益母草碱及其晶体在制备抗衰老药物中的用途的制作方法

1.本发明属中药现代化制药技术领域，涉及中草药益母草提取物益母草碱的晶体在制备药物中的应用，尤其是在制备抗衰老药物中的用途。


背景技术：

2.中草药益母草(唇形科植物,herba leonuri,chinese motherwort)最早收载于《神农本草经》、《本草纲目》等古籍中，有活血调经、利尿消肿的功效；中华人民共和国药典(2000年版)中用于月经不调、痛经、经闭、恶露不尽、水肿尿少、急性肾炎水肿等治疗。本技术的前期研究发现益母草具有除上述已知功能以外的一系列新用途，包括心血管保护作用等，并进一步分离、合成了其单体有效成分益母草碱，确定了益母草碱作为候选药物的若干新用途。本技术进一步解析益母草碱的晶体结构，获得最佳药用晶型，并研究该益母草碱及其晶型新的制药物用途。
3.衰老是生物体的自然生理过程，其发生机制目前尚未被充分阐明。人类自古以来就有“长生不老”的梦想，但始终未能实现。衰老尽管是自然生理过程，但也是诸多慢性疾病发生的基础，因此，研发新型抗衰老药物的目标并非是实现“长生不老”之梦，而是在现代老龄化趋势明显的社会中，通过适当的延长寿命，提高人群的健康生存期，提高生存质量，减少以衰老为基础的各种慢性疾病的发生。
4.基于现有技术的现状，本技术的发明人拟提供抗衰老的新药物，具体涉及益母草碱及其晶体在制备抗衰老药物中的用途，本技术的抗衰老的新药物特别适用于早期干预以衰老为基础的疾病的发生，具有减低所述老年性疾病发生的危险因素和其他相关疾病发生率的作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是基于现有技术的现状，提供抗衰老的新药物，具体涉及中药益母草的活性成分益母草碱及其药用晶型在制备抗衰老药物中的新的药用用途，尤其是制备针对人体自然衰老过程作早期干预的药物，可延缓衰老、延长寿命，包括延长群体中位生存时间以及多个生存期的群体生存时间；并可用于防止减少衰老相关性疾病的发生。
6.本发明的进一步目的是将上述活性成分作为药物制剂的原料。
7.本发明所述的益母草碱是从益母草中分离得到的有效成分，并经过人工合成加以大量制备，其化学结构式为：
[0008][0009]
所述益母草碱英文名称为：leonurine；化学名称：3，5-二甲氧基-4-羟基-苯甲酸(4-胍基)-1-丁酯。
[0010]
本发明通过特定的方法，可将益母草碱制备成6种不同晶型的晶体，具体为益母草碱硫酸盐的6种不同结构的晶体，其中2种为水合物，2种为无水晶型，一种为甲醇合物，一种为乙醇合物。
[0011]
为了便于描述，本发明所述的6种上述益母草碱晶体分别命名为晶型a、晶型b、晶型c、晶型d、晶型e和晶型f。
[0012]
本发明中，经实验证实，所述的益母草碱晶体其晶型a具有抗衰老作用，：
[0013]
所述的晶型a益母草碱半硫酸盐一水合物晶体，其分子结构如图1所示；
[0014]
晶型a所代表的益母草碱半硫酸盐一水合物晶体，为无色片状晶体，属三斜晶系，其空间群为p-1，不对称单元中包含2个益母草碱分子，1个硫酸根离子以及2个水分子；其中两个益母草碱分子的胍基与硫酸根的负离子形成离子键三聚体，该三聚体与三聚体之间通过胍基和硫酸根的氢键作用形成二维结构，形成如下多聚体分子平面层(如图2所示)；
[0015]
本技术中，晶型a所代表的益母草碱半硫酸盐一水合物晶体的多层多聚体分子平面以平行的方式叠加排列，其二维结构分子平面通过水分子的氢键作用形成益母草碱半硫酸盐一水合物晶体的如下三维层叠网状结构，其胍基和硫酸根形成的亲水层与益母草碱疏水基团交替排列(如图3所示)。
[0016]
本技术中，晶型a所代表的益母草碱半硫酸盐一水合物晶体其单晶分子中所有原子的空间位置符合如下表1所示功能原子坐标和等方性或相当等方性位移参数。
[0017]
表1、益母草碱半硫酸盐一水合物晶体其单晶分子中所有原子的坐标和等方性或相当等方性位移参数
[0018]
[0019]
[0020]
[0021][0022]
为了进一步鉴定上述6种益母草碱晶型的特征，它们分别经x-射线粉末衍射(xrpd)分析，得到如下表2所示的xrpd数据：
[0023]
表2、六种益母草碱晶体的xrpd数据：
[0024]
[0025][0026]
本发明所述的6种益母草碱晶型特指具有上述xrpd特征的晶体。
[0027]
进一步，上述益母草碱及其晶体可用于制备预防衰老药物。
[0028]
本发明中，所述的抗衰老作用在于延长生物个体的寿命；在自然生存条件下延长用药群体的平均寿命，在用药后的一系列时间点显示出降低死亡率的作用，群体中位生存时间以及多个生存期的群体生存时间、群体平均寿命等均得到延长，个体最长生存期也显著增加。
[0029]
更进一步的，本发明提供了一种新新型抗衰老药物，进一步制备防治衰老导致的各种疾病。所述的继发性疾病是各种老年退行性疾病，包括神经系统、免疫系统、心脑血管系统、骨骼运动系统、消化系统、内分泌系统等的退化所导致的疾病。特别适用于早期干预上述疾病的发生，具有减低上述老年性疾病发生的危险因素和其他相关疾病发生率的作用。特别适用于早期干预衰老过程，具有减低延长寿命，减低衰老相关疾病发生率的作用，可早期阻断这一类疾病危险因子的危害性。
[0030]
本发明的益母草碱晶体可作为药物原料，直接或与药学上通常用于制剂的固体或液体辅料混合制成适宜制剂，包括胶囊、片剂、散剂、混悬剂以及复方制剂。
[0031]
本发明进行了大样本的药理学研究，结果显示，所述的益母草碱及其a型晶体具有减低线虫自然死亡率、延长线虫群体寿命，延缓自然死亡过程的抗衰老作用。
[0032]
本发明药效研究实验以野生型秀丽隐杆线虫n2为研究对象，观察益母草碱及其a型晶体对线虫群体自然死亡过程的影响。
[0033]
实验结果显示，益母草碱及其a型晶体降低了野生型秀丽隐杆线虫n2的自然死亡率，延长了线虫的自然生存期，具有延长寿命的作用。
[0034]
所述的益母草碱及其晶体可用于制备预防衰老药物，用于延长人类及其它生物体的自然寿命，也可进一步制备防止衰老发生的预防性药物，所述药物用于预防自然衰老，也
可用于早期干预所导致的各种严重疾病的发生。
[0035]
本技术提供了益母草碱晶体在制备抗衰老药物中的用途，所述的抗衰老药物尤其适用于早期干预衰老相关疾病的发生，具有减低早期衰老相关危险因素和其他相关疾病发生率的作用。鉴于目前尚无特异性预防自然衰老的药物，本发明提供了抗衰老的新方法和新药物。
附图说明
[0036]
图1是益母草碱晶型a的分子结构。
[0037]
图2是益母草碱晶型a分子的二维结构。
[0038]
图3是益母草碱晶型a分子的三维结构。
[0039]
图4是益母草碱a型晶体作用下野生型秀丽隐杆线虫n2生存率曲线的实验数据统计图。益母草碱a型晶体具有提高线虫生存率的作用。
[0040]
图5是益母草碱a型晶体作用下野生型秀丽隐杆线虫n2生存率组间比较直方图。益母草碱a型晶体在线虫20和25天等生存期时间点显著地减低自然死亡率，其有效浓度为10mg/l和40mg/l，各组样本量分别为：溶剂对照组(n＝358)，益母草碱a型晶体10mg/l组(n＝320)，益母草碱a型晶体20mg/l组(n＝367)，以及益母草碱a型晶体40mg/l组(n＝251)。p《0.05代表统计学显著差异。
[0041]
图6是各组平均生存时间直方图。溶剂对照组、益母草碱a型晶体低剂量组(10mg/l)、益母草碱a型晶体中剂量组(20mg/l)、益母草碱a型晶体高剂量组(40mg/l)的平均生存时间分别为20.30天、23.12天、21.99天、24.36天，其中益母草碱a型晶体低剂量组(10mg/l)、益母草碱a型晶体高剂量组(40mg/l)的平均生存时间分别显著高于溶剂对照组(p《0.05)，各组样本量分别为：溶剂对照组(n＝192)，益母草碱a型晶体10mg/l组(n＝228)，益母草碱a型晶体20mg/l组(n＝240)，以及益母草碱a型晶体40mg/l组(n＝152)。p《0.05代表统计学显著差异。
具体实施方式
[0042]
实施例1
[0043]
以野生型秀丽隐杆线虫n2为模型，观察益母草碱a型晶体对野生型秀丽隐杆线虫n2自然寿命的影响
[0044]
实验材料和方法：
[0045]
(1)秀丽隐杆线虫品系
[0046]
秀丽隐杆线虫野生型n2(caenorhabditis genetics center，cgc/复旦大学脑科学研究院邵志勇老师实验室惠赠)
[0047]
(2)细菌菌株
[0048]
尿嘧啶渗漏型大肠杆菌e.coli op50(caenorhabditis genetics center，cgc/复旦大学脑科学研究院邵志勇老师实验室惠赠)
[0049]
(3)试剂和培养基准备
[0050]
a)worm picker制作
[0051]
剪取约1-1.5cm的铂銥合金丝(30
–
32gage；tritech research)，用平口钳子将一
端夹平，并用砂纸磨去毛刺。取巴斯德玻璃吸管，折断细端使其细末端出现一残口(距壶腹部约2cm)，将铂銥合金丝(平端朝外)轻轻穿在玻璃吸管细端，在酒精灯火焰上烧至玻璃管融化，用镊子将铂金丝与玻璃管粘合。
[0052]
b)益母草碱母液配制
[0053]
准确称取益母草碱a型晶体粉末，溶解于dmso至所需浓度。
[0054]
c)m9 buffer
[0055][0056][0057]
ddh2o定容至1000ml，高压灭菌，121℃，30min。
[0058]
d)线虫冻存液
[0059]
·
s buffer
[0060]
0.05m k2hpo4ꢀꢀꢀꢀꢀ
129ml
[0061]
0.05m kh2po4ꢀꢀꢀꢀꢀ
871ml
[0062]
nacl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5.85g
[0063]
·
s buffer(同上) 30％甘油(v/v)，高压灭菌，121℃，30min。
[0064]
e)线虫同期化裂解液(bleach/naoh-master mix)
[0065]
次氯酸钠溶液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1ml
[0066]
5m naoh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5ml
[0067]
m9 buffer
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3.5ml
[0068]
f)luria bertani(lb)培养基
[0069]
yeast extract
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.25g
[0070]
tryptone
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5g
[0071]
nacl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5g
[0072]
ddh2o定容至50ml，高压灭菌，121℃，30min。若需配制固体lb，则额外加入1g琼脂粉，于超净台中倒板。
[0073]
g)线虫生长培养基(nematode growth media，ngm)
[0074]
nacl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3.0g
[0075]
peptone(from casein)
ꢀꢀꢀꢀꢀ
2.5g
[0076]
agar
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
17g
[0077]
ddh2o定容至975ml，并加入磁力搅拌转子，高压灭菌，121℃，30min。
[0078]
高压灭菌之后于55℃水浴降温，之后加入下列溶液：
[0079]
1m cacl2(无菌)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5ml
[0080]
5mg/ml胆固醇溶液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1ml，无水乙醇配制。
[0081]
1m mgso4(无菌)
ꢀꢀꢀꢀꢀ
1ml
[0082]
1m kpo4(无菌)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25ml
[0083]
(108.3g kh2po4,35.6g k2hpo4,1l ddh2o,ph 6.0)
[0084]
混匀之后，倒培养皿：100mm培养皿约倒20ml培养基，60mm培养皿约倒10ml培养基，35mm培养皿约倒4ml培养基。凝固好的平板在超净台内紫外杀菌1h。待平板完全凝固后，将平板倒置，以晾干水分，防止污染。干燥后于4℃保存备用。
[0085]
(4)e.coli op50菌液制备及接种
[0086]
寿命试验中，秀丽隐杆线虫以尿嘧啶渗漏型型大肠杆菌e.coli op50为食。该菌在ngm固体培养基上生长会受限制，只会形成均匀的菌落，而不会大量繁殖。e.coli op50的这一生长特性即为线虫的生存提供了稳定的食物来源，同时也方便秀丽隐杆线虫的培养和观察。
[0087]
·
取少许e.coli op50菌液用lb液体培养基稀释之后，涂布于lb平板，37℃过夜培养。
[0088]
·
挑取单菌落于10ml lb液体培养基中，37℃，220rpm于恒温摇床中过夜扩大培养。
[0089]
·
ngm平板接种e.coli op50
[0090]
a线虫正常培养板接种
[0091]
·
用移液器将扩大培养的e.coli op50菌液在超净台中加入到ngm平板中间，(60mm平板加150μl菌液，90mm加200μl菌液)。菌斑边缘距离平板边缘至少1cm，自然晾干，之后于37℃培养至少24h，待菌斑长至一定厚度，4℃密封保存2-3周。
[0092]
·
b指标测定培养板接种
[0093]
同“线虫正常培养板接种”方法。只是在加入菌液前，将2倍实验设计浓度的益母草碱溶液与e.coli op50菌液等体积混合，同时设置空白组即用m9 buffer补足体积。为避免平板中由于水分的丢失而影响线虫的正常生命活动，一般为实验24-48h前接种培养。
[0094]
(5)线虫培养
[0095]
a)线虫复苏
[0096]
将冻存的秀丽隐杆线虫于掌心旋转溶解，用200μl移液器滴加至ngm培养基表面的e.coli op50菌斑周围，在体视显微镜下观察。刚刚复苏的线虫虫体皱缩，几分钟后可恢复至正常形态，并可看到它们抽搐或者游走。于21℃恒温培养箱过夜培养，成功复苏的线虫会自行爬行到菌斑中间觅食。
[0097]
b)线虫传代
[0098]
线虫虫体透明，可在带有透射光源的解剖立体显微镜中观察操作。本课题采用motic，smz171体视三目显微镜，拥有标准的10x目镜和变倍范围为0.75x～5x连续变倍物镜。
[0099]
线虫转移通常有两种方法：
①
爬块法：用无菌手术刀切取带有线虫的琼脂块于新的ngm平板上，线虫会爬出琼脂快至op50菌斑上。本方法适用于需要转移大量线虫时。
②
worm picker法：用无菌挑虫器平端蘸取少许有一定厚度的op50，利用菌体的粘性轻轻粘线虫至新的ngm平板。该方法适用于挑取指定线虫，注意每次挑取后wormpicker均须在酒精灯高温灭菌，并避免戳破ngm平板。转移后的线虫于21℃恒温培养箱过夜培养。
[0100]
c)线虫冻存
[0101]
·
大量新鲜饥饿的l1～l2期的线虫最适宜冻存。用s buffer收集虫体于1.8ml冻存管，1ml s buffer/60mmngm平板。
[0102]
·
加入等体积s buffer 30％甘油，用移液器混匀。
[0103]
·
每300μl分装至做好标记(品系，日期)的1.8ml冻存管。
[0104]
·
将冻存管置于梯度降温冻存盒，-80℃降温超过16h。
[0105]
·
次日转入液氮长久保存，并复活一支检测冻存复苏效率。
[0106]
d)线虫同期化
[0107]
用裂解法获取同期化线虫。操作如下：
[0108]
·
用无菌3.5ml m9 buffer收集大量处于妊娠期的成虫和虫卵转移到15ml ep管中；
[0109]
·
加入1.5mlbleach/naoh-master mix(现用现配)，静置5min；
[0110]
·
涡旋3-4次，直至在灯光下可见虫体破裂溶解完全，不超过2min；
[0111]
·
1300xg，离心2min；
[0112]
·
无菌m9 buffer洗涤一次，1300xg，离心2min；
[0113]
·
弃上清，留取200μl液体，用移液枪将虫卵转移至接种有op50的ngm平板上，于21℃恒温培养箱培养。待卵发育为成虫后，视为同期化线虫。同期化线虫可用于实验研究。
[0114]
(6)线虫固体寿命实验
[0115]
a)寿命实验设置和检测
[0116]
·
同期化培养：同期化的虫卵于21℃培养箱培养约42～48h可发育至l4时期；
[0117]
·
day 0：
[0118]
筛选op50生长良好，无污染的实验用ngm平板。
[0119]
设置寿命实验记录表。一般是excel表格，包含实验必要信息包括线虫品系、实验药物，实验时间等，初次之外每个平板分别设置alive(a)，dead(d)，censored(c)菜单栏。
[0120]
挑取l4至ngm平板，每个平板12～15条。每组大于75条。
[0121]
·
day2之后每天观察并记录线虫的生存情况，包括alive，dead，censored并及时转盘，防止线虫饥饿和污染。
[0122]
为防止卵及幼虫的发育而对实验结果造成影响，每天将线虫转移至新鲜涂布的给药板中或者在培养基中加入5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-fluoro-2-deoxyuridine,fudr)120μm，12天之后撤走fudr.连续观察至线虫群体的最后一个成员的死亡。
[0123]
b)死亡检测
[0124]
当线虫衰老时，运动逐渐减慢，甚至静止只有头部或者尾部活动。因此检测是否死亡时，用滚烫的worm picker接近线虫头部或者尾部，观察其是否应答。若无应答，则判定为死亡。
[0125]
c)删失判定
[0126]
在寿命试验过程中，爬壁丢失，或者因为外阴破裂或者人为原因导致死亡的均计入删失数据。
[0127]
d)数据统计：
[0128]
寿命实验数据采用kaplan-meier生存分析，并用log-rank检验比较各组间中位生存时间，fisher精确检验比较各组特定时间的生存率。
[0129]
以在ngm平板上涂布的e.coli op50菌液中含有的药物浓度为准设置如下实验组：
[0130]
1.溶剂对照组：e.coli op50菌液中含有对照溶剂
[0131]
2.益母草碱a型晶体低剂量组：e.coli op50菌液中含有10mg/l的益母草碱a型晶体
[0132]
3.益母草碱a型晶体中剂量组：e.coli op50菌液中含有20mg/l的益母草碱a型晶体
[0133]
4.益母草碱a型晶体高剂量组：e.coli op50菌液中含有40mg/l的益母草碱a型晶体
[0134]
5.益母草碱a型晶体超高剂量组：e.coli op50菌液中含有80mg/l的益母草碱a型晶体
[0135]
选取经过同期化的虫卵成长的l4期成虫(3day)，转移到上述实验组的ngm平板上，随机选取线虫随机移入每个皿中，直至每个皿中移入15只线虫为止，详细实验操作及观察方法如前述“寿命实验”部分；
[0136]
实验结果显示：
[0137]
如图4所示，于第5天开始有线虫出现自然死亡，表现为生存曲线开始偏离水平线而向下倾斜；随着培养时间的延长，各组均开始出现线虫自然死亡，生存曲线均开始下倾；但给予益母草碱a型晶体各组生存曲线的下倾速度低于溶剂对照组，各益母草碱组的生存曲线均位于溶剂对照组的右侧，在某一时间点各组生存率如有统计学显著差异的，则用*和#标出；其中，*代表益母草碱a型晶体低剂量组(10mg/l)与溶剂对照组相比生存率有显著提高(p＜0.05)，#代表益母草碱a型晶体高剂量组(40mg/l)与溶剂对照组相比生存率有显著提高(p＜0.05)；
[0138]
线虫在第20和25天的生存期时间点的各组生存率比较则如图5所示，益母草碱a型晶体在线虫20和25天等生存期时间点显著地减低了自然死亡率，其有效浓度为10mg/l和40mg/l。各组样本量分别为：溶剂对照组(n＝358)，益母草碱a型晶体10mg/l组(n＝320)，益母草碱a型晶体20mg/l组(n＝367)，以及益母草碱a型晶体40mg/l组(n＝251)。p《0.05代表统计学显著差异；
[0139]
各组线虫的平均生存时间如图6所示。溶剂对照组、益母草碱a型晶体低剂量组(10mg/l)、益母草碱a型晶体中剂量组(20mg/l)、益母草碱a型晶体高剂量组(40mg/l)的平均生存时间分别为20.30天、23.12天、21.99天、24.36天。其中益母草碱a型晶体低剂量组(10mg/l)、益母草碱a型晶体高剂量组(40mg/l)的平均生存时间分别显著高于溶剂对照组(p《0.05)。各组样本量分别为：溶剂对照组(n＝192)，益母草碱a型晶体10mg/l组(n＝228)，益母草碱a型晶体20mg/l组(n＝240)，以及益母草碱a型晶体40mg/l组(n＝152)，p《0.05代表统计学显著差异；
[0140]
各组的中位生存时间(某组群体中死亡个体数达到总数50％的时间)分别为：溶剂对照组，21天；益母草碱a型晶体低剂量组(10mg/l)，23天；益母草碱a型晶体中剂量组(20mg/l)，22天；益母草碱a型晶体高剂量组(40mg/l)，25天。与溶剂对照组相比，给予益母草碱的低、中、高三个剂量组的中位生存时间分别提高9.5％，4.8％和19.0％；
[0141]
各组的最长寿个体生存时间(某组群体中所有个体均死亡所需的时间)分别为：溶剂对照组(n＝358)，41天；益母草碱a型晶体低剂量组(10mg/l，n＝320)，45天；益母草碱a型晶体中剂量组(20mg/l,n＝367)，45天；益母草碱a型晶体高剂量组(40mg/l,n＝251)，46天，与溶剂对照组相比，给予益母草碱的低、中、高三个剂量组的最长寿个体生存时间分别提高
9.8％，9.8％和12.2％；
[0142]
实验结果显示，益母草碱及其a型晶体在大样本线虫寿命观察实验中显示出延长线虫自然寿命的作用；其降低自然死亡率的作用在10mg/l和40mg/l两个剂量组显示统计学显著差异；在线虫群体因自然死亡而表现出的生存率下降过程中，益母草碱a型晶体已经显示出显著的降低自然死亡率的作用,其10mg/l和40mg/l两个剂量组的中位生存时间分别提高9.5％和19.0％。益母草碱a型晶体的抗衰老作用持续存在，并显著提高最长寿个体生存时间。
[0143]
上述结果表明益母草碱及其a型晶体可用于制备抗衰老药物，用于对抗自然衰老过程，用于延长寿命并预防由衰老所继发的各种老年性疾病。