用于表达所关注基因和/或调控信号传导通路的纳米颗粒的制作方法

用于表达所关注基因和/或调控信号传导通路的纳米颗粒
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年1月10日提交的美国临时申请第62/959,790号和2020年1月13日提交的美国临时申请第62/960626号的权益，其中每件申请都明确地以全文引用的方式并入本文。
技术领域
3.本公开涉及组合物及其使用和制造的相关方法，所述组合物使用生物活性分子功能化的纳米颗粒控制基因产物的基因表达和活性，所述生物活性分子包括但不限于肽、蛋白质、小rna分子(例如小干扰rna(sirna))和较长的rna分子(如信使rna(mrna))。


背景技术：

4.细胞正常增殖、迁移和分化为各种细胞类型的能力对于胚胎发生和成熟细胞(包括但不限于心血管系统、免疫系统、肠道系统和脑系统的细胞)的功能至关重要。由于获得性或遗传性突变，细胞的这种功能能力在各种病理条件下会发生改变，这可能激活不同细胞内信号传导通路和过度表达各种基因(例如致癌基因)，每一种都可能造成恶性细胞的恶性转化、过度增殖和扩增。
5.此外，细胞正常功能所需的一些重要基因(例如肿瘤抑制基因)表达的异常缺失也可能引发过度增殖，这种功能缺失可能造成不同肿瘤和癌症的恶性转化和发展。
6.此外，在病毒感染期间，新基因和/或改变的基因(病毒来源基因或由病毒dna整合到宿主细胞基因组中触发或从病毒rna表达的新生突变的产物)在细胞中表达并有助于病毒复制，这可能导致各种严重的，有时甚至危及生命的并发症。尽管免疫系统通常可以有效地对抗某些病毒感染，但疫苗接种是世界范围内常用以使生物体更有效地抵抗和对抗感染的方法。然而，疫苗接种通常基于使用部分或完全灭活的含dna的病毒。每次将外源性dna与细胞一起使用时，此类dna都会整合到细胞基因组中，并可能引发肿瘤形成和/或其他有害后果。因此，使用保持细胞基因组完全不变的蛋白质或mrna的非dna疫苗接种代表了更优选的疫苗接种途径。
7.最近的科学发展提出了各种方法来控制类致癌基因分子的异常表达，包括施用外源性小分子抑制剂、小干扰rna(sirna)、mirna或信使rna(mrna)。此外，病毒基因特异性mrna可用于疫苗接种，以诱导病毒基因产物的表达，并训练免疫系统细胞产生抗病毒抗体。然而，有效使用sirna、mirna、mrna和其他基于rna分子的主要障碍是缺少能够将sirna穿过细胞膜转运到各种人体细胞细胞质的高效递送媒介物。同样的问题也阻碍了基因的恢复，在恶性转化和肿瘤形成过程中基因的表达会丢失。
8.因此，尽管本领域已取得进步，但仍然需要一种有效的方法来将生物活性分子单独或以各种组合形式递送到细胞内部以有效诱导调节基因表达。例如，仍然需要靶向一种或更多种不同的异常信号转导通路和/或诱导所关注靶基因在各种细胞中的表达，同时避免对染色体结构造成损害。本公开实现了这些方面并满足了相关的需要。


技术实现要素：

9.在一些方面，本公开提供了将蛋白质、肽、sirna、微rna和mrna与生物相容性纳米颗粒连接以调节细胞功能的功能化和制造方法。在一些方面，本发明涉及所述多功能化的生物相容性纳米颗粒本身。在另一些实施方案中，本公开涉及使用所公开的多功能化生物相容性纳米颗粒的方法。在其他方面，本公开提供了所述多功能化纳米颗粒，以及包含其的组合物、试剂盒和细胞。
10.当结合附图参考以下详细的说明书时，本公开的这些方面和其他方面对于本领域普通技术人员将变得更加显而易见。
附图说明
11.当结合附图参考以下详细的说明书时，本发明的前述方面和许多附带优势将变得更容易让人明白，因为它们变得更好理解，其中：
12.图1显示人类原代成纤维细胞的两张照片，表明了本公开示例性多功能化纳米颗粒对于在原代细胞中基因特异性sirna分子的细胞质递送非常有效。左图示出了用不含sirna纳米颗粒处理的对照人类原代成纤维细胞。右图示出了用fitc标记纳米颗粒处理的人类原代成纤维细胞，然后进行大量洗涤以去除未结合的纳米颗粒，这些纳米颗粒用靶向肿瘤抑制基因pt10的生物活性肽和sirna构建体进行多功能化。细胞核用dapi染色。标示的荧光(参见显示示例性荧光信号的箭头)表明了在细胞质中存在pten特异性sirna功能化的纳米颗粒，将靶pt10基因表达敲低60％，这通过qrt-pcr进行测定。
13.图2显示人类原代成纤维细胞的两张照片，表明了本公开示例性多功能化纳米颗粒对于在细胞中递送和翻译mrna非常有效。左图显示了暴露于不含mrna纳米颗粒的对照人类原代成纤维细胞。右图显示了用编码红色mcherry蛋白的未加帽mrna功能化的np处理的细胞。在处理后26小时评估通过红色荧光(参见显示示例性荧光信号的箭头)测定的mcherry mrna表达。标示的荧光证实了由所述多功能化纳米颗粒递送的mrna(包括未加帽mrna)，可以成功地有效翻译mrna有效载荷。
具体实施方式
14.本公开的基础是发明人对基于纳米颗粒的有效递送机制的开发，该递送机制有效地促进将一种或更多种不同来源的生物活性分子(包括sirna、mirna、mrna、肽和蛋白质)非整合递送到各种细胞类型中。rna构建体表现出高功能性，但仍使细胞基因组保持不变。该平台可以与多种生物活性有效载荷复用，以同时靶向例如多种通路，并提供高效调控靶基因表达的新方法。该平台可适用于多种应用，包括实施强化疫苗接种、促进端粒延长、有效治疗人体恶性肿瘤、控制引起各种病理状况的基因表达等。
15.为了在细胞内递送生物活性分子，本公开提供了一种基于组合物的通用平台，所述组合物包括细胞膜穿透纳米颗粒，其具有共价连接的各种来源生物活性分子。为此，本公开在本文中提出了一种新功能化方法，确保蛋白质、肽和不同rna与纳米颗粒的共价连接。本发明的修饰的细胞渗透性纳米颗粒提供了一种通用机制，用于同时向细胞内递送生物活性分子以调控细胞功能和/或使细胞功能正常化，该机制随后可用于研究和开发、药物筛选和治疗应用以改善人体细胞或器官功能和/或人体对感染的抵抗力。
16.根据前述内容，一方面，本公开提供了一种组合物，被构造成将rna有效载荷递送至细胞内部。所述组合物包含多功能化纳米颗粒核，其用以下进行功能化：
17.至少一个rna分子，通过接头附着至所述固体纳米颗粒核，
18.至少一种带正电荷的细胞穿透肽(cpp)，附着至所述固体纳米颗粒核；其中所述功能化纳米颗粒基本上是不带电荷、带负电荷或带正电荷的。
19.所述纳米颗粒核优选是生物相容的，包括例如超顺磁性氧化铁纳米颗粒或金纳米颗粒或聚合生物可降解纳米颗粒，类似于先前在科学文献中描述的纳米颗粒(勒温(lewin)m等人,《自然生物技术》(nat.biotech.)2000,18,410-414；申(shen)t等人,《医学科学中的磁共振》(magn.reson.med.)1993,29,599
–
604；韦斯莱德(weissleder),r等人.《美国放射学期刊》(american journal of roentgeneology)1989,152,167-173)。此类纳米颗粒可用于，例如在临床环境中进行骨髓细胞、淋巴结、脾脏和肝脏磁共振成像(因为潜在用途之一是在细胞内标记靶细胞并在体内成像它们的路径，就像通过在细胞外标记和成像一样)(参见例如，申等人,《医学科学中的磁共振》29,599(1993)；哈里辛哈尼(harisinghani)等人,《美国放射学期刊》.172,1347(1999))。例如，尺寸小于50nm且含有交联细胞膜渗透性tat衍生肽的磁性氧化铁纳米颗粒有效内化到造血和神经祖细胞中，每个细胞的超顺磁性铁纳米颗粒量至多30pg(勒温等人.,《自然生物技术》.18,410(2000))。此外，所述纳米颗粒掺入不影响骨髓衍生的cd34 原始祖细胞的增殖和分化特征或细胞活性(迈特
·
勒温(maite lewin)等人,《自然生物技术》18,410(2000))。这些纳米颗粒可用于体内表达几乎任何所关注的基因，而无论基因表达在肿瘤发生过程中丢失还是需要接种疫苗。
20.在一些实施方案中，所述纳米颗粒核是实心的。例如，所述固体纳米颗粒核可以是金属或非金属的，包括但不限于壳聚糖基纳米颗粒或羟基磷灰石基纳米颗粒。本公开所涵盖的示例性金属纳米颗粒包括磁性纳米颗粒和超顺磁性铁基银钛纳米颗粒。例如，所述纳米颗粒核可以是或包含铁(例如，氧化铁)。另一个示例性纳米颗粒核是或包含金。
21.在一些实施方案中，所述纳米颗粒核包含生物相容性聚合物。例如，聚合物涂层(例如葡聚糖多糖)，可以具有x/y功能性基团，各种长度的功能元件或接头可以附着至其上。所述接头进而共价附着功能性基团，例如rna分子，和/或任选的cpp和/或带正电荷的部分。所述接头还可以构造成通过它们的x/y功能性基团附着至例如其他蛋白质、微rna和/或肽(或其他小分子)。用于交联的示例性功能性基团被更详细地加以描述并且被本公开的这个方面所涵盖。
22.在一些实施方案中，所述纳米颗粒核是无金属或实心核结构的聚合物聚集体。相反，所述聚合物聚集体包裹被困在内部的生物活性分子，这些分子会随着时间的推移而脱落，从而作用持久。此类聚合物纳米颗粒是已知的并且可由本领域普通技术人员加以构造从而如本文所述进行多功能化。
23.在一些实施方案中，所述纳米颗粒核是固体纳米颗粒核，其直径尺寸为50nm或更小，例如约5nm至约50nm、约25nm至约45nm、约30nm至约45nm、约35nm至约45nm、约40nm至约45nm、约40nm至约50nm、约20nm至约30nm或其中的其他子范围。在示例性实施方案中，所述纳米颗粒核的直径为约5nm、约10nm、约20nm、约23nm、约25nm、约28nm、约30nm、约33nm、约35nm、约38nm、约40nm、约45nm和约50nm。
24.如上所述，基于纳米颗粒的组合物充当细胞内递送生物活性分子的优良媒介物，
所述生物活性分子可适用于例如靶向细胞内事件并调节各种所关注细胞类型的细胞功能和性质。因此，该方面的组合物提供了多功能化以携带一种或更多种功能有效载荷的基于纳米颗粒的组合物。如所指出的，所述纳米颗粒核至少用rna分子有效载荷进行了功能化。所述rna分子可以是短干扰rna(sirna)、微rna(mirna)或编码rna(如信使rna(mrna))。
25.在一些实施方案中，所述rna分子是未加帽mrna分子。信使rna(mrna)通常是指含有编码所关注肽或多肽的序列的单链rna分子。在一些实施方案中，所述mrna是“成熟”mrna，意味着它缺乏散布在编码外显子之间的内含子序列。mrna还可以具有通常发生在真核细胞中的额外修饰。例如，所述mrna可以具有5'帽结构，包含添加的rna 7-甲基鸟苷帽。这是一种修饰的鸟嘌呤核苷酸，通常通过5'-5'-三磷酸键连接。所述5'帽结构可以通过防止rna酶降解来规范地保持分子的稳定性。此外，所述mrna可以在3'端包含聚腺苷酸尾(polyadenylyl tail)。“poly(a)”尾还通过防止外切核酸酶降解来提高mrna的稳定性。
26.在一些实施方案中，所述mrna是未加帽mrna分子。如本文所用，“未加帽”是指缺乏通过所述5'-5'-三磷酸键连接的典型5'帽结构。在这样的实施方案中，所述mrna的未加帽5'端与接头结合，所述接头又与所述纳米颗粒核结构结合。发现如果所述mrna分子在其5'端被束缚在所述纳米颗粒上，它会保持稳定。不受任何特定理论的束缚，有人认为存在具有本文所述其他功能性基团的纳米颗粒会保护mrna的这部分免于被细胞中存在的核酸酶降解。
27.在其他实施方案中，所述rna分子是加帽mrna分子，其中所述加帽mrna分子的3'端与所述第一接头共价结合。所述第一接头又与所述纳米颗粒核的表面结合。
28.不管加帽或未加帽的构型如何，根据本领域已知蛋白质和编码序列的大量知识，可以将所述mrna分子构造成编码所关注肽或多肽(例如，功能性蛋白质)。例如，所述mrna分子可以编码所关注抗原、所关注酶(例如端粒酶)或可检测的标志物，以及其他所需肽和多肽。
29.在一些实施方案中，所述组合物包含至少两个附着至所述固体纳米颗粒核的rna分子。每个所述rna分子可以通过接头独立附着，所述接头可以相同或不同。所述rna分子可以相同或不同，其中至少一个所述rna分子是未加帽mrna分子，所述未加帽mrna分子的5'端共价结合至所述第一接头，所述第一接头又共价附着至所述纳米颗粒核。
30.如所指出的，所述rna分子通过第一接头附着至所述纳米颗粒核。所述接头可以是线性接头或分支接头。分支接头通过单触点共价结合到所述纳米颗粒核并且具有源自一个或更多个分支点的多个分支。通常，所述多个分支的至少两个附着至单独的rna分子。
31.在一些实施方案中，所述接头由一个或更多个接头组成，每个接头的长度为至少6埃，例如至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多埃。不受任何特定理论的束缚，由这种长度接头提供的距离使灵活性和距所述纳米颗粒核的距离足以实现核糖体接近mrna有效负载，从而将mrna翻译成肽或多肽产物。
32.在一些实施方案中，所述第一接头是可切割接头，例如构造成在细胞内被切割的接头，从而从所述纳米颗粒核释放有效负载分子。此类释放可以在mrna模板上形成核糖体复合物以促进翻译。在一些实施方案中，所述可切割接头包含二硫键。
33.将功能性基团附着到纳米颗粒的合适接头基团和相关方法是已知的。参见例如，美国专利第9675708号，以全文引用的方式并入本文。可用于将所述rna分子(和可能的其他
功能性基团)交联至所述纳米颗粒的功能性接头基团说明性、非限制性实例包括：
[0034]-nh2(例如，赖氨酸，-nh2)；
[0035]-sh；
[0036]-cooh；
[0037]-nh-c(nh)(nh2)；
[0038]
糖类；
[0039]-羟基(oh)；和
[0040]
通过接头上叠氮基的光化学附着。
[0041]
交联试剂的说明性、非限制性实例包括：
[0042]
smcc[4-(n-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯]，包括磺基-smcc，它是用于交联氨基和硫醇基的磺基琥珀酰亚胺基衍生物；
[0043]
lc-smcc(长链smcc)，包括磺基-lc-smcc；
[0044]
spdp[n-琥珀酰亚胺基-3-(吡啶基二硫代)-丙酸酯]，包括磺基-spdp，它与胺反应并提供硫醇基；
[0045]
lc-spdp(长链spdp)，包括磺基-lc-spdp；
[0046]
edc[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐]，它是一种用于连接-cooh基团和-nh2基团的试剂；
[0047]
sm(peg)n，其中n＝1,2,3,4
…
24个二醇单元，包括磺基-sm(peg)n衍生物；
[0048]
spdp(peg)n，其中n＝1,2,3,4
…
12个二醇单元，包括磺基-spdp(peg)n衍生物；
[0049]
peg分子，含有羧基和胺基；和
[0050]
peg分子，含有羧基和巯基。
[0051]
加帽和封闭试剂的说明性、非限制性实例包括：
[0052]
柠康酸酐，对nh有特异性；
[0053]
乙基马来酰亚胺，对sh有特异性；和
[0054]
巯基乙醇，对马来酰亚胺有特异性。
[0055]
所述至少一种细胞穿透肽(cpp)和/或所述至少一个带正电荷的部分也可以通过接头构建体附着至所述纳米颗粒核。任何合适的接头构建体可用于将所述至少一种细胞穿透肽(cpp)和/或所述至少一个带正电荷的部分附着至纳米颗粒，例如上述纳米颗粒核。在一个实施方案中，所述至少一种cpp通过第二接头附着至所述固体纳米颗粒核。所述第一接头和所述第二接头可以是相同或不同类型的接头。在一些实施方案中，所述第一接头和第二接头不同，并且所述第二接头比所述第一接头长。在一个实施方案中，所述至少一个带正电荷的部分通过第三接头附着至所述固体纳米颗粒核。所述第一接头和所述第三接头可以是相同或不同类型的接头。在一个实施方案中，所述第一接头和第三接头不同，并且所述第三接头比所述第一接头长。不受任何特定理论的束缚，尽管存在体积更大的rna分子，但与所述第一接头相比，所述第二和/或第三接头的长度更长使较小部分(即，所述cpp和/或带正电荷的部分)从所述纳米颗粒表面延伸得更远。如此设置，所述cpp和/或所述带正电荷的部分可以有更多机会与周围环境相互作用。
[0056]
所述至少一个带正电荷的部分提供更多正电荷以抵消由庞大rna分子提供的负电荷。可以有相同带正电荷的部分的多个单元连接到相同的纳米颗粒核。附加地或备选地，可
以有多个不同种类带电部分的一个或更多个单元附着到相同的纳米颗粒核。在一些实施方案中，所述至少一个带正电荷的部分是带电荷的肽。示例性带电荷的肽可包含两个或更多个带正电荷的氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个带电荷的氨基酸。
[0057]
在一些实施方案中，所述固体纳米颗粒核具有多个mrna和/或sirna分子以及多个以以下比例与其连接的带正电荷的部分：约100:1至约1:10，例如约100:1、约90:1、约80:1、约70:1、约60:1、约50:1、约40:1、约30:1、约20:1、约10:1、约5:1、约1:1、约1:5和约1:10，以及其间的任何范围。
[0058]
如上所述，所述多功能化纳米颗粒核基本上是不带电荷或带正电荷的。在这方面，由附着mrna分子所带来的大量负电荷被正电荷抵消。术语“基本中性”是指接近电中性，可以带少量的负电荷或正电荷。
[0059]
细胞穿透肽(cpp)是促进细胞摄取相关构建体的短肽。在常见的实施方案中，所述至少一种cpp含有相对高丰度的带正电荷的氨基酸(例如，赖氨酸或精氨酸)或具有极性、带电荷的氨基酸和非极性、疏水性氨基酸的交替模式。在一些实施方案中，所述至少一种cpp包含五至九个碱性氨基酸。在一些实施方案中，所述至少一种cpp包含五至九个连续碱性氨基酸。示例性cpp包含获自hiv-1的反式激活转录激活因子(tat)或其衍生物，这些都涵盖在本公开中。有关其他代表性cpp的讨论，参见例如奥山(okuyama)m.等人,(2007年2月)《用于将蛋白质有效转运到细胞中的α螺旋小分子模拟物》(“small-molecule mimics of an alpha-helix for efficient transport of proteins into cells”)《自然方法》(nature methods).4(2):153-9，以全文引用的方式并入本文。
[0060]
在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一个附着至所述固体纳米颗粒核的sirna分子，其中所述至少一个sirna分子对所关注基因具有特异性。如本文所用，术语“具有特异性”是指所述sirna分子构建体的序列特异性，使得它可以特异性地与所关注基因的转录物杂交，从而干扰翻译成功能性蛋白质。因此，所述sirna可以诱导敲低所关注靶基因的功能性表达。在一些实施方案中，所述组合物还包含两个或更多个不同的sirna分子，其附着至所述固体纳米颗粒核。所述两个或更多个sirna分子的每一个对所关注的不同基因具有特异性，或者对所关注基因中不同序列具有特异性。所述sirna分子和rna分子(例如，mrna分子)存在的比例可以是约1:20至约20:1，例如约1:20、约1:15、约1:10、约1:5、约1:1、约5:1、约10:1、约15:1和约20:1。在各种病理条件下，一种或更多种信号传导分子异常过表达，而其他基因的表达则被沉默。因此，用所述多功能化纳米颗粒同时靶向这些分子以通过sirna敲低过表达基因的表达或通过mrna或mirna或其他生物活性分子(如肽或蛋白质)诱导被沉默基因的表达，提供了恢复正常表型的有力手段。
[0061]
本公开还涵盖一些实施方案，其中所述多功能化纳米颗粒核还包含其他功能性分子(例如蛋白质、肽和其他小分子)。可以合理选择其他功能性分子以进一步修饰或调节细胞内的基因转录或信号传导通路。参见，例如美国专利第9675708号，以全文引用方式并入本文。
[0062]
所述组合物还可包含有助于施用至细胞培养下和受试者体内的活细胞的另外组分。示例性组分包括可接受的载体、赋形剂、任选的缓冲剂等，它们被适当地配制用于如本领域已知的施用剂量和模式。
[0063]
在另一方面，本公开提供了包含上述功能化纳米颗粒的细胞。在一些实施方案中，
smcc)购买，使其更易溶于水。dmso也可替代dmf作为标记试剂的溶剂载体；同样，它应该是无水的。
[0071]
众所周知，rna分子带负电荷，因此它们不容易穿透细胞膜。如上所述，本文的组合方法使带正电荷的肽和带负电荷的rna分子平衡。此外，虽然sirna/mirna分子通常很短，长度通常小于50个核苷酸，因此它们的累积负电荷相对较少，但基因特异性mrna的长度要长得多(通常长度大于500个核苷酸，而且更常见的是大于1500个核苷酸)，具有更多的累积负电荷。因此，为了在细胞内递送此类rna分子，需要一定比例带正电荷的分子(例如由2个或更多个带正电荷的氨基酸组成的肽)以确保用此类肽和一个或更多个mrna分子多功能化的纳米颗粒能穿透细胞膜。
[0072]
核酸可以在5'或3'端附着至所述纳米颗粒。如上所述，未加帽mrna分子可以通过5'端附着至所述接头。或者，可以使用t4 rna连接酶将带有硫基的核苷酸添加到rna分子的3'端，然后所述rna分子用于附着至所述纳米颗粒。
[0073]
用于3'端标记的示例性方案包含将以下组合在单个无核糖核酸酶(rnase-free)的微量离心管中：
[0074]
2μl 10x t4 rna连接酶缓冲液
[0075]
50-100pmol rna
[0076]
等摩尔量(50-100pmol)[
32
p]pcp
[0077]
加无rna酶水至最终体积为18μl
[0078]
添加2μl t4 rna连接酶(10u)；
[0079]
在4℃下培育过夜(10-12小时)；并按照制造商的建议，通过将混合物应用于无rna酶的sephadex g-25或g-50离心柱(例如，nucaway离心柱)上，去除未掺入的标记。
[0080]
所有其他交联试剂都可以以类似的方式应用。spdp也以与smcc相同的方式应用于蛋白质/适用的肽。它易溶于dmf。通过与dtt反应一小时或更长时间，二硫醇被切断。在去除副产物和未反应的物质后，使用截留分子量为3,000的amicon离心过滤柱对其进行纯化。
[0081]
用肽、不同rna分子或蛋白质标记纳米颗粒的另一种方法可以是使用两种不同的双功能交联试剂，如美国专利第9675708号中所述交联试剂，该专利以全文引用的方式并入本文。
[0082]
在一个实施方案中，将各种比例smcc标记的蛋白质和肽添加到微珠并使其反应。所述接头使附着的分子构象灵活，因此它们可以旋转和结合相互作用的分子。此外，所述接头可以切割，更具体地，可能被细胞内蛋白酶切割或被细胞内分子还原，从而一旦进入细胞就将np与生物活性分子分离。
[0083]
在另一方面，本发明还涉及同时递送附着至功能化纳米颗粒以调节细胞内活动的几种生物活性分子(例如，多于一种sirna，其本身或与基因特异性mrna组合对所关注的不同基因具有特异性)的方法，该方法旨在敲低致癌基因或其他已知会触发或介导肿瘤发生或导致恶性肿瘤细胞扩增的基因的表达，和/或旨在诱导在肿瘤发生过程中丢失的或者是强免疫反应和防止各种感染所必需的基因产物的表达。例如，人体细胞、成纤维细胞或其他细胞类型，无论是商购的还是使用标准或改进的实验程序获得的，首先在无菌条件下铺板在有或没有细胞(饲养细胞、明胶、基底膜基质(martigel)、纤连蛋白等)粘附的基质的固体表面上。将铺板的细胞与使细胞分裂/增殖或维持可接受的细胞活力的特定因子组合一起
培养一段时间。所述特定因子的实例是血清和/或适合细胞类型的各种生长因子，以后可以取出或替换，然后继续培养。在功能化的生物相容细胞渗透性纳米颗粒存在下培养所铺板的细胞，这些纳米颗粒具有共价连接的心脏特异性重编程因子，所述因子在存在或不存在磁场的情况下，使用本文和其他文献(参见，例如us 2014/0342004，以全文引用的方式并入本文)简要描述的各种方法进行附着。在超顺磁性纳米颗粒的情况下使用磁体使得所述细胞和纳米颗粒之间的接触表面积显著增加，从而进一步增强了功能化纳米颗粒穿过细胞膜的渗透性。必要时，用所述功能化纳米颗粒重复处理细胞群，以在细胞内递送生物活性分子。
[0084]
所述细胞在培养基中保持附着或悬浮，未掺入的纳米颗粒通过离心或细胞分离去除，留下以细胞簇形式存在的细胞。然后将细胞重新悬浮在新鲜培养基中并再培养一段合适的时间。所述细胞可以通过多个循环的分离、重新悬浮和再培养，直到观察到被靶向特异性生物活性分子和/或信号传导通路改变时取出。本发明适用于大范围的细胞类型，例如人体成纤维细胞、血细胞、上皮细胞、间充质细胞等。
[0085]
此外，这些多功能化纳米颗粒也可以直接引入或通过导管介导的递送或直接引入肿瘤(以治疗癌症)或其他组织(例如肌肉内施用)用于疫苗接种。
[0086]
调控细胞活动，无论是直接的还是间接的，都是基于用生物活性分子处理各种细胞类型或组织，这些生物活性分子可包括各种蛋白质、肽、小分子、微rna、sirna、mrna等。如果没有特殊的递送媒介物，这些生物活性分子可能无法穿过细胞膜，并且可能无法到达细胞核。此外，这些生物活性分子本身的半衰期短，并且在暴露于各种蛋白酶和核酸酶时会发生降解。这些缺点导致所述生物活性分子的功效降低，并且如果可以的话，需要更高剂量或重复剂量的治疗才能达到显著效果。因此，在本发明中，使用功能化纳米颗粒来克服上述缺点。更具体地说，这些生物活性分子当以不同比例与所述纳米颗粒连接时，与原始“裸露”状态相比，获得了新的物理、化学、生物功能特性，具备了细胞穿透和细胞内活动靶向能力，从而提高了对过早降解的抵抗力，并且获得同时调节和控制几种所关注靶基因的表达和/或细胞内信号转导通路的能力。
[0087]
一方面，本公开提供了用于延长细胞中端粒的方法和组合物。每次细胞分裂时，染色体端粒都会缩短。经过多轮分裂，例如大约40轮，端粒会缩短到影响细胞的活力和健康，使得表型老化并最终造成细胞死亡。在组织或有机体水平上，这表现为衰老和生物活性较低。基于病毒的研究表明，将编码端粒酶的外源性核酸递送至细胞可表达端粒酶。参见奥杰达(ojeda)、迪亚哥(diego)等人《小鼠星形胶质细胞感染人类免疫缺陷病毒-1后，体外胶质纤维酸性蛋白表达、端粒酶活性和端粒长度增加》(“increased in vitro glial fibrillary acidic protein expression,telomerase activity,and telomere length after productive human immunodeficiency virus-1infection in murine astrocytes”)《神经科学研究杂志》(journal of neuroscience research)92.2(2014):267-274；以及洪(hong)，金宇(jin woo)和蔡玉云(chae-ok yun)《端粒基因治疗：治疗各种疾病的极化治疗目标》("telomere gene therapy:polarizing therapeutic goals for treatment of various diseases.")《细胞》(cells)8.5(2019):392，每篇文献以全文引用的方式并入本文。所表达的端粒酶延长了靶细胞的端粒，使得细胞表型更年轻，并延长了细胞和相关组织的寿命。如上所述，所公开的纳米颗粒提供了替代的细胞转化媒介物，当用
mrna进行功能化时，所述媒介物有效替代了异源性基因基于病毒的表达。此外，本公开的基于纳米颗粒方法其他优势是长期稳定性，并避免将外来分子整合到染色体中，从而避免了基于病毒的基因疗法的潜在有害副作用。因此，通过本文所述多功能化纳米颗粒实施的基于端粒酶的治疗将成功地使端粒酶在靶细胞中表达，并在促进细胞年轻表型和延长寿命方面达到至少同等效果，而免去中断性和有害的染色体插入风险。
[0088]
这方面可以适用于治疗方法(method of treatment)或疗法(therapy)中，由此使体内的靶细胞、细胞、组织等与治疗有效量的所公开纳米颗粒接触，所述纳米颗粒用编码端粒酶的mrna功能化。所述方法可适用于一般在细胞/组织/身体中延长端粒酶，从而促使表型更年轻，延长寿命，并降低或逆转衰老的影响。施用可以是全身施用或局部施用。在一些实施方案中，所述靶细胞或组织在中枢神经系统中，施用可以是例如通过鞘内注射进行。
[0089]
本文所涵盖递送平台的另一种用途是筛选/测试生物活性分子(化合物或两种以上化合物的组合)对细胞活动的影响。这涉及将使用本文公开的方法附着至多功能化纳米颗粒的化合物与所关注的细胞群(例如成纤维细胞、血细胞、间充质细胞)结合或在组织注射后，培养/培育合适的时间，然后确定由多功能纳米颗粒递送化合物的活性产生的任何调节作用。
[0090]
本文所涵盖递送平台的另一种用途是将特化细胞配制为药物或在用于治疗人体或动物体的递送装置中配制特化细胞。这使临床医生能够在所关注正常或异常组织中或周围从脉管系统或直接注入肌肉或器官壁施用所述功能化纳米颗粒，从而使所用的生物活性分子进入细胞、控制损伤，并参与组织肌肉组织的重建/再生和特定功能的恢复。
[0091]
补充定义
[0092]
除非本文特别限定，否则本文使用的所有术语都具有与本发明领域技术人员理解相同的含义。从业者特别参照以下文献以了解本领域的定义与术语：桑布鲁克(sambrook)j.等人(编辑)《分子克隆：实验室手册》(molecular cloning:alaboratory manual),第3版，冷泉港出版社(cold spring harbor press),普莱恩斯维尤,纽约(2001)；奥苏贝尔(ausubel)f.m.等人(编辑),《目前的分子生物学协议》(current protocols in molecular biology),约翰
·
威利父子出版公司(john wiley&sons),纽约(2010)；和科利根(coligan)j.e.等人.(编辑),《目前的免疫学协议》(current protocols in immunology),约翰
·
威利父子出版公司,纽约(2010)。
[0093]
在权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代物或替代物是互斥的，尽管本公开支持仅涉及替代物和“和/或”的定义。
[0094]
根据长久以来的专利法，除非特别说明，否则“一个”(a)和“一个”(an)词语当在权利要求书或说明书中与“包含”一词结合使用时，表示一个或更多个。
[0095]
除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”(comprise)、“包含”(comprising)等应被解释为包容性的含义，而不是排他性或穷举性的含义；即表示“包括但不限于”的意思。使用单数或复数的词语也分别包括复数和单数。此外，当在本技术中使用时，词语“在此”、“以上”和“以下”以及类似含义的词语应指本技术的整体而不是本技术的任何特定部分。词语“约”表示高于或低于所示参考数字稍有变化范围内的数字。例如，“约”可以指高于或低于所示参考数字10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％范围内的数字。
[0096]
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指正在评估治疗和/或正在接受治疗的哺乳动物。在某些实施方案中，所述哺乳动物是人类。术语“受试者”、“个体”和“患者”涵盖但不限于患有癌症的个体。虽然受试者可以是人类，但该术语还涵盖其他哺乳动物，特别是可用作人类疾病实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠、狗、非人类灵长类动物等。
[0097]
术语“治疗”及其语法变体可以指成功治疗或改善或预防疾病或病症(例如癌症、传染病或自身免疫性疾病)的任何标志，包括任何客观或主观参数，例如使患者症状减轻、缓解、减少或使患者更能耐受疾病状况；减慢退化或衰退的速度；或使退化的终点不那么虚弱。
[0098]
症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括医生检查的结果。因此，术语“治疗”包括施用本公开化合物或药剂以预防或延迟、减轻，或阻止或抑制与疾病或病症(例如癌症、传染病或自身免疫性疾病)相关的症状或病情的发展。术语“治疗效果”是指减少、消除或预防受试者的疾病或病症、所述疾病或病症的症状，或疾病或病症的副作用。
[0099]
公开了可用于所公开方法和组合物、与其可结合使用、可用于其制备的材料、组合物和组分，或者是所公开方法和组合物的产物。应当理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、组等被公开时，特别考虑了各种单独和集体组合中的每一种，即使可能未明确公开具体提及这些化合物的每种和每种单独的组合和排列。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于所述方法中的步骤。因此，任何前述实施方案的特定要素可以组合或替代其他实施方案中的要素。例如，如果存在可以执行的各种补充步骤，则应当理解，这些补充步骤中的每一个都可以使用所公开方法的任何特定方法步骤或方法步骤组合来执行，具体考虑了每个此类组合或子集的组合并且应当认为是公开的。此外，应当理解，本文所述的实施方案可以使用任何合适的材料来实施，例如本文他处描述的材料或本领域已知的材料。
[0100]
本文引用的出版物和引用它们的主题在此特别以全文引用的方式并入本文。
[0101]
实施例
[0102]
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员完整公开和描述如何制造和使用本发明，并不旨在限制发明人认为的发明范围，也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。
[0103]
实施例1
[0104]
该实施例描述了一种测定，其中本公开所涵盖的多功能化纳米颗粒被用于成功递送能够显著降低靶基因功能性表达的sirna有效载荷。
[0105]
用能够与所述纳米颗粒上胺基形成共价键的双特异性接头处理在其表面上具有可用游离胺基的细胞渗透性纳米颗粒，从而产生接头功能化的纳米颗粒。添加经化学修饰以结合纳米颗粒接头(含有例如马来酰亚胺)的自由端的人类pten sirna以形成共价键，随后进行大量洗涤或以其他方式与未结合的pten sirna分子分离。所得纳米颗粒被添加到表达pten基因的细胞中时，会将其pten特异性sirna货物递送至细胞质中，如图1所示。一旦进入所述细胞的细胞质，所述sirna分子就会与pten mrna相互作用并触发称为mrna降解的多步骤过程，使得pten基因表达减少。使用这种方法，可以实现不同程度的pten敲低。如上所述产生的pten多功能化纳米颗粒能够敲低至少60％的正常pten表达水平，这使用pten特异性引物以及从sirna处理的细胞和对照细胞(在没有sirna的情况下用纳米颗粒处理)分离
的rna通过定量实时rt-pcr进行测定。
[0106]
这些数据证明了所公开的多功能化纳米颗粒可以有效地将基于rna的有效载荷递送到细胞内部，并且其功能作用不变。更具体地说，数据表明所述多功能化纳米颗粒可以递送sirna构建体以成功敲低所关注靶基因的表达。
[0107]
实施例2
[0108]
该实施例描述了一种测定，其中本公开所涵盖的多功能化纳米颗粒用于成功递送mrna，该mrna由细胞翻译机制有效表达以产生可测量的基因表达。
[0109]
在这种情况下，翻译后表达红色荧光蛋白的mcherry mrna是使用在t7启动子控制下克隆的mcherry cdna生成的。t7体外转录试剂盒(新英格兰生物实验室公司(new england biolabs)，伊普斯威奇，马萨诸塞州)用于生成未加帽的mcherry mrna，随后使用qiagen(凯杰公司)rna纯化柱(凯杰公司(qiagen)，日耳曼敦，马里兰州)进行纯化，根据制造商的说明(新英格兰生物实验室公司)使用碱性磷酸酶和s-γ-atp进行化学修饰并与如上文实施例1中所述生成的接头功能化的细胞渗透性纳米颗粒反应。将所得mrna多功能化纳米颗粒或没有mcherry mrna的纳米颗粒添加到细胞中，并在co2培养箱中培育细胞。图2示出了用缺少mrna的对照纳米颗粒处理的正常细胞的荧光显微镜检查，显示正常人类细胞几乎没有红色荧光，表明缺少红色mcherry蛋白表达。相比之下，用mcherry mrna多功能化纳米颗粒处理的细胞显示出明显的红色染色(指向右图中白色点状区域的箭头)，表明红色mcherry蛋白成功表达，其分布在整个细胞质中。
[0110]
这些数据证明了所公开的多功能化纳米颗粒可以有效地将基于mrna的有效载荷递送到细胞内部而其功能作用不变。更具体地说，数据表明所述多功能化纳米颗粒可以将mrna分子递送到细胞质中，在细胞质中mrna被成功翻译，从而表达所关注靶基因。还须强调的是，制备这些非整合功能化纳米颗粒不涉及任何可以整合到细胞基因组中并破坏正常基因表达模式的dna分子。
[0111]
这些数据证明了所公开的多功能化纳米颗粒可以有效地递送编码mrna构建体，从而有效表达所关注的靶基因。
[0112]
实施例3
[0113]
使用上述实施例1和2中描述的sirna和mrna多功能化方法，可以生成非整合纳米颗粒，其用带正电荷的肽和一组在各种人类肿瘤中过表达的信号转导分子特异性sirna(能够靶向β-连环蛋白、mtor和raf1 mrna)进行功能化。简而言之，人类癌细胞系或肿瘤用功能化纳米颗粒处理一次或重复处理(2次或更多次)，这将这些生物活性分子递送到处理过的细胞或组织的细胞质，并敲低这些靶基因mrna的表达。使用各种分子生物学、生物化学和细胞生物学技术监测这种同时调控(抑制)在癌症信号转导通路中几种异常的结果。具体而言，靶基因的表达可以通过rna分离、逆转录pcr(rt-pcr)或实时定量qrt-pcr、使用适当抗体对细胞进行免疫染色或通过对培养细胞进行流式细胞术分析来确定。这些使用sirna多功能化纳米颗粒的基因特异性靶向可以抑制导致恶性细胞生长的异常信号传导，从而恢复正常表型。
[0114]
实施例4
[0115]
使用一组基因特异性sirna(如上文提到的sirna)和tp53肿瘤抑制因子特异性mrna(已知tp53的表达在许多人类癌症中丢失)多功能化的纳米颗粒用于将这些分子递送
到癌症细胞或直接递送到tp53表达被沉默的肿瘤。如上文实施例1-3中产生和描述的，这种同时将生物活性sirna和mrna分子引入细胞中的组合是一种抑制异常信号传导通路并恢复被沉默p53基因表达新颖且有效的方法，使得肿瘤细胞生长减缓或消除肿瘤细胞。
[0116]
这些非整合功能化纳米颗粒的制备不涉及任何可以整合到细胞基因组中并破坏正常基因表达模式的dna分子。在不背离本发明的精神或本质特征的情况下，本发明可以其他特定形式实施。
[0117]
实施例5
[0118]
对于疫苗接种，所述纳米颗粒用带正电荷的细胞穿透肽和基因特异性mrna分子的组合进行功能化。直接处理人体细胞或直接肌肉内、静脉内、鼻内或皮肤上施用这些多功能化细胞渗透性纳米颗粒将mrna高效递送到细胞质中，然后翻译mrna并产生触发适当免疫反应或其他预期效果所需的抗原。如果需要，使用上述类似的功能化路径也可以将另外的基因特异性mrna本身或与其他类型的分子(例如蛋白质)组合在纳米颗粒上进行功能化，以增强递送的mrna的表达和免疫原性反应。
[0119]
尽管已经说明和描述了说明性实施方案，但是应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在其中做出各种改变。