基于高光谱技术的苯扎溴铵共代谢降解菌的快速筛选方法

1.本发明属于污染研究领域，尤其涉及基于高光谱技术的苯扎溴铵共代谢降解菌的快速筛选方法。


背景技术：

2.sars-cov-2的出现导致日常生活中对消毒剂的需求急剧增加。作为典型的消毒剂，苯扎溴铵(benzyl dodecyl dimethyl ammonium bromide，bdab)凭借对病毒和细菌的高效灭活作用而广泛使用，但也导致了bdab在环境中的释放大大增加。bdab本身结构稳定，具有较低的生物降解性、对水生和土壤生物具有较高的毒性。因此，环境中残留的高浓度bdab的快速去除是亟待解决的问题。鉴于生物法是去除bdab的主要方式，因此环境中bdab降解菌的分离和筛选成为了问题的关键。在已知的bdab降解过程中，有一部分微生物可以bdab作为唯一碳源，但在实际水处理环境中，bdab不是作为唯一碳源，而是作为共存的可被微生物利用碳源中的一种的形式存在。如作为环境中bdab主要处理单元的污水处理厂，其待处理污水中还有大量其他碳源存在。因此绝大多数情况下微生物在环境中以共代谢的形式生长，bdab共代谢降解菌在环境中存在更为广泛。同时在共代谢的条件下，微生物能利用更容易利用的碳源从而表现出更大的生物量和bdab降解速度。因此从环境中筛选bdab共代谢菌具有更重要更实际的意义。
3.但是传统筛选共代谢降解菌菌株的过程往往存在过程复杂、费时费力、消耗化学试剂的问题。在筛选以bdab为唯一碳源微生物时，生长就可作为bdab降解菌的唯一判断标准。但在共代谢体系里生长的菌落并不一定具有bdab降解能力，而有可能通过改变膜组成，孔蛋白编码基因的下调表达，流出泵蛋白的上调表达等方式实现耐受。因此，为把具有降解性能的菌株尽量的保留下来，在共代谢体系里筛选bdab共代谢降解菌时，需要对体系生长的大量菌株逐一挑至液体培养基中培养，在反复涂布纯化后，得到众多菌落的纯培养物，最后结合液相色谱法对每个菌落进行bdab降解性能的测定，从而筛选是否为bdab共代谢降解菌。因此，传统方法限制了高通量筛选bdab共代谢降解菌的可能性。所以寻找一个快速高通量的筛选方法将有助于解决这一问题。
4.近红外(nir)光谱技术(750nm-2500nm)是一种快速、无损的定量分析方法，它通过反应含氢基团(o-h、n-h、c-h)化学键(x-h)的伸缩振动倍频和合频，来确定含氢基团的信息。其中近红外高光谱成像(nir hyperspectral imaging，nir-hsi)技术能同时包含样本的光谱信息和空间信息，结合化学计量学算法，nir-hsi技术可根据不同样品的光谱信息定量化合物的含量，并对化学成分的空间分布进行预测。nir-hsi技术以速度快、操作简单、检测效率高、稳定性好等特点受到各个领域的关注，被广泛用来定量分析食品、环境中目标化学物的含量。


技术实现要素：

5.针对污染物共代谢降解微生物的传统筛选方法操作复杂、费时费力、使用化学试
剂等问题，本发明提出了一种基于高光谱技术的bdab共代谢降解菌的快速筛选方法，能够简单、快速的筛选固体培养基中bdab共代谢降解菌。本发明鉴于bdab在近红外光谱区段的吸收特征，对固体培养基中bdab的浓度进行快速、无损检测。根据固体培养基中，菌落下方bdab浓度的变化，间接预测微生物对bdab的降解能力，对bdab降解菌进行快速筛选。
6.本发明基于高光谱技术对固体培养基中的bdab含量进行预测，间接判断未知菌落对bdab的降解能力。本发明方法能够简单快速的对固体培养基中bdab共代谢降解菌进行筛选，解决目前微生物领域筛选bdab共代谢降解菌耗时耗力、低效，消耗化学试剂等问题，为bdab共代谢降解菌筛选过程提供相应技术指导。
7.本发明技术方案如下：
8.基于高光谱技术的苯扎溴铵共代谢降解菌的快速筛选方法，包括以下步骤：
9.步骤1，配置不同浓度bdab的固体培养基模拟样本作为建模样本；
10.步骤2，采集步骤1中建模样本的高光谱图像；
11.步骤3，为抑制光谱信息的空间波动对预测模型的影响，建模过程中，通过设置不同感兴趣区域(roi)划分方式，提取高光谱图像在每个roi划分方式下获得的多个光谱样本的平均光谱；
12.步骤4，将得到的光谱样本划分训练集和验证集，对光谱样本的平均光谱进行预处理同时展开特征波长分析并提取特征向量；
13.步骤5，将全波长和提取到的特征波长所对应的训练集光谱样本分别与bdab浓度对应，建立固体培养基中bdab浓度的偏最小二乘(pls)预测模型；
14.步骤6，从待测环境中采集菌样，富集培养后涂布于固体培养基，培养得到生长菌落的实际样本，培养结束后，去掉培养基表层的菌落，并采集其高光谱图像，去掉的菌落分别进行保存，等待后续筛选；所述实际样本是指，培养有待筛选的未知菌落、且含有bdab的固体培养基；
15.步骤7，提取菌落作用后的培养基与其附近无菌落作用培养基的光谱，分别作为菌落作用光谱和参照光谱，并用步骤5中的预测模型进行bdab预测，计算菌落作用区域与其附近无菌落作用区域的bdab浓度的差值，称为有菌差值；
16.步骤8，采集步骤6中所述培养基上无菌落作用区域的光谱及其附近无菌落区域的光谱，分别作为无菌落作用光谱和参照光谱；利用步骤5中的预测模型进行预测，计算无菌落作用区域与其其附近无菌落区域的bdab的浓度差，作为培养基的空白对照，称为无菌差值；
17.步骤9，根据步骤7和步骤8中有菌差值和无菌差值的大小，间接推断固体培养基上未知菌落对bdab是否有降解作用；若步骤7中的有菌差值大于步骤8中的无菌差值，说明该区域对应菌落对bdab具有降解作用，菌落为bdab共代谢降解菌。
18.步骤10，筛选步骤6中保存的菌落，根据步骤9中对菌落的判定结果，保留步骤6中为bdab共代谢降解菌的菌落后将菌落反复分离纯化，得到数种bdab共代谢降解菌的纯培养物。
19.进一步的，步骤2中，样本采集光谱前需做以下处理：将固体培养基剥离出培养皿后，将其底部紧密贴合于聚四氟乙烯平板上，同时培养基侧面覆盖不透光的黑色绝缘胶带；采集光谱时将载有固体培养基的聚四氟乙烯平板放入光谱仪的载物台上。
20.进一步的，步骤7中，参照光谱的选择方法如下：1)选取菌落周边没长菌且形态大小和菌落作用区域类似的区域，记为中间区域，提取该区域的平均光谱，记作中间光谱(center spectrum,cs)。2)提取与中间区域大小形状一致，位于中间区域的前、后、左、右方向的四个区域的平均光谱，各区域光谱标记为前方光谱(front spectrum,fs)、后方光谱(backspectrum,bs)、左方光谱(leftspectrum,ls)、右方光谱(right spectrum,rs)，分别计算fs和bs，ls和rs，以及fs、bs、ls、rs的平均光谱，其中，fs和bs的平均光谱记为fbs，ls和rs的平均光谱记为lrs，fs、bs、ls、rs的平均光谱记为fblrs。度量fs、bs、ls、rs、fbs、lrs、fblrs与cs之间的相似程度，与cs的相似度最高的光谱选定为参照光谱，其对应区域为参照区域。
21.进一步的，步骤8中的参照光谱的选择方法同步骤7。
22.本发明的效果和益处：与传统的筛菌方法相比，基于高光谱的检测方法无需将大量菌落逐一转接至液体培养基中培养富集纯化，耗时短、效率高，提高了筛选共代谢降解菌的速度和正确率，也降低了化学试剂的使用，较少环境压力。
附图说明
23.图1为本发明提供的基于高光谱技术的苯扎溴铵共代谢降解菌的快速筛选方法流程图；
24.图2为本发明提供的建模样本和实际样本光谱采集过程示意图；
25.图3为本发明提供的建模样本的roi划分方式：(a)40
×
50像素点(b)20
×
50像素点(c)12
×
50像素点(d)8
×
50像素点；
26.图4为本发明实施例提供的实际样本示意图：(a)菌落作用区域和无菌落作用区域示意图(b)参照光谱选择过程示意图；
27.图5为本发明实施例提供的模型对培养基上两种bdab共代谢降解菌的预测结果示意图：(a)rqr-1有菌差值(b)bdab-1有菌差值。
具体实施方式
28.以下结合技术方案和附图，详细叙述本发明的具体实施方式。
29.基于高光谱技术的bdab共代谢降解菌的快速筛选方法，其整体流程如图1所示。
30.本实施例选取bdab为底物，以葡萄糖为共代谢基质，对固体培养基中的bdab共代谢降解菌进行筛选。具体步骤如下：
31.(1)建模样本的制备
32.设置一批模拟固体培养基样品作为建模样本，用于预测实际样本固体培养基的bdab浓度。建模样本培养基组成如下(每升)：7.4g k2hpo4，3.0g nah2po4，0.50g nacl，1.0g nh4cl，0.25g mgso4·
7h2o，0.01g cacl2，若干含量的葡萄糖和bdab。
33.调整固体培养基bdab含量，使bdab的浓度梯度为60、100、160、200、240、280、320、360mg/l。在每个bdab浓度下设置5个不同葡萄糖浓度的样本，葡萄糖浓度梯度为100、200、300、400和500mg/l。在上述培养基中加入琼脂粉，制成建模样本固体培养基，琼脂粉浓度为20g/l。bdab在经滤膜过滤后再加入到灭菌后的液体培养基中。建模样本制备好后不接种菌株，不进行培养，最后剩下30个建模样本。
34.(2)高光谱图像采集
35.使用近红外系统，从近红外900-1700nm(172个光谱波段)范围内获取建模样本的高光谱数据。建模样本的高光谱图像采集过程如图2所示。光谱仪与样本之间的距离设定为120mm。移动平台速度为12.5mm/s，扫描方式为线扫描，曝光时间设定为0.82ms。整个hsi系统在一个金属黑箱中运行，以减少外界光线的干扰。为最大限度地减少光强不均的干扰，将培养基从培养皿中轻轻剥离，使培养基贴合于聚四氟乙烯平板上，用黑色绝缘胶带包裹培养基外围，最后将载有培养基的聚四氟乙烯平板放置于光谱仪载物台进行高光谱图像采集，采集后的光谱进行黑白矫正。
36.(3)模型的建立
37.为了抑制培养基光谱不均问题，针对建模样本，本发明采用四种roi划分方式，分别是40
×
50像素(2000像素点，600个样本)，20
×
50像素(1000像素点，1200个样本)，12
×
50像素(600像素点，2500个样本)，和8
×
50像素(400像素点，3200个样本)的方形区域，并提取光谱信息。上述roi划分方式如图3所示。根据spxy算法按3:1的比例将样本集分为训练集和验证集。使用三点移动平滑作为预处理方法，rc和cars算法筛选特征波长。使用plsr建立模型，并确定最佳模型。
38.(4)实际样本的制备与采集
39.实际样本培养基组成如下(每升)：7.4g k2hpo4，3.0g nah2po4，0.50g nacl，1.0g nh4cl，0.25g mgso4·
7h2o，0.01g cacl2，0.5g c6h
12
o6，0.1gbadb。同样的，培养基中加入琼脂粉，制成固体培养基，琼脂粉浓度为20g/l。bdab在经滤膜过滤后再加入到灭菌后的液体培养基中。从环境中采集、富集、培养菌样后，将菌液按一定比例稀释后涂布于固体培养基，培养得到生长有未知的待筛选菌落的实际固体培养基样本。实际样本光谱采集过程如图2所示。实际样本的光谱采集前将实际样本固体培养基表面的菌落人工移除，移除的菌落分别进行保存等待筛选。后续步骤同步骤(2)。
40.(5)参照光谱的选择
41.为了减轻不均匀的光谱分布对模型预测实际样本的影响，本发明提出将实际样本中菌落下方的区域(菌落作用区域)与其周围无菌落作用区域进行比较，周围无菌落作用区域称为“参照培养基”，对应的平均光谱为“参照光谱”。参照光谱的选取方法如下：1)选取菌落周边没长菌且形态大小和菌落作用区域类似的区域，记为中间区域，提取该区域的平均光谱，记作中间光谱(center spectrum,cs)。2)提取与中间区域大小形状一致，位于中间区域的前、后、左、右方向的四个区域的平均光谱，各区域光谱标记为前方光谱(front spectrum,fs)、后方光谱(backspectrum,bs)、左方光谱(leftspectrum,ls)、右方光谱(right spectrum,rs)。各区域的选择过程如图4所示。分别计算fs和bs，ls和rs，以及fs、bs、ls、rs的平均光谱，其中fs和bs的平均光谱记为为fbs，ls和rs的平均光谱记为lrs，fs、bs、ls、rs的平均光谱记为fblrs。通过欧式距离衡量fs、bs、ls、rs、fbs、lrs、fblrs与cs之间的相似程度，与cs的欧式距离最小的光谱选定为参照光谱，其对应区域为参照区域。
42.(6)实际固体培养基样本bdab浓度的预测
43.利用建模样本得到的plsr模型预测菌落作用区域光谱及其参照光谱的bdab浓度，并计算菌落作用区域与参照区域bdab浓度的差值，作为有菌差值。采集培养基上无菌落作用区域及其附近无菌落区域的光谱(参照光谱)，无菌落作用区域的参照光谱选取方式同步
骤(5)。无菌落作用区域选取的roi的形态大小与菌落作用区域类似，计算无菌落作用区域与其参照区域的bdab浓度差，作为培养基的空白对照(无菌差值)。
44.(7)bdab共代谢降解菌的筛选
45.通过有菌差值和无菌差值的比较，来鉴别菌落对bdab的降解情况。原则上，无菌差值在0附近波动，有菌差值大于无菌差值，说明对应菌落为bdab共代谢降解菌，将判定为bdab共代谢降解菌的菌落保留同时进行反复分离纯化，得到上述众多bdab共代谢降解菌的纯培养物，实现bdab共代谢降解菌的筛选。
46.利用两种名为rqr-1和bdab-1的bdab共代谢降解菌，对本发明提供的方法进行验证。结果如图5所示，无菌差值在零附近小范围内波动，共代谢降解菌rqr-1和bdab-1的有菌差值皆明显大于无菌差值(p《0.05)，证明利用该发明提供的方法，bdab共代谢降解菌可以被识别出来并可对识别出的bdab共代谢降解菌培养纯化，实现bdab共代谢降解菌的筛选。