者依从性问题以及需要经过培训的人员来进行。这些是本领域的问题。
5.迄今为止，非侵入性标记对个别患者的准确性有限。(wong et al 2018(wong,v.w.,adams,l.a.,de l
é
dinghen,v.et al.noninvasive biomarkers in nafld and nash-current progress and future promise.nat rev gastroenterol hepatol 15,461-478)回顾了针对nafld的不同特征(即脂肪变性、坏死性炎症和纤维化)的当前和潜在的生物标志物(包括血液生物标志物)。对于每个生物标志物，wong等人评估了其准确度、重复性、响应性、可行性和局限性。wong等人在第467页右栏“总结和建议”中进行了总结：
[0006]“ck18是nash诊断中最广泛评估的测试，但总体准确度充其量是中等的。尽管其他生物标志物或生物标志物组可能有希望，但大多数尚未经过独立验证。目前，没有一种nash生物标志物可用于常规临床应用。”[0007]
此外，该文献还关注nafld的进展。该文献不涉及纤维化。因此，仍然没有可靠/准确的生物标志物，这是本领域的问题。
[0008]
有一种称为“nafld模拟器”的计算工具可用于预测死亡率。该计算工具是由哈佛大学提供的(mgh inst.for tech.assessment,harvard medical school,101 merrimac st.ste 1010,boston,ma 02114,united states-https://mgh-ita-calculators.shinyapps.io/nafld-simulator/)。它是一种交互式、开放获取工具，用于应对与nafld和nash相关的短期和长期风险。然而，必须向该工具提供纤维化程度，以计算与nafld相关的并发症风险。该工具的任何方面都无法诊断或预测纤维化程度——该值必须
由外部提供给该工具，以发挥作用。此外，重要的是要强调这些是死亡率的预测标志物。该工具不涉及肝纤维化的评估、预测和诊断。实际上，如果本领域技术人员试图使用该工具，他们会发现必须提供纤维化数据，并且绝不会是从该工具的使用而得出的输出或推断。这是本领域的问题。
[0009]
wo2018/037229公开了一种诊断、预测或监测个体中非酒精性脂肪肝病(nafld)进展或对该进展进行分期的方法，该方法包括检测和量化从个体获得的生物样品中的一种或多种生物标志物，其中一种或多种生物标志物选自载脂蛋白f、脂多糖结合蛋白、纤维胶凝蛋白-2、载脂蛋白d、激肽原-1、载脂蛋白m、血小板反应蛋白-1、igg fc-结合蛋白、胱抑素-c、α-1-酸性糖蛋白2和富含亮氨酸的α-2-糖蛋白，从而诊断、预测或监测nafld的进展或对该进展进行分期。本发明不涉及任何这些生物标志物。
[0010]
dechiara等人在2018年(j.hepatol.2018 vol 69 pages 905-915)公开了非酒精性脂肪肝病中的尿素循环失调。作者认为nash与尿素循环酶(uce)的基因和蛋白质表达及活性降低有关。这可能通过uce基因的高甲基化和尿素合成障碍导致高氨血症。该文件提出了nash、uce的功能和高氨血症之间的关系。该文件提出氨作为预防nash进展的潜在目标。重要的是要注意，即使本文件中提出的理论是正确的，也提出在瘢痕/纤维化形成之前出现高氨血症，并且高氨血症可能会或可能不会导致瘢痕/纤维化。该文件没有公开纤维化的检测/诊断。
[0011]
chacko等人在2019年(redox biology’vol 22 doc i.d.101165)公开了一项精准医学中的线粒体研究；本文将血小板中的生物能量学和代谢组学联系起来。该文献得出结论，完整血小板中的代谢组在功能上是与生物能量学相结合的。有人建议，血小板能量学和代谢组学可用于评估人群对环境暴露的敏感性和个体之间毒性反应的严重程度，以及与阿尔茨海默氏症和其他与年龄相关的疾病的可能关系。没有提到肝纤维化。
[0012]
本领域中没有已知的肝纤维化的非侵入性测试。目前，唯一可以提供有关纤维化指示的测试是侵入性的，涉及活检，或至少涉及扫描/弹性测试/磁共振成像(mri)技术。目前临床上的“金标准”是肝活检。这是一种侵入性手术，伴随着显著的临床风险。事实上，目前的临床指南明确指出，除非患者/受试者怀疑患有晚期严重纤维化(即f3/f4肝纤维化)，否则不应使用活检。这些是本领域的严重问题。
[0013]
本发明试图克服与现有技术相关的问题。


技术实现要素：

[0014]
发明人教导了一种用于评估纤维化(即肝纤维化)的新的非侵入性方法。该方法有利地在样品(例如来自受试者的血液样品)上执行该非侵入性方法。新方法涉及非常少量的生物标志物，这些标志物经过精心挑选，可在检测的特异性和灵敏度方面提供极高的统计置信度。
[0015]
发明人在经历了一个涉及许多令人惊讶的见解的漫长且智力要求很高的过程之后，才完成了这项发明。首先，发明人检查了最初涉及的超过490种正在分析的代谢物的非靶向代谢组学数据。与此同时，发明人还对血液进行了生物能量学研究，这在以前从未应用于肝功能领域。作为以下更详细解释的几个发明灵感实例的结果，发明人随后对晚期/严重纤维化患者表现出的潜在生物化学做出了惊人的洞察力，并做出了突破性决定，将对选自
柠檬酸或尿素循环的特定酶的分析与血液中存在的选定代谢物结合起来。为了最大限度地减少标记物的数量并选择性能最佳的组合，发明人采取了进一步的创新决策，放弃了各种标记物，并创立了非常小而稳健的标记物选择(“小组”)，这些标记物在诊断/检测严重或晚期肝纤维化方面表现出极其稳健的统计性能。
[0016]
本发明基于这些令人惊讶的发现。
[0017]
因此，在一个方面，本发明涉及一种方法，包括
[0018]
a)提供受试者的血液样品
[0019]
b)测定所述样品中cps-1的表达水平
[0020]
c)将(b)的cps-1表达水平与从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品测定的cps-1表达水平进行比较
[0021]
d)测定所述样品中的谷氨酸水平
[0022]
e)将(d)的谷氨酸水平与从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的谷氨酸水平进行比较
[0023]
f)其中如果(b)的cps-1表达水平高于从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品测定的cps-1表达水平，和
[0024]
(d)的谷氨酸水平高于从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的谷氨酸水平，
[0025]
那么推断该受试者患有晚期或严重(f3/f4)肝纤维化的可能性增加。
[0026]
因此，在一个实施例中，本发明涉及一种方法，包括
[0027]
a)提供受试者的血液样品
[0028]
b)测定所述样品中精氨酸的水平
[0029]
e)将(b)的精氨酸水平与从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的精氨酸水平进行比较
[0030]
d)测定所述样品中的瓜氨酸/鸟氨酸比率
[0031]
e)将(d)的瓜氨酸/鸟氨酸比率与从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的瓜氨酸/鸟氨酸比率进行比较
[0032]
f)测定所述样品中的储备能力(reserve capacity)
[0033]
g)将(f)的储备能力与从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的储备能力进行比较
[0034]
h)其中如果(b)的精氨酸水平低于从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品测定的精氨酸水平，和
[0035]
(d)的瓜氨酸/鸟氨酸比率低于从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的瓜氨酸/鸟氨酸比率，和
[0036]
(f)的储备能力低于从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的储备能力，
[0037]
那么推断该受试者患有晚期或严重(f3/f4)肝纤维化的可能性增加。
[0038]
合适地，测定的cps-1水平是血浆cps-1水平。
[0039]
合适地，通过定量夹心免疫测定法测定cps-1水平。合适地，所述定量夹心免疫测定法包括elisa测定。
[0040]
合适地，使用质谱法来测定谷氨酸的水平。
[0041]
合适地，使用质谱法来测定精氨酸的水平。
[0042]
合适地，使用质谱法来测定瓜氨酸/鸟氨酸的水平。
[0043]
合适地，将储备能力确定为最大ocr减去基础呼吸。
[0044]
合适地，使用安捷伦科技公司的“xf细胞线粒体应激测试试剂盒”测定储备能力。
[0045]
合适地，受试者怀疑患有肝纤维化。
[0046]
合适地，受试者先前鉴定为患有f0-f2肝纤维化，优选f1-f2肝纤维化。
[0047]
合适地，受试者怀疑患有代谢综合征。
[0048]
合适地，受试者怀疑患有糖尿病，优选2型糖尿病。
[0049]
合适地，受试者怀疑患有非酒精性脂肪肝病(nafld)。
[0050]
合适地，受试者怀疑患有非酒精性脂肪性肝炎(nash)。
[0051]
因此，在一个实施例中，本发明涉及一种方法，包括
[0052]
a)提供来自在第一时间点采集的受试者的第一血样；
[0053]
b)或者：
[0054]
i.测定所述样品中的cps-1表达水平和测定所述样品中谷氨酸的水平，或者
[0055]
ii.测定所述样品中的精氨酸水平，测定所述样品中的瓜氨酸/鸟氨酸比率并测定所述样品中的储备能力；
[0056]
c)提供来自在第二时间点采集的受试者的第二血样；
[0057]
d)测定步骤(c)的所述第二血样中与步骤(b)中测定的相同的特征
[0058]
e)将步骤(b)的值与步骤(d)的值进行比较；
[0059]
f)从步骤(e)的比较中推断纤维化是否已经改变，其中如果步骤(b)和步骤(d)的值不同，则推断受试者的纤维化已经改变。
[0060]
合适地，如果所述第二样品中的cps-1表达水平和所述第二样品中谷氨酸的水平高于所述第一样品的水平，则推断所述患者的纤维化已经进展或增加，并且其中如果所述第二样品中cps-1表达水平和所述第二样品中谷氨酸水平低于所述第一样品的水平，则推断所述患者的纤维化已经消退或减少。
[0061]
合适地，如果所述第二样品中的精氨酸水平、所述第二样品中的瓜氨酸/鸟氨酸比率和所述第二样品中的储备能力低于所述第一样品的水平，则推断所述患者的纤维化已经进展或增加，并且其中如果所述第二样品中的精氨酸水平、所述第二样品中的瓜氨酸/鸟氨酸比率和所述第二样品中的储备能力高于所述第一样品的水平，则推断所述患者的纤维化已经消退或减少。
[0062]
合适地，该方法是一种监测对象随时间进展的方法。
[0063]
合适地，该方法是评估纤维化随时间变化的方法。
[0064]
合适地，该方法是测定对治疗的反应的方法。治疗可以是药物性的，例如一种或多种活性化合物的施用或治疗可以是行为性的，例如饮食、运动方式或其他因素。
[0065]
在另一个实施例中，本发明涉及治疗患有肝纤维化的受试者的方法，该方法包括执行如上所述的方法并且如果推断受试者患有晚期或严重(f3/f4)肝纤维化的可能性增加，那么向所述受试者给予一种或多种选自下组的治疗：改良的饮食、锻炼方案、低热量饮食和给予glp类似物，例如每周注射一次glp类似物。
具体实施方式
[0066]
发明人对生物标志物的独特方法基于生物能量学和代谢组学，并可以检测nafld疾病发病机制中的机制异常。这是迄今为止第一项使用外周血免疫细胞实时能量变化和使用非靶向全局代谢组学的相应代谢物变化的组合方法来研究nafld的疾病进展。
[0067]
这也有助于阐明疾病进展的分子机制。
[0068]“侵入性”在本领域中具有正常含义。采集生物体液样品(例如血液样品)不被认为是侵入性的。
[0069]“水平”是指浓度，例如表示为ng/ml，例如ng目标物质/ml样品。合适地，所述样品是血浆。为了一致性，如果需要，可以将其调整为代表ng物质/ml血液。重要的一点是，在比较值时，它们都是每毫升血浆(或每毫升样品或每毫升血液等)——只要根据通常的科学实践，所比较的数字之间的单位相同，那么绝对含义并不重要。
[0070]
值得注意的是，“瓜氨酸/鸟氨酸比率”没有单位，因为一个浓度除以另一个浓度留下一个没有单位的整数(即比率)。
[0071]
发明人教导晚期纤维化与非酒精性脂肪肝病(nafld)患者的外周免疫细胞中的线粒体功能障碍有关。
[0072]
由于肥胖和代谢综合征，非酒精性脂肪肝病(nafld)是增长最快的流行病。nafld的全球患病率为24％(younossi,et al)，预计2015年至2030年间，非酒精性脂肪性肝炎(nash)将在肥胖水平上升的推动下增加63％。到2030年，nafld导致的失代偿期肝硬化的发病率预计将增加168％，而hcc的发病率将增加137％(estes,c.et al)。人们认为nafld和nash的实际患病率高于先前估计的。在2型糖尿病患者中，患病率估计为70％(mantovani a,et al)。nafld被认为是代谢综合征的肝脏的表现形式(marchesini g,et al)。
[0073]
nafld的范围从肝脏周围的简单脂肪堆积(也称为脂肪变性)到定义为nash的炎症阶段。随后，这个过程会导致肝脏瘢痕形成，并可能发展为肝硬化，甚至肝细胞癌(hcc)。
[0074]
肝脏中良性脂肪积累发展为炎症并最终发展为瘢痕组织或肝硬化的机制尚不完全清楚。代谢功能障碍是nash/nafld的核心，包括线粒体功能、脂质代谢、胆固醇代谢和炎症的缺陷(bellanti et al)。胰岛素抵抗和肥胖是nafld的标志，其特征是能量消耗不平衡。这可以通过测量外周细胞的实时能量变化和代谢组学筛选来研究。线粒体是肝细胞的主要能量来源，在广泛的氧化代谢和肝脏的正常功能中起主要作用。使用过去几年开发的新测定方法可以测量细胞生物能量学和线粒体功能障碍。许多研究提出，外周血免疫细胞可以作为慢性疾病中线粒体功能障碍的传感器(rudkowska,raymond et a,czajka et al,maynard,s.et al,hartman et al)。由于易于获得和储存，外周血可能反映疾病的全身变化并为临床研究提供有价值的工具。氧化应激被认为是导致纤维化发生中涉及的产生炎症反应的潜在起始因素(yeh et al.,2007)。它还与各种代谢疾病中细胞因子的产生增加有关(incalza et al.,2018)。
[0075]
发明人提出，线粒体功能缺陷或免疫细胞中的生物能量学缺陷可用作nash中纤维化进展的预测标志物。线粒体功能障碍和相关的氧化应激可能在功能上具有重要的免疫后果，例如促炎细胞因子的产生增加。这会导致恶性循环，促进与nash相关的炎症、纤维化和坏死。这些代谢异常可以在外周细胞中检测到，并且可以用作反映肝脏变化的nash进展中肝纤维化的非侵入性生物标志物。
[0076]
代谢组学是对细胞活动产生的像葡萄糖或胆固醇这样的小分子的大规模研究。代谢组学的使用被广泛用于量化来自主要生物能量学途径的分子中间体范围。它还可以解释与疾病发病机制相关的机制并突出治疗靶点(gowda et al；nicholas j et al；delzenne and bindels)。非靶向代谢组学的综合分析可以测量代谢物质量并结合生物能量学和临床信息预测每种代谢物的特性，有助于检测nafld等复杂疾病发病机制中的机制异常。这是迄今为止第一项使用外周血免疫细胞实时能量变化和使用非靶向全局代谢组学的相应代谢物变化的组合方法，用于研究nafld的疾病进展。
[0077]
发明人研究了脂肪肝患者的生物体液中的生物能量学和代谢组学，并根据他们的见解制定了本发明。这也有助于阐明导致疾病进展的分子机制。这种理解可用于开发nash纤维化的非侵入性生物标志物。
[0078]
生物标记物选择
[0079]
本发明的一个优点是可以识别患有严重纤维化的受试者。
[0080]
本领域的观点是代谢综合征涉及非常多的途径并且以本领域尚不理解的复杂方式与肝纤维化相关联。发明人决定尝试识别与纤维化相关的生物标志物，并消除与代谢综合征重叠的并发症。
[0081]
发明人选择的一种方法是进行全局非靶向代谢组学。这是一个技术要求很高的过程，对于本领域技术人员来说是一个很大的震慑。应该注意的是，发明人教导在本发明的生物标志物组中关注的少量代谢物现在可以很容易地测定，因为它们已经被鉴定。然而，从最早的优先权日期开始，即没有后见之明和对本发明的了解，这些代谢物的鉴别是完全未知的，并且本领域技术人员不会考虑为了试图解决这个问题而进行非靶向代谢组学分析，并且这还代表了一条没有吸引力的途径且对于该领域的技术人员来说是一个重大障碍。
[0082]
发明人从490多种代谢物中收集了数据。这被减少到13种代谢物，并且在发明人做出进一步的智力决定后进一步减少到只有5种候选代谢物。不同寻常的是，发明人将来自生物化学和能量学的大量知识背景带到了不相关的肝纤维化领域。这使发明人能够做出智力见解，例如确定一些候选代谢物与线粒体功能障碍有关。
[0083]
与此同时，发明人做出了不同寻常的决定，对血液进行生物能量学研究。在对这些结果进行复杂分析的过程中，发明人再次能够利用他们在与肝纤维化领域完全不同的研究领域的非传统背景和训练，并获得了智力见解，即生物能量学数据似乎也指向可能的线粒体功能障碍。
[0084]
作为对该主题进一步研究的结果，发明人确定了关键的5种代谢物都是柠檬酸或尿素循环的一部分，他们意识到这仅发生在线粒体内。此外，发明人进一步了解cps1酶很可能是柠檬酸和尿素循环之间共有的唯一的酶。发明人确定该酶仅在肝细胞中表达，并且在那些细胞内仅在线粒体中表达。
[0085]
这一系列见解结合了来自至少两个不同领域的深厚知识和原创思想，因此代表了超出本领域普通技术人员预期的进步。
[0086]
为了进一步说明实现本发明的复杂性，应当注意，发明人承担了检查整个尿素循环，重复使用他们的非靶向代谢组学数据。当发明人能够确认他们在他们研究的那些巨大范围的分子中没有看到其他代谢物变化时，这进一步证实了他们关于可用于推断晚期或严重肝纤维化的生物标志物组的惊人的提议。
[0087]“增加”的小组
[0088]
本发明人教导了，标记物的最小/经验组仅涉及测定谷氨酸和cps1。提供了数据以支持这组生物标志物的这些统计意义。
[0089]“减少”的小组
[0090]
发明人教导了三种代谢物和能量因子的测定。更具体地，发明人教导了精氨酸水平和瓜氨酸/鸟氨酸比率以及“储备能力”的测定。
[0091]
发明人选择储备能力作为最重要的生物能量学标记物。一系列的智力见解使他们做出了这个决定，最重要的是，由于发明人将几个潜在的能量学因素组合在一起成单个数值，这是最重要的生物能量学标记物。
[0092]
应该强调的是，所有标志物分别显示轻度/中度纤维化和晚期/严重纤维化之间的显著差异。因此，“标准”方法可能是使用单一生物标志物，或者可能是按照更多数据点可以得到更可靠结果的一般原则将所有检查的生物标志物组合成一个扩大的小组。然而，相反，本发明人违背了本领域的传统思维，对标记进行了特定组合，并特别选择从分析中删除某些标记物，同时检查对接受者操作特征(roc)曲线的影响，以便基于深思熟虑提高他们的方法的特异性和/或敏感性，这是对于创造性的进一步指标。
[0093]
发明人公开了非酒精性脂肪肝病(nafld)的非侵入性生物标志物组，特别是用于评估nafld中的肝纤维化和/或评估其他情况下的肝纤维化。
[0094]
可以将每组生物标志物加入一个试剂盒，以检测和测量来自患者(例如nafld患者)的生物样品中的生物标志物。
[0095]
发明人已经创建了一组独特的非侵入性生物标志物，用于基于血液生物标志物诊断和分期患者的纤维化进展，最合适的是患有nafld的患者。这些生物标志物组表达过度或不足，并且这些组可用作疾病进展的测试，最适合nafld中的疾病进展。
[0096]
nash/nafld和肝炎
[0097]
肝脏中良性脂肪积累发展为炎症并最终发展为瘢痕组织或肝硬化的机制尚不完全清楚。功能障碍的代谢是nash/nafld的核心，包括线粒体功能、脂质代谢、胆固醇代谢和炎症的缺陷。胰岛素抵抗和肥胖是nafld的标志，其特征是能量消耗不平衡。这可以通过测量外周细胞的实时能量变化和代谢组学筛选来研究。
[0098]
由于易于获得和储存，外周血可能反映疾病的全身变化并为临床研究提供有价值的工具。氧化应激被认为是导致纤维化发生中涉及的产生炎症反应的潜在起始因素。
[0099]
在目前的研究中，我们提出，线粒体功能缺陷或免疫细胞中的生物能量学缺陷可用作nash中纤维化进展的预测标志物。线粒体功能障碍和相关的氧化应激可能在功能上具有重要的免疫后果，例如促炎细胞因子的产生增加。这会导致恶性循环，促进与nash相关的炎症、纤维化和坏死。
[0100]
代谢组学的使用被广泛用于量化来自主要生物能量学途径的分子中间体范围。
[0101]
发明人利用可以测量代谢物质量并结合生物能量学和临床信息预测每种代谢物的特性的非靶向代谢组学的综合分析来帮助检测nafld发病机制中的机制异常。
[0102]
发明人显示，代谢异常可以在外周细胞中检测到，并且可以用作反映肝脏变化的肝纤维化(例如处于nash进展中)的非侵入性生物标志物组。
[0103]
纤维化的分类
[0104]
肝脏的纤维化(hepatic fibrosis)或肝纤维化(liver fibrosis)(在本文中通常简称为“纤维化”)使用f0-f4范围内的等级进行报告。
[0105]
更详细地说，肝纤维化是肝脏微观结构的变化，通常是肝脏炎症的结果。肝纤维化进展为肝硬化。尽管根据受试者的医疗状况可能涉及一系列复杂的因素，但在某些情况下，戒酒和/或改变生活方式(饮食、运动)和/或治疗其他疾病(例如高胆固醇血症、糖尿病)和/或其他(多种)干预可以阻止或延缓纤维化进一步发展为显著或严重的纤维化和/或肝硬化。后者导致基础疾病的并发症，包括癌症(例如肝细胞癌(hcc))。
[0106]
肝纤维化的分类为本领域技术人员所熟知。如果需要任何进一步的指导，这将在下面概述。
[0107]
纤维化量的测量称为分期。有五个阶段(f0；f1；f2；f3；f4)。
[0108][0109]
纤维化评分可能重叠(例如，可能将患者描述为f0/f1、f1/f2)。
[0110]
对于患有f0纤维化的受试者，他们没有纤维化。
[0111]
对于患有f1至f2纤维化的受试者，他们患有轻度或中度纤维化。
[0112]
对于患有f3至f4纤维化的受试者，他们患有晚期或严重的纤维化。这些受试者也可能患有肝硬化。这些受试者，尤其是f4受试者，患肝细胞癌(hcc)的可能性增加。
[0113]
对于本发明的方法，最适合将目标受试者的分数与f1/f2值进行比较。因此，合适地，不会将目标受试者的分数与f0值进行比较。
[0114]
作为解释，应当注意到，f0不一定是健康个体。nash临床研究网络(nash crn)组织学评分有2个组成部分：nas评分(a)脂肪变性(0、1、2和3)(b)小叶炎症(0、1、2和3)(c)肝细胞气球样变(0、1和2)；和纤维化评分：0、1、2、3和4。因此，即使纤维化为0，这并不表示患者健康，因为患者可能有不同的nas评分，显示脂肪存在和nafld的炎症阶段。nafld疾病大致有4个阶段(1)单纯性脂肪肝(2)脂肪肝伴肝细胞炎症(nash)(3)轻度纤维化至中度纤维化(4)晚期纤维化。因此，纤维化可以为零，但可以存在脂肪肝和炎症，这是nafld的早期阶段。为避免疑义，本发明集中于评估受试者的纤维化/纤维化的可能性/纤维化的进展或增加/纤维化的消退或减少。本发明可应用于构建nash crn组织学评分，但本发明仅关注该评分的纤维化部分。示例部分提供了大量数据，这些数据包括基于nafld患者和纤维化发展的生物标志物的研究。存在作为阳性对照的健康对照，但本发明的方法合适地涉及与如所附权利要求中所述的与f1/f2对照值的比较。合适地，本发明的方法不基于与健康对照的改变/比较。
[0115]
检测
[0116]
可以使用测量蛋白质如cps-1的任何合适的方法，如光谱法、吸光度法、蛋白质免
疫染色法、蛋白质印迹法、斑点印迹和/或elisa。
[0117]
合适地，通过本领域已知的任何合适的方式检测本文所述的代谢物(例如谷氨酸、精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸等)。合适地，使用质谱法。最适合使用定量质谱。
[0118]
本发明不依赖于质谱仪或服务的特定品牌或供应商。
[0119]
熟练的操作者可以根据他们的需要选择特定类型的质谱。
[0120]
可能需要从以下类型中选择质谱：
[0121]
1)气相色谱-质谱(gc-ms)；
[0122]
2)液相色谱-质谱(lc-ms)
[0123]
这种选择通常取决于目标化合物的挥发性，即哪种流动相(即液体或气体)更适合分析。
[0124]
为了获得更高的特异性和/或分析更高分子量的分子，可能需要使用ms/ms(串联质谱，有时称为ms2)。这涉及通过质荷比(m/z比)进行第一次ms分离，然后通过第二次ms对目标峰进行碎片化并分析这些碎片(因此是ms-ms)。这也是本领域公知的标准技术。当然，这些技术可以根据操作人员的需要结合在一起(lc-ms、lc-msms、gc-ms、gc-msms等)。
[0125]
在一个实施例中，global profiling系统用于检测和/或量化代谢物水平。这可从metalomics health商购，即从biocrates life sciences ag,eduard-bodem-gasse 8 6020 innsbruck,austria购得。
[0126]
谷氨酸
[0127]
可以通过本领域技术人员已知的任何方式评估合适的谷氨酸水平。
[0128]
可以通过质谱法测定谷氨酸水平。
[0129]
可通过lc-ms、lc-msms、gc-ms或gc-msms测定谷氨酸水平。
[0130]
使用global profiling系统合适地评估谷氨酸水平。这可从metalomics health商购，即从biocrates life sciences ag,eduard-bodem-gasse 8 6020 innsbruck,austria购得。
[0131]
除非另能从文中明显得出，谷氨酸水平合适地指血浆谷氨酸水平。
[0132]
检测/质量/峰值
[0133]
本领域技术人员可以鉴定本文提及的代谢物，它们在化学上是众所周知的。如果需要任何进一步的指导，我们参考下表a。
[0134]
表a——可用于本发明的生物标志物的详情。
[0135]
[0136]
参考序列
[0137]
合适地，本文中的所有序列都参考提供为seq id no:1(核酸)和seq id no:2(蛋白质)的人cps-1进行讨论——见下文。
[0138]
当在本文中使用数字地址提及特定氨基酸残基时，编号参考人cps-1氨基酸序列(或如果提及核酸，则参考编码其氨基酸序列的多核苷酸序列)。
[0139]
如本领域所熟知的，这将用于定位目的残基。这并不总是一个严格的计数练习——必须注意上下文。例如，如果目标蛋白质的长度略有不同，则该序列中正确残基的位置可能需要将序列进行比对并挑选等效或相应的残基。这完全在熟练的读者的范围内。
[0140]
突变在本领域中具有其的正常含义并且可以指一个或多个残基、基序或结构域的取代或截短或缺失。突变可以在多肽水平上实现，例如，通过合成具有突变序列的多肽，或者可以在核苷酸水平上实现，例如，通过制备编码突变序列的多核苷酸，随后可以翻译该多核苷酸以产生突变的多肽。合适地，待使用的突变如本文所述。除非从上下文中另外明显看出，本文提及的突变是取代。例如
‘
v10a’是指人cps-1氨基酸序列(seq id no:2)中对应于
‘
v10’的残基被a取代。
[0141]
cps-1
[0142]
可以通过本领域已知的任何合适的方法来测定cps1(氨基甲酰磷酸合酶-1)水平。
[0143]
合适地，cps1是指人cps1。人cps1有几种已知的转录本，例如在genbank数据库中。
[0144]
最合适地，cps1(氨基甲酰磷酸合酶-1)的参考序列为seq id no:1：
[0145]
智人氨基甲酰磷酸合酶1(cps1)，转录变体2，mrna5,760bp线性mrna
[0146]
登录号(ncbi参考序列)：nm_001875，更合适的是nm_001875.5
[0147]
合适地，除非另从上下文中明显得出，否则“cps1”是指蛋白质序列，即具有由上述核酸序列编码的氨基酸序列的多肽。为避免疑义，cps1氨基酸序列为seq id no:2：
[0148]
除非另有说明，否则登录号用于genbank。genbank是一个序列数据库，如benson,d.et al,nucleic acids res.45(d1):d37-d42(2017)中所述。更详细地说，genbank由美国国家医学图书馆的国家生物技术信息中心进行管理(38a,8n805,8600 rockville pike,bethesda,md 20894，usa)。合适地依赖当前版本的序列数据库。或者，依赖于申请日有效的发布。为免生疑问，以ncbi-genbank第235版(2019年12月15日)为准。
[0149]
合适地，cps1水平是指cps1多肽/蛋白质水平。合适地，使用定量夹心免疫测定法测定cps1水平。合适地，所述定量夹心免疫测定法包括elisa测定。最合适使用elisa试剂盒目录号：rd-cps1-hu(来自red dot biotech,201-5309 main street,kelowna,bc,v1w 4v3,加拿大)测定cps1水平。这根据制造商的说明合适地进行。
[0150]
精氨酸
[0151]
可以通过本领域已知的任何合适的方法来测定精氨酸水平。
[0152]
可以通过质谱法测定精氨酸水平。
[0153]
可通过lc-ms、lc-msms、gc-ms或gc-msms测定精氨酸水平。
[0154]
使用global profiling系统合适地评估精氨酸水平。这可从metalomics health商购，即从biocrates life sciences ag,eduard-bodem-gasse 8 6020 innsbruck,austria购得。
[0155]
除非另能从文中明显得出，精氨酸水平合适地指血浆精氨酸水平。
[0156]
瓜氨酸/鸟氨酸
[0157]
鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)(也称为鸟氨酸氨基甲酰转移酶)是一种可催化氨基甲酰磷酸(cp)和鸟氨酸(orn)之间的反应形成瓜氨酸(cit)和磷酸(pi)的酶(ec 2.1.3.3)。
[0158]
可以通过本领域已知的任何合适的方法来测定瓜氨酸/鸟氨酸水平。
[0159]
可以通过质谱法测定瓜氨酸/鸟氨酸水平。
[0160]
可通过lc-ms、lc-msms、gc-ms或gc-msms测定瓜氨酸/鸟氨酸水平。
[0161]
使用global profiling系统合适地评估瓜氨酸/鸟氨酸水平。这可从metalomics health商购，即从biocrates life sciences ag,eduard-bodem-gasse 8 6020 innsbruck,austria购得。
[0162]
除非另能从文中明显得出，瓜氨酸/鸟氨酸水平合适地指血浆瓜氨酸/鸟氨酸水平。
[0163]
瓜氨酸/鸟氨酸比率使用以下公式计算：
[0164]
[瓜氨酸水平]/[鸟氨酸水平]＝瓜氨酸/鸟氨酸比率
[0165]
储备能力
[0166]
可以通过本领域已知的任何合适的方法来测定储备能力水平。
[0167]
可以通过细胞生物能量学来合适地测定储备能力。使用seahorse xfp分析仪(agilent technologies)中的“xf细胞线粒体应激测试试剂盒”合适地进行细胞生物能量学测试。
[0168]
在一个实施例中，从血液样品中提取pbmc并将其悬浮在xf培养基中，并将300,000个细胞/孔接种到cell-tak(beckton dickinson ltd)包被的xfp板(agilent technologies)。
[0169]
所有实验均在seahorse xfp分析仪中用3个重复孔合适地进行。
[0170]
耗氧率(ocr)是线粒体呼吸的一种测量方法，根据需要在特定线粒体激活剂和抑制剂存在的情况下进行测量。寡霉素(atp合酶阻滞剂)可用于测量atp周转率和测定质子泄漏。在该实施例中，线粒体解偶联剂fccp(羰基氰化物4-[三氟甲氧基]苯腙)用于测量最大呼吸功能(最大ocr)。
[0171]
按最大ocr减去基础呼吸计算储备能力。
[0172]
基础呼吸是在添加任何激活剂或抑制剂之前测量的，是细胞静止时的呼吸。它是通过测量第一次注射前的最后一次测量减去非线粒体呼吸来计算的。
[0173]
医学/临床考虑
[0174]
应当指出，大约70％的肝纤维化患者患有糖尿病，这尤其使得本文讨论的葡萄糖/麦芽糖方面很重要。
[0175]
本发明的一个优点是可以识别快速进展的个体。
[0176]
本发明的一个优点是可以识别患有高度纤维化的受试者。
[0177]
本发明可用于监测纤维化的进展。该实施例涉及在不同时间点执行方法发明，并比较来自这些不同时间点的结果。通过这种方式，临床医生或医师可以了解患者的纤维化是增加还是减少，或者保持不变。
[0178]
在一些方面，可以认为本发明是一种诊断工具，或一种用于收集有助于诊断的信息的工具。
[0179]
在一些方面，可以认为本发明是一种预测工具，或一种用于收集对预测结果或进展或解决方案，或预测治疗效果有用的信息工具。因此，在一些方面，测试(即本发明的方法)可以对同一受试者每月重复一次、每两个月重复一次或每三个月重复一次或每六个月重复一次。可以为受试者比较在这些不同时间间隔采集的样品的测定值。可以使用获得的值计算每月的变化率。这些值表明患者的纤维化是否稳定(如果值保持不变)或患者的纤维化是否正在进展/消退(如果值随时间变化)。如果在系列测试中观察到数值在增长(对于cps-1和/或谷氨酸)，或者如果观察到数值在减少(对于精氨酸和/或瓜氨酸/鸟氨酸比率和/或储备能力)，则它可以预测患者是纤维化的快速进展者还是缓慢进展者。例如，计算出的月增长率(对于cps-1和/或谷氨酸)，或计算出的月减少率(对于精氨酸和/或瓜氨酸/鸟氨酸比率和/或储备能力)给出了纤维化进展率的指示。因此，本发明可用于预测nafld不同阶段的进展。
[0180]
可以进行与此相反的操作以监测纤维化的消退和/或监测治疗的进展/有效性。例如，如果在系列测试中观察到值在减少(对于cps-1和/或谷氨酸)，或者如果观察到值在增长(对于精氨酸和/或瓜氨酸/鸟氨酸比率和/或储备能力)，可以表明纤维化正在消退和/或治疗有效。例如，计算出的月减少率(对于cps-1和/或谷氨酸)，或计算出的月增长率(对于精氨酸和/或瓜氨酸/鸟氨酸比率和/或储备能力)，给出纤维化衰退率的指示/治疗效果或改善速度/对治疗反应的指示。因此，本发明可用于预测治疗中不同阶段的nafld的衰退/消退/改善。这种监测还可以帮助评估治疗的有效性。
[0181]
本发明可用作晚期纤维化的标志物。首先，本发明在诊断纤维化后期(晚期纤维化/严重纤维化)的存在中得到应用。
[0182]
受试者
[0183]
合适地，受试者具有肝脏。合适地，受试者是脊椎动物。合适地，受试者是哺乳动物。合适地，受试者是灵长类动物。合适地，受试者是人。
[0184]
合适地，受试者怀疑患有纤维化。
[0185]
当怀疑受试者患有纤维化时，本发明在帮助临床医生或内科医生确定该受试者是否确实患有纤维化方面具有特殊应用。特别地，本发明可应用于帮助临床医生/医师确定受试者是否患有晚期或严重纤维化(f3/f4纤维化)。
[0186]
应该注意的是，本发明提供了突破，并且这是除了现有技术的侵入性活检程序之外的第一个待描述的肝脏纤维化测试。因此，在广泛的方面上，本发明提供了肝纤维化的生物标志物测试。
[0187]
合适地，受试者具有紊乱的酶水平。
[0188]
合适地，受试者具有较低的血小板。
[0189]
合适地，受试者的inr(国际标准化比值-表示凝血酶原时间)异常。
[0190]
组合
[0191]
本发明可以帮助区分肝纤维化的阶段。
[0192]
将本发明与额外的临床标记相结合可能是有利的。
[0193]
例如，本发明的方法可以与受试者中血小板水平的评估一起进行。这可能有助于对患者进行分类。
[0194]
本发明的主要用途是作为生物标志物来测试以指示肝的晚期纤维化的存在(或增
加存在的可能性)。
[0195]
本发明可用于鉴定患有f3/f4纤维化的受试者。
[0196]
临床方法
[0197]
f3/f4纤维化患者处于严重的临床状况，他们可能需要移植或其他干预。
[0198]
应该注意的是，组织病理学家很少将受试者单独归类为“f4”——实际上，组织病理学家很可能会给出“f3中的f4结节”或类似建议的意见。出于本发明的目的，将f3/f4患者分组在一起，因为本发明的生物标志物测试有利地识别该f3/f4类别中的患者。为免生疑问，f3/f4表示晚期纤维化。
[0199]
f3/f4患者唯一可用的治疗方法是肝移植。
[0200]
f3/f4受试者患hcc的风险也较高，因此需要进行强化筛查，例如每月6次cp超声筛查。
[0201]
患有f3/f4纤维化的受试者需要加强监测。因此，如果患者被确定患有f3/f4纤维化，可能会规定他们每3-6个月进行一次医院咨询。可能会规定他们积极改变生活方式。这可能包括替代饮食的处方。这可能包括血糖控制措施的处方。
[0202]
患有f3/f4纤维化的受试者经常处于心血管疾病的风险中，这种风险在f3/f4受试者中增强。因此，如果患者被确定患有f3/f4纤维化，则可以规定其进行高血压管理。可能对诊断为f3/f4纤维化的受试者开具高胆固醇血症的他汀类药物。
[0203]
f3/f4纤维化患者可能有患糖尿病的风险。可以为鉴定患有f3/f4纤维化的患者开具glp类似物(例如，每周注射一次例如由novo nordisk提供的glp类似物)。合适地，如果患者鉴定患有f3/f4纤维化，则将一种或多种glp类似物给予所述患者。最合适的是，如果患者鉴定患有f3/f4纤维化并且患有糖尿病，则将一种或多种glp类似物给予所述患者。
[0204]
更详细地说，glp类似物可称为glp-1或glp-1类似物(肠促胰岛素模拟物)。这种类型的药物通过增加称为“肠促胰岛素”的激素水平起作用。这些激素仅在需要时帮助身体产生更多的胰岛素，并在不需要时减少肝脏产生的葡萄糖量。它们会降低胃消化食物和排空的速度，还会降低食欲。incretin模拟物/glp-1类似物家族中有六种药物：
[0205][0206]
因此，可以为鉴别患有f3/f4纤维化的患者开具从这六种药物中选择的glp类似物/肠促胰岛素模拟物。合适地，如果患者被鉴定患有f3/f4纤维化，则将选自这六种药物中的一种或多种glp类似物给予所述患者。最合适地，如果患者鉴定患有f3/f4纤维化并且患
有糖尿病，则将选自这六种药物中的一种或多种glp类似物给予所述患者。
[0207]
在三级护理医院，临床试验可用于治疗nafld，这些试验使用例如fxr抑制剂(奥贝胆酸)的药物，用于非酒精性脂肪性肝炎引起的代偿期肝硬化患者(例如通过拦截进行的reverse研究)。因此，可以为被鉴别患有f3/f4纤维化的患者开具fxr抑制剂(例如奥贝胆酸)。合适地，如果患者被鉴定患有f3/f4纤维化，则将fxr抑制剂(例如奥贝胆酸)给予所述患者。
[0208]
管理可以从较少的就诊次数转变为更多的就诊次数，以提高对生活方式改变的依从性。因此，可能会要求鉴定患有f3/f4纤维化的患者更好地遵守生活方式改变，和/或可能要求更多地到诊所就诊以提高对生活方式改变的依从性。
[0209]
合适地，如果患者鉴定有f3/f4纤维化，则可以对所述患者开处方或进行hcc监测(肝细胞癌或肝癌)。合适地，如果患者鉴定有f3/f4纤维化，那么可以给所述患者开处方或给予每月6次超声检查和/或频繁的血液检查和/或内窥镜检查。
[0210]
相比之下，f0-f2纤维化患者通常需要每年进行一次监测。因此，他们可以每年或12个月进行一次医院咨询。可以规定f0-f2纤维化患者进行替代饮食。可以规定f0-f2纤维化患者改变生活方式，例如运动方案和/或卡路里控制。
[0211]
在一个实施例中，如果使用本发明的方法未测定受试者患有晚期/严重纤维化(即未测定患有f3/f4纤维化)，则推断他们患有f0/f2纤维化。
[0212]
纤维化/参考样品
[0213]
合适地，本发明方法的进行不参考健康对照或没有纤维化(f0纤维化)的受试者。
[0214]
与患有轻度/中度纤维化的受试者进行比较很重要，因为这可以提高该方法的性能。该方法旨在用于怀疑患有晚期或严重(f3/f4)纤维化的患者。本发明的方法对于健康人群的大规模筛查不太可能具有经济价值。合适地，本发明的方法针对怀疑患有或有风险患有肝纤维化的受试者。
[0215]
因此，在一方面，用作本发明方法的参考值的患有轻度/中度肝纤维化的合适受试者可以是：55岁女性，活检证实为轻度纤维化、非高血压、非糖尿病，bmi为27.5。
[0216]
来自该受试者的合适的截断值可以用作参考值，用于与来自使用本发明方法研究的受试者的值进行比较，如下所示：
[0217]
生物标志物截断值55岁女性谷氨酸34μmol/lcps15ng/ml精氨酸73μmol/l瓜氨酸/鸟氨酸比率0.45储备能力109pmol/min
[0218]
更合适地，在另一方面，来自大量f1-f2受试者的平均值可以用作本发明方法的参考值。
[0219]
这提供了一个优势，即通过使用从大量受试者中获得的值来“平均”任何受试者间的变化。因此，更合适的截断值可用于与来自使用本发明方法研究的受试者的值进行比较，如下所示：
[0220]
生物标志物f1-f2组群截断值
谷氨酸64μmol/lcps12.7ng/ml精氨酸62μmol/l瓜氨酸/鸟氨酸比率0.41储备能力185pmol/min
[0221]
最合适地，本发明中的方法适用于参考一名或多名匹配的患有轻度至中度纤维化(f1至f2纤维化)的受试者而实施。“匹配”是指与目标受试者匹配。因此，具有轻度/中度肝纤维化并在尽可能多的其他临床参数上与目标受试者匹配的合适受试者最适合用于比较。换言之，将目标受试者的生物标志物/代谢物测定(测量值)与患有轻度至中度纤维化(f1至f2纤维化)的受试者的生物标志物/代谢物测定(测量值)进行适当比较，并在尽可能多的临床参数(例如高血压、糖尿病或其他特征)上进行匹配。
[0222]
最合适地，患有轻度至中度纤维化(f1至f2纤维化)的参考/比较受试者也可以在诸如年龄、性别和/或bmi的参数上与目标受试者进行匹配。然而，本发明的一个具体优点是该方法(即生物标志物组)是稳健的并且不受年龄、性别或bmi参数的混淆。因此，年龄、性别和/或bmi的匹配是可选的，由操作员进行选择。
[0223]
因此，来自这样匹配的受试者的截断值可能最适合用作比较的参考值，用于与来自使用本发明方法研究的受试者的值进行比较。可以与为目标受试者所做的确定值串联/并行的形式确定这些值，或者可以将先前为匹配的受试者确定的数字与为目标受试者确定的数字进行比较。
[0224]
更多优势
[0225]
据发明人所知和所信，没有人将生物能量学分析与代谢物分析一起进行。一个原因是本领域对生物能量学分析存在偏见。人们认为这必须快速完成——对于pbmc，在1到2小时内完成——人们认为不能储存细胞，因此这被认为是本领域的一项糟糕技术。必须强调的是，将这两个领域结合起来并不是一个自然的逻辑步骤。通常，研究线粒体生物学的科学家不进行代谢物分析。发明人断言，这些是不同的领域，通常不会组合在一起。这进一步表明了这种创新方法的创造性。此外，应该注意的是，肥胖/代谢综合征没有可省略的药物。因此，本领域技术人员对结合现有技术知识的生物能量学和代谢物分析没有兴趣和动机。除此之外，进行非靶向代谢组学的技术负担和挑战非常令人反感，而且技术要求高且成本高。本领域的任何技术人员都不可能纯粹以推测的方式进行此操作。
[0226]
应该强调的是，发明人花费了大量的智力努力来尝试画出或绘制可能作为他们观察基础的所有不同生化循环的模型。当发明者发现传统的不同生物学领域之间重叠时，这是一个明显的鼓舞人心的时刻。此外，发明人对生物化学(例如他们认为他们正在观察的羟基化阻断)进行了详细了解。因此，发明人在他们的分析中仔细选择了要测试的内容，这与可能在不了解本发明的情况下采用的盲目或推测的“霰弹枪”方法形成对比。因此，即使选择要测试的内容也需要大量的智力和创造性努力。
[0227]
除此之外，发明人将糖尿病和线粒体生物学的丰富经验带到了肝病的新领域，因此结合了不同且非常遥远的专业领域来完成本发明。
[0228]
尽管如此，应该指出的是，以前没有人对纤维化进行过代谢组学。无论更普遍地对该技术进行了何种公开，这些仅涉及小鼠研究而不涉及人类，并且未涉及任何临床研究，这
进一步说明了发明人如何在达成本发明方面开辟了新天地。
[0229]
当然，化合物/生物标志物本身是已知的。例如，已在肝病的蛋白质组学研究中提及过cps1。然而，它从未被用作生物标志物，也从未披露或提示与纤维化的关系。此外，纤维化只是众多肝病的一个例子，因此即使在肝病蛋白质组学中普遍观察到cps1，仍然没有关于其在特定的生物标志物组及晚期或严重肝纤维化的特定诊断/推断中的用途的教导。
[0230]
同样，从未在nash/nafld患者中研究过能量学。以前，这些技术仅用于不相关的学科，例如糖尿病、衰老或运动耐力。在本发明之前，此类研究从未与肝病有任何联系。
[0231]
wong等人在2018年(ibid.)在第467页指出：
[0232]“总结和建议
[0233]
ck18是nash诊断中评估最广泛的测试，但总体准确性充其量是中等的。尽管其他生物标志物或小组可能有希望，大多数尚未经过独立验证。目前，没有一种nash生物标志物可用于常规临床使用。然而，该领域的积极研究将进一步为实践提供信息。在临床试验中使用不同的nash生物标志物取决于研究药物的作用机制。例如，细胞死亡标志物可能与靶向肝细胞凋亡的药物更相关。因此，非常适合评估代谢变化、细胞凋亡或细胞死亡、炎症或纤维化的生物标志物具有最大的相关性。”[0234]
提到可能使用生物标志物来评估代谢变化(如nafld进展但代谢变化)是一个非常广泛的术语和模糊的陈述，实际上有数百种可能受到影响的途径和相关代谢物。在本发明中，所公开的生物标志物组已通过创新的全局代谢组学方法进行了评估，其中不针对特定途径和代谢物。高度显著的代谢物与活检证实的纤维化程度相关。wong等人的评论只是关于nafld与代谢变化可能相关的一般假设，并没有提出特定的(多种)途径或(多种)代谢物。wong等人的评论只是用作邀请进行研究项目，因为它没有提供明确的教导。同样在达成本发明时，发明人使用了两种不同的方法，它们是相结合的(同时使用代谢组学和生物能量学)，而不是仅关注一个领域，例如代谢变化。因此，可以理解本发明的创造性/非显而易见性。
[0235]
de chiara等人在2018年(j.hepatol.2018vol 69pages 905-915)公开了与对照组相比，hfhc动物的cps1水平变化(参见de chiara的图2)。然而，该文献解决了nafld中尿素循环的失调，并侧重于尿素循环失调的机制。de chiara研究了hfhc动物中cps1的基因和蛋白质表达，并显示cps1的活性和表达降低。发明人的方法不同，因为发明人测量了cps1的血浆表达，该表达增加表明线粒体基质蛋白cps1是肝细胞死亡和损伤的凋亡和坏死形式的标志物，并在肝受损或损伤后释放到循环中。发明人的创新研究教导了血浆cps-1的测量可用作nafld中肝损伤的替代标志物/生物标志物，因此可用作nafld疾病进展的非侵入性生物标志物，即本发明教导了cps-1(即cps-1水平，尤其是血液、血清或血浆中，最合适的血浆中的水平)可用作增加患有晚期或严重(f3/f4)肝纤维化可能性的生物标志物，这相对于已知情况具有创造性/非显而易见的进步。
[0236]
样品
[0237]
合适地，样品包括来自目标受试者的生物流体。
[0238]
合适地，样品主要由来自目标受试者的生物流体组成。
[0239]
合适地，样品由来自目标受试者的生物流体组成。
[0240]
合适地，样品包括全血。
[0241]
血液有不同的成分，如血浆、血清和细胞。合适地，样品包括血液级分。用于从血液中分离不同级分例如血浆、血清、细胞(例如pbmc)的技术是常规的并且在本领域中是众所周知的。
[0242]
在一个实施例中，合适的样品包括血浆或血清。这些样品类型特别适用于代谢组学分析，例如测定谷氨酸、精氨酸、瓜氨酸/鸟氨酸等代谢物水平，并且特别适用于测定cps-1表达水平。在一个实施例中，当样品包括血液样品时，“测定所述样品中谷氨酸/精氨酸水平”或“测定所述样品中瓜氨酸/鸟氨酸比率”或“测定cps-1表达水平”的步骤包括从所述血液样品中分离血浆或血清，并测定所述血浆或血清中的谷氨酸和/或精氨酸和/或瓜氨酸和/或鸟氨酸(多个)水平和/或cps-1表达水平的步骤。
[0243]
在一个实施例中，合适的样品包含外周血单核细胞(pbmc)。这种样品类型特别适用于测定储备能力。在一个实施例中，当样品包含血液样品时，“测定所述样品中的储备能力”的步骤包括从所述血液样品中分离pbmc，并测定所述pbmc的储备能力的步骤。从血液中分离pbmc是常规的并且在本领域中是众所周知的。
[0244]
合适地，样品包括来自目标受试者的血浆或血清。
[0245]
合适地，样品主要由来自目标受试者的血浆或血清组成。
[0246]
合适地，样品由来自目标受试者的血浆或血清组成。
[0247]
合适地，样品包括来自目标受试者的pbmc。
[0248]
合适地，样品主要由来自目标受试者的pbmc组成。
[0249]
合适地，样品由来自目标受试者的pbmc组成。
[0250]
合适地，样品是活组织检查，例如从受试者提供的生物流体。
[0251]
合适地，该方法可以涉及样品的收集。
[0252]
更合适地，该方法不涉及样品的直接收集，而是对从目标受试者提供的体外样品进行该方法。
[0253]
在一个实施例中，样品是先前收集的体外样品，并且在该实施例中，本发明合适地不涉及与受试者身体的相互作用。合适地，样品是先前从受试者获得的体外样品。
[0254]
合适地，在(多个)样品上进行本发明的方法，例如从受试者获得或受试者提供的体外样品。
[0255]
合适地，该方法是体外方法。
[0256]
当样品是、包含或源自血液时，合适地，所述样品可以进一步包含有助于保存或改进样品的附加成分，例如(多种)抗凝剂，例如肝素。
[0257]
合适地，样品包括来自目标受试者的蛋白质。蛋白质制备是本领域中众所周知的。这可用于(例如)elisa测定，例如检测cps 1的表达。
[0258]
合适地，样品来自被怀疑患有或患有肝纤维化的受试者。
[0259]
合适地，样品来自患有f1肝纤维化的受试者。
[0260]
合适地，样品来自患有f2肝纤维化的受试者。
[0261]
合适地，样品来自患有f3肝纤维化的受试者。
[0262]
合适地，样品来自患有f4肝纤维化的受试者。
[0263]
最合适地，样品来自先前鉴定为患有f1-f2肝纤维化的受试者。
[0264]
合适地，样品来自怀被疑患有或患有代谢综合征的受试者。
[0265]
合适地，样品来自被怀疑患有或患有糖尿病的受试者，优选2型糖尿病。
[0266]
合适地，样品来自被怀疑患有或患有非酒精性脂肪肝病(nafld)的受试者。
[0267]
合适地，样品来自怀疑患有或患有非酒精性脂肪肝炎(nash)的受试者。
[0268]
合适地，该方法是体外方法。
[0269]
更多应用
[0270]
小组中生物标志物的变化(例如代谢物变化)可以很容易地用作验血，例如诊断性验血。合适地，这与使用合适的仪器/技术的生物能量学分析(最合适为储备能力)相结合。本文所述的方法可以并入试剂盒和/或试剂盒方法中以便于使用。因此，在一个实施例中，本发明涉及一种试剂盒，其包含用于检测在根据本发明的方法中描述的标志物的试剂。描述了单独的试剂盒——一种包含用于检测增加的标记物(例如标记物组)的试剂，另一种包含用于检测减少的标记物(例如标记物组)的试剂。此外，公开了一种组合试剂盒，该组合试剂盒合适地包含用于检测增加的标记物(例如标记物组)的试剂和用于检测减少的标记物(例如标记物组)的试剂。
[0271]
在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含特异性检测目的蛋白质或生物标志物的试剂。试剂可以是能够结合、合适地特异性结合这些生物标志物的抗体(最合适地，每个生物标志物一个抗体/每个抗体一个生物标志物)。抗体可以用作免疫测定法，例如elisa、蛋白质斑点印迹等。也可以使用其他测量蛋白质的方法，例如光谱法、吸光度法、蛋白质免疫染色法、蛋白质印迹等。其中，本发明提供了如本文所述的已知试剂的新用途。
[0272]
合适地，本发明的方法和/或试剂盒供临床医生使用，例如在医院和/或医生(医师)中，例如在一般实践(gp)环境中，例如医生的手术中。
[0273]
在广泛的方面，该方法包括在nafld患者的生物样品中使用一种或多种生物标志物。这些标志物可以单独使用或与其他标准护理诊断辅助工具结合使用，以诊断和对nafld的进展进行分期。这可以产生合适的管理计划。
[0274]
本发明可用作医院的标准护理验血，也可用作可测量生物样品中的生物标志物的试剂盒。
[0275]
本发明可用作单点快速测试或试剂盒。在这个实施例中，标记物的合适检测/测定是通过免疫组织化学或elisa的。
[0276]
对于代谢物表达增加的组(即包括谷氨酸和cps-1的组)，代谢物可以作为快速测试(半定量测试)进行测量。本发明提供了一种包括谷氨酸比色测试的试剂盒。strips反应基于谷氨酸脱氢酶催化的谷氨酸氧化，其中形成的nadh还原显色试剂。cps-1也可以通过免疫测定来测量。
[0277]
对于代谢物表达减少的小组(即包含精氨酸和储备能力的小组)，可以通过试剂盒或试纸轻松测量代谢物。本发明提供了一种包括谷氨酸(多个)比色测试的试剂盒。然而，需要注意的是，储备能力优选在seahorse(见示例)或荧光板上测量，其优点是方法更快。取决于操作者的选择，此类板可用于血液样品。
[0278]
在所附的独立和从属权利要求中阐述了进一步的特定和优选的方面。从属权利要求的特征可以合适地与独立权利要求的特征结合，并且可以与权利要求中明确阐述的那些不同的结合。
[0279]
在装置特征被描述为可操作以提供功能的情况下，应当理解，这包括提供该功能
或者被适配或配置为提供该功能的装置特征。
附图说明
[0280]
现在将参照附图以示例的方式描述本发明，其中：
[0281]
图1显示了图表；xf细胞线粒体应激测试试剂盒测量的线粒体功能的基本参数和代表性的一次实验。患有轻度/中度纤维化(蓝色)和严重纤维化(红色)的nafld患者的人类pbmc中的细胞线粒体谱。明确定义的抑制剂寡霉素(oligo)、fccp和rot/抗霉素a(antia)用于线粒体应激试剂盒。以300,000个细胞/孔的密度对pbmc进行计数和接种。使用seahorse xfp分析仪，进行了3次基础呼吸测量，然后注射寡霉素(最终0.75μm)，这显示了atp相关呼吸。为了评估最大呼吸，以0.75μm工作浓度注射fccp。储备能力测量为最大和基础呼吸之间的差。代表性数据显示为平均值
±
sem，每个样品n＝3次重复。
[0282]
图2显示了条形图-来自患有严重纤维化的nafld患者的活外周血单核细胞(pbmc)中的线粒体功能障碍。分离来自hc(n＝5)、轻度/中度肝纤维化(n＝10)和严重纤维化患者(n＝10)的pbmc，以3x105个细胞/孔接种，并使用seahorse xfp细胞外通量分析仪测量基础呼吸(a)、最大呼吸(b)、atp相关呼吸(c)、储备能力(d)、非线粒体生产(e)和质子泄漏(f)。数据表示为平均值
±
sem，并通过tukey检验的单向anova进行分析，其中*p《0.05，**p《0.01。
[0283]
图3显示条形图-ecar表示糖酵解。
[0284]
图4显示条形图-生物能量学健康指数(bhi)。
[0285]
图5显示条形图-显示代谢潜力的表型应激测试。
[0286]
图6显示条形图-nafld中晚期纤维化中的瓜氨酸/鸟氨酸逆转。
[0287]
图7显示条形图-nafld中晚期纤维化中精氨酸减少。
[0288]
图8显示图；图8a-检测异常值的主成分分析。具有层次聚类的热图发现kch-050319-18是异常值；图8b-偏最小二乘判别法分析得分图，比较健康对照(hc)血浆与nafld。r2＝0.6,q2＝0.45,auroc 0.96,cv anova p《0.01。
[0289]
图9显示了条形图-elisa测得的cps-1水平。
[0290]
图10显示了条形图——健康对照、轻度/中度纤维化和严重纤维化的nafld患者中炎症和氧化应激的循环标志物。(a)白介素-6(il-6)(b)白介素-8(il-8)(c)tnf-α(d)白介素-13(il-13)的血浆浓度。数据表示为平均值
±
sem(hc n＝9,f1-f2 n＝12,f3-f4＝8),*p《0.05.**p《0.01和***p《0.001。
[0291]
图11显示了图表
–
图11a：在f1-f2与f3-f4 nafld组中使用谷氨酸 cps-1的roc曲线分析显示灵敏度为0.95和p＝0.0007；图11b：在f1-f2与f3-f4nafld组中使用瓜氨酸/鸟氨酸 精氨酸 储备能力的roc曲线分析显示灵敏度为0.94和p＝0.0006。
[0292]
图12显示了图表。
[0293]
实例
[0294]
实例1
[0295]
方法
[0296]
在这个实例中，我们调查了30名受试者，分为3组：患有轻度纤维化的nafld受试者(n＝10)、患有严重纤维化的nafld受试者(n＝10)和健康对照组(n＝10)。所有nafld患者都
有活检证实的纤维化。使用xfp seahorse分析仪测量pbmc中的耗氧率(ocr)。基于质谱的非靶向代谢组学方法用于分析这些样品中广泛的人血浆代谢物。还对相应的血浆样品进行了针对cps-1的elisa和炎症标志物的msd。
[0297]
发现
[0298]
与轻度纤维化的nafld患者相比，线粒体生物能量学显示，nafld严重纤维化患者pbmc的基础呼吸、atp相关呼吸、最大呼吸和储备能力降低。非靶向全局代谢组学方法显示了在轻度和严重纤维化的nafld患者之间存在显著差异的13种代谢物。这些代谢物中的大多数都参与了线粒体中发生的途径。
[0299]
解释
[0300]
外周血样品中的代谢物和生物能量学测量可以结合在一起作为一个独特的小组，用于nafld的诊断和分期。
[0301]
研究设计和参与者：
[0302]
经地区研究伦理委员会伦理批准(rec；参考号18/lo/1355)，经国王学院医院诊所书面知情同意，在2018年至2019年间招募患者。该横断面研究遵守了《涉及人类受试者的医学研究伦理原则》，世界医学协会赫尔辛基宣言。将患者分为3组进行研究：第1组。在知情同意的情况下招募了没有任何慢性病史的健康对照(n＝10)，并且年龄和性别与患者研究组匹配。第2组包括患有轻度/中度纤维化1或2期(n＝10)的脂肪变性患者，第3组是患有晚期纤维化3或4期(n＝10)的患者。第2组和第3组中的所有受试者的肝活检均符合nash(根据nafld活动评分[nas]定义为存在至少1级脂肪变性、肝细胞气球样变和小叶炎症)和纤维化(1-4)(根据nash crn分类)。既往无失代偿性肝病、慢性hbv和hcv感染、hiv阳性、其他肝病原因或恶性肿瘤病史或任何其他严重并发症。
[0303]
20名nafld参与者的年龄在20-74岁之间(平均值＝52)，女性:男性比例为8:12。该组的平均bmi(kg/m2)为35
±
6.5。在20名受试者中，14名(70％)患有2型糖尿病，10名(50％)被诊断患有高血压。平均收缩压为136
±
14(mmhg)，舒张压为81
±
9(mmhg)。作为lsm值测量的肝脏硬度的fibroscan值为11
±
5.2kpa，用于评估脂肪含量值的受控衰减参数(cap)为331
±
74。表1显示了本研究中使用的nafld受试者的基线特征。
[0304]
表1：nafld研究组群的基线特征
[0305]
[0306][0307]
脚注：数据是平均值
±
sd。bmi:体重指数，hba1c：糖化血红蛋白，
[0308]
htn:高血压，dm:糖尿病，bp：血压，hdl:高密度脂蛋白，ldl:低密度脂蛋白，fbs：空腹血糖、alp：碱性
[0309]
磷酸酶，alt：丙氨酸氨基转移酶，ast：天冬氨酸氨基转移酶，ggt：
[0310]
γ谷氨酰转移酶。
[0311]
特别注意:*p《0.05
[0312]
目前没有数据可用于对nash患者pbmc的耗氧率进行正式的样品量计算。目前的研究必须被视为一项初步研究。该研究的目的是深入了解线粒体功能障碍在nafld中单纯性脂肪变性向纤维化进展中的可能作用。我们估计每组7-10名nafld患者将足以获得对效应大小的可靠估计。我们建议包括5-10个健康对照来建立参考值。
[0313]
过程：
[0314]
样品制备：
[0315]
将血液收集在8ml细胞制备管(cpt)管(becton dickinson,franklin lakes,nj,usa,ref.362753)中，用于分离外周血单核细胞(pbmc)和血浆。管中使用的抗凝剂是肝素
钠，细胞分离是基于使用ficoll法的原理。常规采血取抗凝血，倒置试管8～10次，使抗凝剂与血液混合。然后将试管在室温(18-25℃)下在水平转子(外摆头)中以1500至1800xg离心至少15分钟。离心后，pbmc在血浆层下方可见为白色层。在不干扰细胞层的情况下去除血浆，并在离心后立即进行细胞分离以获得最佳结果。从血浆中分离出pbmc后，立即对其进行计数，并使用countess自动细胞计数器检查其活力。在2小时内将pbmc铺在为seahorse xfp分析仪(agilent technologies santa clara,ca美国)设计的xfp 8孔聚苯乙烯板上。血浆样品立即储存在-80℃用于代谢组学分析。
[0316]
外周血单个核细胞(pbmc)中生物能量学的测量：
[0317]
在seahorse xfp分析仪(agilent technologies)中使用xf细胞线粒体应激测试试剂盒进行细胞生物能量学。将pbmc悬浮在xf培养基中，并将300,000个细胞/孔接种到cell-tak(beckton dickinson ltd)包被的xfp板(agilent technologies)中。所有实验均在seahorse xfp分析仪中用3个重复孔进行。
[0318]
ocr是线粒体呼吸的测量值，ecar与从细胞释放的质子数量相关，可能来自糖酵解和krebs循环，在特定线粒体激活剂和抑制剂的存在下进行测量ecar。寡霉素(atp合酶阻滞剂)用于测量atp转换并测定质子泄漏，线粒体解偶联剂fccp(羰基氰化物4-[三氟甲氧基]苯腙)用于测量最大呼吸功能(最大ocr)。按最大ocr减去基础呼吸计算储备能力。在实验结束时，注射鱼藤酮(复合物i的抑制剂)和抗霉素a(复合物iii的阻滞剂)以完全关闭线粒体呼吸，以确认在呼吸中观察到的任何变化都是线粒体的(brand and nicholls,2011；dranka et al.,2011)(图1)
[0319]
对于基础呼吸的测量，在注射0.75μm(终浓度)的atp合酶抑制剂寡霉素之前进行了3次测量。然后注射0.75μm的fccp。最后，注射鱼藤酮和抗霉素a(1μm)的混合物。在校正非线粒体呼吸后测量线粒体基础呼吸、质子泄漏、备用能力和最大呼吸。将ocr和ecar率标准化为pbmc的细胞计数。测量细胞代谢潜能的细胞能量表型检测试剂盒也用于部分实验。xf mito应激测试报告生成器根据导出到excel的wave数据自动计算xf细胞mito应激测试参数。
[0320]
全局代谢组学谱：
[0321]
基于global profiling quant平台(biocrates life sciences，innsbruck，澳大利亚)的基于质谱的代谢组学方法用于分析涵盖各种生化类别的广泛的人类血浆代谢物。应用统计方法来识别各个组之间的差异。该分析包括数据归一化和转换，然后是用显著性检验的单变量统计。
[0322]
通过专有方法提取血浆样品，并在蛋白质沉淀后分离成脂质和极性部分(补充材料；图s1)。global profiling使用了两种类型的质谱分析：气相色谱-质谱(gc-ms；agilent 6890 gc与agilent 5973 ms系统联用，agilent,waldbronn,germany)和液相色谱-ms/ms(lcms/ms；agilent 1100 hplc-system,agilent,waldbronn,germany)，与applied biosystems api4000 ms/ms-system联用，applied biosystems,darmstadt,germany)(van ravenzwaay et al.,2007)。对于gc-ms分析，样品在测量前依次衍生化。在lc-ms/ms分析中，应用了metanomics health专有技术，该技术允许与全屏分析并行进行有针对性的高灵敏度mrm(多反应监测)概略分析。
[0323]
标准化
[0324]
从所有血浆样品的等分试样中提取的合并参考样品在整个分析过程中平行进行，并用于评估分析过程的可变性，作为在代谢物、样品和实验(研究)水平上执行的严格质量控制的一部分。随后，数据针对合并参考样品中的中值进行标准化，以给出合并标准化比率(针对每个代谢物的每个样品执行)。这补偿了仪器间和仪器内的变化。
[0325]
为了实现boost量化并允许实验间的数据对齐，设计了mxpooltm概念。mxpool
tm
是要分析的样品材料的固定库存，并存储在metanomics health内部。在每个实验批次和每个项目中分析mxpool
tm
的等分试样，除了为所述批次生成的合并材料外，将该批次的所有数据都标准化到mxpool
tm
，即执行已经实验的合并标准化代谢物比率的额外标准化步骤。
[0326]
提升量化
[0327]
通过各种方法对大型人血浆库(mxpool tm)的代谢组进行量化，并在可能的情况下对结果进行交叉验证。到目前为止，已在该材料中量化了2000多种具有绝对浓度的代谢物。在该项目中测量了mxpool tm材料的多个等分试样，并用作单点校准器以产生代谢物浓度。无法通过该方法量化的代谢物进行半定量分析。质量控制样品在补充部分s1中给出。
[0328]
通过elisa检测血浆中的氨基甲酰磷酸合酶1、线粒体(cps1)
[0329]
使用商业夹心酶联免疫吸附测定法按照制造商的说明测量血浆cps-1浓度(人氨基甲酰磷酸合成酶1，线粒体(cps1)elisa试剂盒货号：rd-cps1-hu,reddot biotech limited,kelowna，加拿大)(补充部分s2)。
[0330]
测量促炎细胞因子的表达
[0331]
根据制造商的说明，v-plex proinflammatory panel 1人试剂盒(meso scale diagnostics,rockville,usa)用于研究一系列细胞因子，即nash和hc患者的ifn-γ、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10、il-12p70、il-13、tnf-α(补充部分s3)。
[0332]
统计分析
[0333]
使用graphpad(graphpad software,inc)进行统计分析。使用kolmogorov-smirnov检验(图形板)测试数据的分布。对于参数分析，使用t检验(2组)或单因素方差分析(one-way anova)与事后tukey多重比较检验(》2组)对这些组进行比较。对于非参数分析，使用mann-whitney(2组)或bonferroni校正的kruskal wallis检验和dunn’s事后检验(》2组)对这些组进行比较。数据表示为平均值
±
平均值的标准误差。
[0334]
使用基于t检验的单变量和包括主成分分析(pca)和偏最小二乘判别分析(pls-da)的多变量分析来分析代谢组学数据。对整个代谢组数据集和要进行统计分析的每个个体组进行单变量统计，确定最小值、最大值、平均值和中值。平均值和中值在对数尺度上计算，然后转换回成非对数尺度。通过计算log10转换数据的标准偏差来评估样品组内的变异性。随后，将标准偏差转换为相对标准偏差(rsd)，该相对标准偏差(rsd)由于从对数尺度的反向变换而不对称(即rsd向上(rsd up)和rsd向下(rsd down)不同)。rsd向下的计算公式为：rsd向下＝1-10^(-sdlog)。单变量分析包括单因素方差分析(anova)和作为事后分析的tukey honest显著性差异(hsd)检验。与多变量分析相比，单一代谢物单变量模型独立考虑每种代谢物。因此，结果不受测量的代谢物数量和其他代谢物的影响。在第一步中，使用单因素方差分析来评估实验组之间的估计样品均值是否彼此不同。该分析表明，潜在的混杂因素性别和年龄对数据有显著影响。因此，将它们包括在单变量统计模型中。因此，anova模
型使用组别、性别和年龄作为因素，其中组别是目的因素。为了确定多组比较中的哪一个产生显著差异，将tukey的hsd检验用作事后分析。tukey hsd检验同时比较所有可能的组均值对，并额外校正i类错误率(tukey,1949)。
[0335]
结果
[0336]
nash晚期纤维化患者的线粒体功能障碍
[0337]
我们在3组中评估了生物能量学：健康对照组(n＝5)、轻度至中度纤维化的nafld患者(f1-f2)和严重纤维化的nafld患者(f3-f4)。
[0338]
严重纤维化患者的pbmc的基础呼吸(图2.1)、atp相关呼吸(图2.2)、最大呼吸(图2.3)和储备能力(图2.4)均降低。在3组中质子泄漏、非线粒体呼吸(图2.5和图2.6)和ecar(图3)是相似的。这些数据表明，在患有严重肝纤维化的患者中存在线粒体功能障碍，表现为所有线粒体参数的显著抑制。
[0339]
基础呼吸是细胞在基线条件下的能量需求，基础呼吸的减少表明了：与轻度纤维化患者(86
±
19,n＝7,p＝0.04，图2.1)相比，在严重纤维化患者(45
±
6,n＝9)中用于满足细胞atp需求的耗氧量受损。我们的研究结果表明，与轻度/中度纤维化(74
±
16,n＝7,p＝0.04)相比，严重纤维化(40
±
5,n＝9)中有助于满足细胞的能量需求的线粒体atp相关呼吸也显著减少(图2)。
[0340]
轻度/中度纤维化(242
±
62,n＝7)患者与f3和f4纤维化患者(106
±
25,n＝9,p≥0.05)之间的最大呼吸显著降低(图2)。与轻度/中度纤维化(184
±
42,n＝7,p＝0.0064)相比，严重纤维化(56
±
16,n＝9)的储备能力也显著降低(图2)。
[0341]
储备能力降低和最大呼吸减少表明晚期纤维化患者对应激的反应受损。
[0342]
nash晚期纤维化患者pbmc的生物能量学健康指数降低
[0343]
生物能量学健康指数(bhi)是衡量身体对应激反应的动态测量。其表明代谢反应功能障碍，并且因为储备能力、与atp相关的呼吸作用较低或解偶联增加，电子传递链(etc)中的任何缺陷都将导致较低的bhi。bhi是通过使用生物能量学数据用darley-usmar小组描述的以下公式计算得出的(chacko et al.,2014)：
[0344]
bhi＝log(atp-相关x储备能力)/(质子泄漏x非线粒体)
[0345]
严重纤维化患者的平均bhi值(2.6
±
0.2,n＝9,p＝0.0092)
[0346]
显著低于轻度/中度纤维化患者(3.7
±
0.3,n＝6)(图4)。
[0347]
代谢转换的缺陷
[0348]
在部分实验(n＝9)中，我们使用细胞能量表型测试试剂盒(agilent technologies)测量基线和应激条件下的线粒体呼吸和糖酵解，以揭示细胞能量代谢的三个关键参数：基线表型、应激表型和代谢潜力。通过同时测量活细胞中两种主要的能量产生途径——线粒体呼吸和糖酵解，我们可以测定轻度/中度纤维化和晚期纤维化nash患者的细胞能量表型。
[0349]
我们的结果表明，在f3/f4纤维化患者中，基础ocr降低，应激ocr和ecar降低，线粒体呼吸的代谢潜力降低(图5)。轻度和严重纤维化的nafld患者的基础ecar和糖酵解代谢潜力没有显著差异。
[0350]
全局代谢组学概略分析显示参与尿素循环的氨基酸改变
[0351]
使用global profiling对hc(n＝9)、患有f1-f2纤维化(n＝10)和f3-f4纤
维化(n＝10)的nafld患者进行全局非靶向代谢组学研究。在单次分析中测定每个样品的代谢物浓度。在本研究中，我们共获得了493种代谢物的数据，其中401种是已知代谢物，92种是未知分析物。此外，还计算了25种代谢物与代谢物的比率和总和，并将其包含在统计分析中。在该三组之间进行单变量分析。
[0352]
将nafld患者中的轻度/中度肝纤维化与严重肝纤维化进行比较，在广泛的非靶向代谢组学数据中，13种代谢物发生了显著变化(p值(f-stats)《0.05和p值(tukey)《0.05)，(表2)。在这13种代谢物中，有5种氨基酸、3种胆碱醚脂质、2种是复合脂肪酸脂质、1种碳水化合物和3种未知代谢物(表2)。
[0353]
表2：在比较轻度/中度纤维化nafld患者与严重纤维化患者时，代谢物发生显著变化
[0354]
否代谢物(p值(f-stats)《0.05和p值(tukey)《0.05)1谷氨酸2未知分析物3胆碱醚脂质(c40:5)4胆碱醚脂质(c42:4)5麦芽糖6未知脂质7瓜氨酸/鸟氨酸8组氨酸9胆碱醚脂质(c44:6)10鞘磷脂(c41:3)11未知脂质12支链氨基酸总和/芳香族氨基酸总和13精氨酸14卵磷脂(c40:1)
[0355]
有趣的是，在轻度/中度纤维化和严重纤维化之间显著增加或减少的所有5种氨基酸都是与线粒体相关的尿素循环的一部分。与轻度纤维化(0.41
±
0.15,n＝10,p＝0.002)相比，严重纤维化(0.26
±
0.08,n＝10)的瓜氨酸/鸟氨酸比率降低。严重纤维化中瓜氨酸较少，鸟氨酸较多。这在低鸟氨酸和高瓜氨酸的轻度/中度纤维化中是逆转的(图6)。瓜氨酸和鸟氨酸是α氨基酸，并且是肝脏中尿素循环的一部分。鸟氨酸向瓜氨酸的转化是尿素循环的限速步骤，与胞质溶胶中发生的其他步骤相比，它仅发生在线粒体中。线粒体功能障碍可导致尿素循环中断，因此所涉及的代谢物(例如鸟氨酸和瓜氨酸)发生变化。与轻度/中度纤维化(61.68
±
15.22,n＝10)相比，严重纤维化(40.4
±
11.32,n＝10,p＝0.002)中尿素循环的另一种成分精氨酸也显著降低(图7)。组氨酸和谷氨酸在严重纤维化中上调(p《0.001)。谷氨酸是细胞代谢中的关键化合物，参与尿素循环和tca循环。具有抗氧化特性的复合醚脂质在严重纤维化中也会减少。麦芽糖是一种二糖，同时是葡萄糖的前体，在f3-f4纤维化中较多(p＝0.01)。
[0356]
hc和nash患者的代谢物的变化
[0357]
还分析了hc和nash患者之间的代谢物。我们的合作者revivemed执行了层次聚类
以删除任何异常值。只有1个样品是异常值(补充材料)。使用他们的平台，与健康和nash患者之间显著失调的代谢物相关的分子网络如表所示。
[0358]
使用偏最小二乘判别分析(pls-da)，可以区分健康对照和nafld患者(图8)。
[0359]
3.6:nash晚期纤维化患者血浆中氨基甲酰磷酸合酶1(cps-1)水平升高
[0360]
为了进一步评估尿素循环代谢物的变化，尤其是线粒体基质中发生的第一限速步骤，我们研究了相应患者血浆中cps-1的表达水平。cps-1存在于线粒体中并导致氨基甲酰磷酸酶的形成，该酶用于将鸟氨酸转化为瓜氨酸。由于我们的代谢组学结果显示，高纤维化患者的瓜氨酸和高鸟氨酸减少，我们测量了cps-1的血浆水平，以分析尿素循环这一关键酶的任何变化。用定量夹心免疫测定技术的elisa试剂盒测量具有不同程度纤维化的nafld患者和健康对照的血浆cps1水平。与hc(n＝9)相比，轻度/中度纤维化(n＝10)和严重纤维化(n＝10)的nash患者血浆中cps-1水平显著升高(hc与f1-f2：p＝0.02和hc与f3-f4：p＝0.0003)(图9)。与f1-f2相比，f3-f4中的cps-1值也显著较高(p＝0.02)。
[0361]
3.7:严重纤维化的nash患者中促炎细胞因子表达增加
[0362]
促炎人细胞因子试剂盒(meso scale diagnostics,rockville,usa)用于研究一系列细胞因子，即ifn-γ、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10、il-12p70、il-13和tnf-α，以了解氧化应激引起的全身炎症反应。有趣的是，与hc相比，患有纤维化的nash患者的促炎细胞因子il-6、il-8和tnf-α显著增加(图10)。与nash患者相比，被认为是抗炎细胞因子的il-13在hc中显著升高。这些结果表明，由线粒体功能障碍引起的全身反应会引起一系列炎症反应，这在细胞因子中也很明显。
[0363]
3.8:nash患者肝纤维化的生物标志物组
[0364]
结合生物能量学和代谢组学数据，我们分析了两个独立的生物标志物组：代谢物表达增加的组和代谢物表达减少的组。
[0365]
代谢物表达增加的组包括测量谷氨酸和血浆cps-1水平。roc曲线分析显示灵敏度为95％，p＝0.0007(f1-f2对比f3-f4)图11-a。
[0366]
另一个代谢物减少的组基于瓜氨酸/鸟氨酸比率、精氨酸和储备能力的生物能量学值的水平。roc曲线分析显示灵敏度为0.94，p＝0.0006(f1-f2对比f3-f4)图11-b。
[0367]
讨论：
[0368]
线粒体的主要功能是通过氧化磷酸化产生atp，但除了产生能量外，线粒体在细胞代谢中还具有许多其他功能(brand and nicholas,2011)。由于线粒体调节代谢和能量稳态，其功能障碍与许多慢性病的病理生理学有关，例如肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病(t2dm)、糖尿病相关并发症(holmstrom et al and cjaka et al)和非酒精性脂肪肝病(nafld)(perez-carreras et al)等。维持正常的线粒体功能对于生存和维持稳定的生物功能和细胞修复至关重要。我们提出肝细胞中的线粒体功能障碍可导致由于肝损伤和氧化损伤引起的全身炎症反应。在肝脏中，这伴随着代谢途径的紊乱，其可以通过测量外周血中不同代谢物的水平来评估。线粒体功能变化导致脂肪酸β氧化受损，导致脂质中间体增加、胰岛素抵抗和活性氧物质增加的恶性循环，从而导致更多的炎症和肝细胞坏死。由于与肝细胞中线粒体功能障碍相关的全局免疫反应，可以在外周细胞中测量这些变化。白细胞和血小板等外周血细胞可以作为不同慢性疾病的替代标志物(a perl et al,cjaka et al,rudkowska,i et al,zharikov and shiva)。
[0369]
在这项研究中，我们首次展示了一种综合方法，用于研究nafld不同纤维化阶段患者的线粒体功能和非靶向代谢组学。我们的目标是通过利用生物能量学和代谢物变化为nafld进展中的非侵入性生物标志物建立新平台。
[0370]
线粒体功能障碍在肝病进展中的作用并不是一个新概念(christie and judah,1954)。已使用电子显微镜在组织学上提示了nash中的线粒体功能障碍，其中观察到肿胀和圆形的肝细胞线粒体(sanyal et al)。然而，通过测量活pbmc中的生物能量学的技术，可以更全面地研究线粒体功能。在我们的研究中，严重(只是不是轻度)纤维化患者的所有线粒体功能参数，即基础呼吸、atp相关呼吸、最大呼吸和储备能力均显著降低。
[0371]
储备能力用于满足增加的能量需求，尤其是在氧化应激期间。由于较低的储备能力、atp相关的呼吸或增加的解偶联，etc中的缺陷可能导致较低的bhi。它是实时生物能量学健康的指标，对于识别线粒体功能进行性恶化具有预后价值。晚期纤维化中线粒体呼吸的代谢潜力也降低了，但有趣的是，轻度/中度纤维化和晚期纤维化之间的糖酵解潜力没有显著差异。
[0372]
线粒体是一种重要的细胞器，因为最重要的代谢途径如tca循环、脂肪酸的β氧化、尿素循环的限速步骤、血红素生物合成、心磷脂合成、醌和类固醇生物合成完全或部分发生在线粒体中。脂肪性肝炎的进展可能涉及过量脂肪酸氧化和肝细胞内增加的氧化应激这两者的直接损伤，这形成了对肝细胞的双重打击或损伤的概念。这造成了一个恶性循环，其中脂肪积累产生etc缺陷，导致未能降低nad和fad，这进一步影响脂肪酸氧化和其他代谢途径(tarek hussein)。
[0373]
我们的非靶向代谢组学方法显示，大约14种代谢物在nash患者的轻度/中度纤维化和严重纤维化之间具有高度显著性(表2)。其中，五种重要的代谢物是氨基酸，它们都与尿素循环或tca相关。严重纤维化的nash患者的瓜氨酸/鸟氨酸比率显著降低(p≥0.05)(图7)。瓜氨酸和鸟氨酸是尿素循环途径中最重要的代谢物，仅位于肝脏中。这是尿素循环中唯一发生在线粒体内的限速步骤，而尿素循环的其余步骤在胞质溶胶中。最近de chiara、francesco等人已经表明尿素循环酶在nash大鼠模型和人类中受到影响，导致高氨血症和尿素合成受损。他们建议将氨作为nash的潜在治疗方法。2019年，canbay和sowa还发表了一项研究，表明l-鸟氨酸l-天冬氨酸(lola)是一种已知的有效降氨剂，可用于治疗nafld，因为它具有增强氨去除、增加抗氧化能力，而且l-精氨酸衍生的no可减弱谷氨酰胺和谷胱甘肽引起的脂质过氧化并改善肝脏微循环(canbay and sowa)。k.l.thomsen等人还提出nash中的高氨血症导致纤维化进展，并假设治疗氨可能是预防nash患者纤维化进展的潜在目标(k.l thomsen et al)。
[0374]
在患有严重纤维化的nash患者中，另一种显著减少的代谢物是精氨酸，它也是尿素循环的一部分。精氨酸水解形成尿素和鸟氨酸。精氨酸的形成减少会导致体内尿素产生减少和氨增加。因此，尿素循环的缺陷也会影响作为细胞呼吸的中心驱动因素的tca，反之亦然。在患有严重纤维化的nash患者中，另一种氨基酸
‑‑
谷氨酸含量显著升高。谷氨酸脱氢酶(gdh)是一种酶，也仅存在于线粒体中，是合成尿素所必需的，可将谷氨酸转化为α-酮戊二酸，反之亦然。
[0375]
为了进一步探索参与尿素循环中涉及的代谢物作为nash纤维化进展的潜在生物标志物的作用，我们通过elisa测量了同一组nash患者和hc血浆中的cps-1水平。cps1是肝
线粒体中最丰富的蛋白质。我们的结果显示，与轻度/中度纤维化和hc相比，严重纤维化的nash患者血浆中cps-1的水平非常显著。与hc相比，轻度/中度纤维化的nash患者的cps-1也显著升高。以前在脓毒症动物模型的血清或血浆和人类脓毒症患者的血浆中发现了cps1，这表明它可能作为检测脓毒症条件下肝脏线粒体损伤的血清标志物(crouser et al；struck et al)。另一项研究还表明，肝细胞选择性和最丰富的线粒体基质蛋白cps1是肝细胞死亡和损伤的凋亡和坏死形式的标志物，并在急性肝损伤后释放在循环中(sujith et al)。el-sheikh等人最近表明，在hcv患者的中度和严重纤维化中，组织和血清cps-1显著相关，并且在这些患者中，与中度纤维化患者相比，血清cps1水平显著升高而线粒体计数降低。
[0376]
与hc相比，患有纤维化的nash患者的促炎细胞因子il-6、il-8和tnf-α显著增加，表明线粒体功能障碍伴随着全身免疫反应，利用测量线粒体生物能量学和代谢组学的联合方法，我们可以制定nash纤维化进展的新的生物标志物。我们提出了基于生物能量学的非侵入性生物标志物平台(参与尿素循环的代谢物，尤其是血浆中的瓜氨酸/鸟氨酸比率、精氨酸、谷氨酸和cps-1水平)用于识别nash患者的纤维化程度。
[0377]
教导了相应肝组织中生物能量学的确认性测量以确认肝细胞的变化伴随着免疫细胞的全身变化，其可用作肝纤维化的非侵入性生物标志物。
[0378]
总之，这是第一项显示外周细胞中线粒体功能变化并伴有尿素循环代谢物变化的研究，这些变化可以清楚地区分nafld患者的轻度和严重纤维化。
[0379]
实例2——敏感性和特异性的证明
[0380]
结合生物能量学和代谢组学数据，我们分析了两个独立的生物标志物组：代谢物表达增加的组和代谢物表达减少的组。
[0381]
在此实例中，代谢物表达增加的组包括测量谷氨酸和血浆cps-＝1水平。roc曲线分析显示灵敏度为95％，p＝0.0007(f1-f2对比f3-f4)图12(左图)。
[0382]
在此实例中，代谢物减少的组基于瓜氨酸/鸟氨酸比率、精氨酸和储备能力的生物能量学值的水平。roc曲线分析显示灵敏度为0.94，p＝0.0006(f1-f2对比f3-f4)图12(右图)。
[0383]
更详细地，在图12的图表中，每个图中只有一条实线，显示了曲线下面积(auc)，其显示的是灵敏度和特异性之间的关系。因此，从图12可以看出，roc曲线量化了本发明方法区分患有疾病(晚期/严重纤维化，即f3/f4)的个体和没有疾病的个体(轻度或中度，即f1/f2)的整体能力。曲线越靠近左侧边界，其次越靠近roc空间的顶部边界，测试越准确。
[0384]
图12(左)和12(右)：在f1-f2 nafld组与f3-f4 nafld组中使用谷氨酸 cps-1的roc曲线分析显示灵敏度为0.95和p＝0.0007，而f1-f2 nafld组与f3-f4 nafld组中的瓜氨酸/鸟氨酸 精氨酸 储备能力显示灵敏度为0.94和p＝0.0006。
[0385]
实例3a
–
临床应用(增加的组)(值随着晚期纤维化增加)
[0386]
在此实例中，我们将感目标受试者的值与患有轻度至中度纤维化(f1/f2纤维化)的比较/参考对象(即匹配对象)进行比较。
[0387]
在这个例子中，具有轻度至中度纤维化的受试者患有轻度纤维化。
[0388]
在这个例子中，目标受试者患有f4纤维化。
[0389]
1)一种方法，其包括：
[0390]
a)提供受试者的血液样品
[0391]
b)测定所述样品中cps-1的表达水平
[0392]
在该实例中，cps-值＝5.8
[0393]
c)将(b)的cps-1表达水平与从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品测定的cps-1表达水平进行比较
[0394]
在该实例中，比较来自轻度至中度纤维化受试者的cps值＝5.8至cps值＝1.2
[0395]
d)测定所述样品中的谷氨酸水平
[0396]
在该实例中，谷氨酸值＝309
[0397]
e)将(d)的谷氨酸水平与从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的谷氨酸水平进行比较
[0398]
在该实例中，比较来自轻度至中度纤维化受试者的谷氨酸值＝309至谷氨酸值＝78
[0399]
f)其中如果(b)的cps-1表达水平高于从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品测定的cps-1表达水平，和(d)的谷氨酸水平高于从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的谷氨酸水平，那么推断该受试者患有晚期或严重(f3/f4)肝纤维化的可能性增加。
[0400]
在该实例中，该比较显示目标受试者患有晚期或严重(f3/f4)肝纤维化的可能性增加。
[0401]
在该实例中，目标受试者患有f4纤维化。这显示了本发明的方法在运行中。
[0402]
可选的附加步骤
[0403]
晚期纤维化患者：谷氨酸和cps分数的平均值＝157
[0404]
轻度纤维化患者：谷氨酸和cps分数的平均值＝39
[0405]
平均值的比较表明目标受试者有很大的增加。
[0406]
这提供了增强的信心，即目标受试者患有晚期或严重(f3/f4)肝纤维化的可能性增加。
[0407]
实例3b
–
临床应用(减少的组)(值随着晚期纤维化增加)
[0408]
在此实例中，我们将感目标受试者的值与患有轻度至中度纤维化(f1/f2纤维化)的比较/参考对象(即匹配对象)进行比较。
[0409]
在这个例子中，具有轻度至中度纤维化的受试者患有轻度纤维化。
[0410]
在这个例子中，目标受试者患有f4纤维化。
[0411]
2)一种方法，其包括：
[0412]
a)提供受试者的血液样品
[0413]
b)测定所述样品中精氨酸的水平
[0414]
在该实例中，精氨酸值＝39
[0415]
c)将(b)的精氨酸水平与从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的精氨酸水平进行比较
[0416]
在该实例中，比较来自轻度至中度纤维化受试者的精氨酸值＝39至精氨酸值＝55
[0417]
d)测定所述样品中的瓜氨酸/鸟氨酸比率
[0418]
在该实例中，瓜氨酸/鸟氨酸比率＝0.3
[0419]
e)将(d)的瓜氨酸/鸟氨酸比率与从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的瓜氨酸/鸟氨酸比率进行比较
[0420]
在该实例中，比较来自轻度至中度纤维化受试者的瓜氨酸/鸟氨酸比率值＝0.3至瓜氨酸/鸟氨酸比率值＝0.5
[0421]
f)测定所述样品中的储备能力
[0422]
在该实例中，储备能力值＝30
[0423]
g)将(f)的储备能力与从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的储备能力进行比较
[0424]
在该实例中，比较来自轻度至中度纤维化受试者的储备能力值＝30至储备能力值＝74
[0425]
h)其中如果(b)的精氨酸水平低于从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品测定的精氨酸水平，和(d)的瓜氨酸/鸟氨酸比率低于从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的瓜氨酸/鸟氨酸比率，和(f)的储备能力低于从患有轻度至中度肝纤维化的受试者的血液样品中测定的储备能力，那么推断该受试者患有晚期或严重(f3/f4)肝纤维化的可能性增加。
[0426]
在该实例中，该比较显示目标受试者患有晚期或严重(f3/f4)肝纤维化的可能性增加。
[0427]
在该实例中，目标受试者患有f4纤维化。这显示了本发明的方法在运行中。
[0428]
可选的附加步骤
[0429]
晚期纤维化患者：精氨酸和瓜氨酸/鸟氨酸比率和储备能力得分的平均值＝43
[0430]
轻度纤维化患者：精氨酸和瓜氨酸/鸟氨酸比率和储备能力得分的平均值＝23
[0431]
平均值的比较表明目标受试者有很大的减少。
[0432]
这提供了增强的信心，即目标受试者患有晚期或严重(f3/f4)肝纤维化的可能性增加。
[0433]
实例4-临床应用
[0434]
在大量受试者中研究了本文教导的生物标志物的值。
[0435]
各组群的平均值如下表所示
[0436]
生物标志物f1-f2组群f3-f4组群谷氨酸64μmol/l137μmol/lcps12.7ng/ml4.3ng/ml
[0437]
生物标志物f1-f2组群f3-f4组群精氨酸62μmol/l40μmol/l瓜氨酸/鸟氨酸比率0.410.2储备能力185pmol/min56pmol/min
[0438]
f1-f2组群的平均值用作比较值(即，用于与来自目标受试者的值进行比较，从而有利地避免在每次执行该方法时必须处理f1/f2受试者的额外样品/额外测量值)。
[0439]
尽管在此参照附图详细公开了本发明的说明性实施例，但是应当理解，本发明不限于所示出的精确实施例，并且本领域技术人员可以在没有背离如所附权利要求及其等同物所定义的本发明的范围。