一种具有类酶活性的二维Cu-CAT纳米片及其制备方法与应用

一种具有类酶活性的二维cu-cat纳米片及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于纳米新材料技术领域，具体涉及一种具有类酶活性的二维cu-cat纳米片及其制备方法与应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病是一种常见的慢性神经退行性疾病，以记忆和学习能力的进行性衰退为特征，其发病机制通常被认为是脑内淀粉样-β肽(aβ)的产生和积累造成的。乙酰胆碱酯酶(ache)是哺乳动物中枢神经系统中最重要的酶之一。ache存在时，aβ肽可沉积形成淀粉样斑块和神经纤维缠结。人们普遍认为ache的异常表达与阿尔茨海默病高度相关，抑制ache活性可有效控制阿尔茨海默病的进展。因此，ache被认为是阿尔茨海默病最重要的生物标志物之一。建立简便、灵敏的ache检测方法对早期确诊、评估阿尔茨海默病进展具有重要意义。此外，由于新斯的明、他克林等治疗阿尔茨海默病的化学药物有一定的副作用，因此以商品化的副作用较小的中药石杉碱甲(ha)为例，对ache的抑制剂进行了检测，并且选取几种中药来筛选ache的抑制剂用于阿尔茨海默病治疗也非常有意义。
3.近年来，人们探索了多种监测ache活性的方法，包括化学发光、电化学、比色ellman和荧光测定。然而，这些方法仍然存在不可避免的缺陷，如检测灵敏度低、假阳性效应、测试时间长、仪器复杂等，这显然限制了这些方法的实际应用。目前，单信号传输模式的检测方法已经越来越难以满足研究人员的需求，而同时输出化学变化和视觉信号作为仪器的定量信号，成为纳米生物传感器发展的有利方向。比色法具有操作简单、反应迅速等优点，可用于现场肉眼检测。
4.基于酶活性调控的纳米生物传感器由于具有高鲁棒性、灵敏度和选择性等内在优势，已成为监测目标酶的热点。纳米酶作为一种具有类酶活性的纳米材料，因其制备成本低、可灵活设计、结构多样等独特特点而受到越来越多的关注，具有很好的实际应用前景。然而，我们发现催化剂上不同的反应位点具有不同的催化活性，催化剂应该设计成具有更多暴露在边缘的催化位点，这些位点具有更高的催化活性。为此，发展二维(2d)纳米材料是提高纳米酶活性的有效策略，二维mofs由于其超薄厚度和大量活性位点的结构优势，被广泛应用于催化、生物传感和生物医学等领域。因此，利用二维mof纳米片构建灵敏的比色传感器引起了广泛的研究兴趣。


技术实现要素：

5.针对现阶段监测ache活性和其抑制剂ha存在的问题，本技术提供了一种具有类酶活性的二维cu-cat纳米片，该纳米片为二维(2d)纳米材料，具有活性位点多，灵敏度高，特异性好等优点，有利于产生比色信号；同时还提供了该纳米片的应用，用于快速检测ache及其抑制剂的比色生物传感器，对ache的检测选择性好，检测限低；同时可以检测或筛选ache抑制剂。
6.本发明的技术方案如下：
一种具有类酶活性的二维cu-cat纳米片，包括以下重量份数的原料：cu(oac)2、十二烷基硫酸钠、2,3,6,7,10,11-六羟基三苯水合物、葡聚糖。
7.优先地，其特征在于，所述的cu(oac)2与2,3,6,7,10,11-六羟基三苯水合物的摩尔比为：1.5:1。
8.上述具有类酶活性的二维cu-cat纳米片的制备方法，包括以下步骤：(1) cu-cat的制备： cu(oac)2、十二烷基硫酸钠溶于水中，加入碱液；再加入2,3,6,7,10,11-六羟基三苯水合物；反应，静置；收集沉淀物，洗涤、离心，干燥；得到cu-cat； (2) cu-cat纳米片的制备：将步骤（1）制备的cu-cat和葡聚糖溶液混合，反应，离心去除大块cu-cat；上清液离心，得到二维cu-cat nss。
9.进一步地，所述步骤（1）反应的条件为：50℃下超声0.5-3 h；静置的条件为：室温下5-15h。
10.进一步地，所述步骤（1）洗涤的过程为在0-10℃下，超声用乙醇-水溶液洗涤3次以上。
11.进一步地，所述步骤（2）反应条件为超声16h以上；离心的条件为：5000-6000 rpm下离心8-15分钟；上清液离心的条件为：13000-15000 rpm离心10-20 min。
12.本技术的另一个目的，保护一种比色生物传感器，包括紫外-可见分光光度计的单色器、样品池、检测器，在样品池比色皿里加入上述的制备方法制备得到的二维cu-cat nss。
13.上述比色生物传感器的应用，应用于对ache及其抑制物的灵敏检测。
14.上述比色生物传感器检测ache及其抑制物的方法，包括以下步骤：s1对ache的检测：将乙酰硫代胆碱与乙酰胆碱酯酶ache和磷酸盐缓冲盐水混合，孵育；依次加入naac-hac缓冲液、cu-cat nss、h2o2和tmb；然后在室温下孵育，记录652nm处的紫外可见吸收信号对ache进行检测；s2对ache抑制物的检测：将乙酰硫代胆碱与乙酰胆碱酯酶ache、ache抑制物和磷酸盐缓冲盐水混合，孵育；依次加入naac-hac缓冲液、cu-cat nss 、h2o2和tmb；然后在室温下孵育，记录652nm处的紫外可见吸收信号对ache进行检测。
15.本发明所述的酶抑制剂是一种可以抑制生物体内与某种疾病有关的专一酶活性，从而获得疗效的物质。本发明中二维cu-cat nss的纳米结构为纳米片，与三维纳米材料相比，具有超薄厚度和丰富的催化活性位点，从而提高了催化氧化tmb的效率进而增强比色生物传感器的信号。
16.本发明的有益效果（1）本发明制备的二维cu-cat nss具有活性位点丰富，选择性好，催化效率高等优点，有利于产生比色信号。
17.（2）本发明所制备的新型的用于快速检测ache的比色生物传感器，对ache的检测灵敏度高，检测限较低，为0.01 mu ml-1
。
18.（3）以石杉碱甲为例，本发明的方法可以用于检测或筛选ache抑制剂，同时也可用于检测中药中有没有跟石杉碱甲类似作用的ache抑制剂，即从传统中草药中发现阿尔茨海默病的药物具有很高的灵敏度和特异性。
19.（4）本发明显示了二维 mofs的开发潜力，构建的生物传感器为阿尔茨海默病新药
的开发提供了新的见解。
附图说明
20.图1为本发明实施例1中所制备的大块cu-cat剥离为二维片状cu-cat nss的过程及其比色生物传感示意图；图2为cu-cat (a)和cu-cat nss (b)的hrtem图像；(c) cu-cat nss的sem图像和相应的c, cu和o的eds映射图；图3为(a) cu-cat和cu-cat nss的xrd谱图；(b) cu-cat和cu-cat nss的zeta电位；(c) cu-cat nss的cu 2p高分辨率xps光谱和(d) cu-cat nss的lmm光谱的峰拟合；图4为(a) cu-cat nss/tmb/h2o2体系分别加入空白、atch、ache和atch/ache的紫外可见吸收光谱； (b) cu-cat nss/tmb/h2o2体系中加入0.5 mm atch和不同浓度ache: 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mu ml-1
的紫外可见吸收光谱和图像(插图)；(c) δa在652 nm处与ache浓度的关系图; 插图:ache线性拟合图；(d)不同浓度ha对ache的抑制率(ie%)。ie% = 100 (a
i-a)/(a
0-a)
×
100%，其中a为有ache的体系的吸光度，a0为无ache和ha的体系的吸光度，ai为有ha和ache的体系的吸光度；图5为不同中草药水提取物(a)和乙醇提取物(b)对乙酰胆碱酯酶的抑制率(ie%)；(c)对应的中草药图像。
具体实施方式
21.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
22.实施例1一种具有类酶活性的二维cu-cat纳米片的制备方法，包括以下步骤：（1）在250 ml锥形瓶中加入cu(oac)
2 (84.6 mg, 0.465 mmol)、十二烷基硫酸钠(sds) (50 mg, 0.17 mmol)和50 ml超纯水。然后，在上述溶液中加入50 ml naoh溶液(50 mg, 1.25 mmol)，然后加入100 mg (0.31 mmol) 2,3,6,7,10,11-六羟基三苯水合物(hhtp)。在50℃下超声0.5 h，然后在25℃下静置10 h。收集沉淀物，在超声冰浴中用水和乙醇洗涤3次，每次0.5 h，离心得到沉淀，在60℃的烘箱中干燥得到固体粉末。
23.（2）将步骤（1）制备的0.3 g大块cu-cat和4.8 ml葡聚糖溶液(2.0 g l-1
)混合，然后超声16小时。得到的溶液在5500 rpm下离心10分钟，以去除大块cu-cat。上清液在13500 rpm离心15 min，得到二维cu-cat nss。
24.将沉淀分散在2.7 ml水中进行进一步实验。
25.实施例2在ph=4 (1.5 ml, 200 mm)的缓冲溶液中加入实施例1制备的cu-cat nss (0.3 ml, 400 μg ml-1
)，然后加入tmb (0.6 ml, 1 mm)和h2o
2 (0.6 ml, 15 mm)。反应20 min后，用紫外可见分光光度计记录体系的紫外可见吸收光谱，测定在ph=4下纳米酶的类过氧化物酶活性。
26.实施例3
0.01696，相关系数(r2)为0.99458。根据s/n = 3计算出传感器的检测限(lod)低至0.01 mu ml-1 (n = 5)。此外，该传感器可用于筛选阿尔茨海默病的抑制剂ha，ha是治疗阿尔茨海默病的有效药物。ha存在时，ache活性受到抑制，导致tch降低。因此，cu-cat nss保持了相应的催化活性，导致信号从tmb恢复到ox-tmb。在atch/tmb/h2o2体系中，随着ha浓度的增加，652 nm处的紫外可见吸收强度增加(图4d)。也就是说，ha抑制ache活性，阻断atch分解产生tch，从而恢复cu-cat nss过氧化物酶样活性。随着ha浓度在0 ~ 200 nm范围内的增加，ache的缓蚀率(ie%)呈线性增加。线性方程为ie% = (1.14389c 14.74906)
×
100%，相关系数(r2)为0.98142。平均ic
50
值(半最大抑制浓度)为30.81 nm。结果表明，该方法可以检测或筛选ache抑制剂。
32.如图5a所示，中草药因疗效显著、副作用小而成为阿尔茨海默病治疗的首选药物。因此，从中药中筛选ache抑制剂对阿尔茨海默病药物创新具有重要意义。以川芎(lw)、麦冬(dlt)、刺五加(as)、延胡索(rc)、枸杞(lcm)、肉苁蓉(dc)、赤芍(prr)、丹参(sm) 8种中药材为研究对象。分别用水和乙醇制备中草药提取物。然后，利用该传感平台分别对水提取物和乙醇提取物进行紫外可见吸收光谱和可视化检测。如图5a和b所示，as和rc的水和乙醇提取物对ache的抑制效率都较高。这可能是由于as保护大脑中的多巴胺能神经元免受细胞凋亡蛋白酶诱导的凋亡。此外，rc含有大量的紫堇碱，紫堇碱是一种抗ache的生物碱。对应的草本图像如图5c所示。这些结果表明，本研究开发的传感器是检测和筛选乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的有效生物传感平台。
33.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。