用于预测阴沟肠杆菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法与流程

1.本发明涉及基因测序技术，具体说，是一种用于预测阴沟肠杆菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法。


背景技术：

2.阴沟肠杆菌广泛分布于自然界中，是肠道正常菌群之一，属于条件致病菌。当机体免疫功能低下或长期应用抗菌药物造成机体菌群失调时，易导致阴沟肠杆菌感染，引起呼吸道、伤口、胆管、泌尿道感染及败血症等，近年来已成为医院内感染的重要致病菌之一。
3.阴沟肠杆菌的耐药机制十分复杂，可同时产ampc酶、超广谱β-内酰胺酶(esbls)及碳青霉烯酶，从而导致多重耐药，引起难治性感染。近年来，随着广谱抗菌药物、免疫抑制剂等大量而不合理的使用，阴沟肠杆菌的感染率不断增加，给临床治疗带来极大困扰，且耐药株的不断出现也引起了医学界的广泛关注。目前阴沟肠杆菌耐碳青霉烯类的耐药基因以kpc-2、ndm-1、imp-4为主。阴沟肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制主要包括由染色体介导的药物作用靶位改变、外膜孔蛋白通透性下降、外排泵主动外排和由质粒介导的耐药机制。染色体介导的喹诺酮类耐药只能垂直传播,由亲代传给子代,不易在不同菌株间发生播散,传播速度较慢。而临床资料表明,阴沟肠杆菌对喹诺酮类耐药的上升速度很快,可能存在由可移动元件如质粒介导的耐药基因的水平转移。近年来的研究发现,质粒介导的喹诺酮类耐药(plasmid mediated quinolone resistance,pmqr)由三类基因qnr、qepa和aac(6’)-ib-cr参与,是细菌对喹诺酮类药物耐药的新机制。然而，针对不同抗生素，文献中已有报道的耐药相关基因多达数十至数百种，其中有些基因对耐药表型并不相关或贡献度小，对药敏表型判断造成了误导。研究证实，通过现有权威耐药基因数据库resfinder和card中收录的耐药基因来预测耐药表型，准确率仅有66％和52％(doi:10.1093/jac/dkaa257)。
4.目前针对阴沟肠杆菌的耐药性检测可分为表型检测和基因型检测方法。在表型检测方面，临床的主要方法是微生物培养 药敏实验，该方法存在培养时间长，培养阳性率低等局限性，而无法完全满足临床精准治疗的需求。在基因检测方面，主要是针对特定、有限的耐药基因进行检测，该检测内容较单一，并不能反应真实的药敏结果。因此亟需寻找一种快速，不依赖于培养，且准确性高的检测临床常用抗生素药敏表型的方法以指导临床精准治疗。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于预测阴沟肠杆菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法，可一次性分析亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星4种抗生素耐药情况，具有较好的准确率、敏感度和特异性。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于预测阴沟肠杆菌对抗生素药敏表型的特征基因组合，抗生素为亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星中
的一种或几种组合，
7.预测阴沟肠杆菌对亚胺培南药敏表型的特征基因组合包括ndm-1、nmcr、kpc-2、kpc-4、kpc-6、kpc-3、imp-4、imp-8、imp-70和vim-1，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
8.预测阴沟肠杆菌对美罗培南药敏表型的特征基因组合包括ndm-1、nmcr、nmca、tem-54、kpc-3、kpc-2，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
9.预测阴沟肠杆菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因包括ecl_parc:250(g-》a)、ecl_parc:239(g-》t)和qnrb17，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
10.预测阴沟肠杆菌对左氧氟沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因包括ecl_gyra:248(c-》a)、ecl_gyra:248(c-》t)和qnrb17，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若检测结果为阳性，推测为耐药。
11.优选，所述预测阴沟肠杆菌对亚胺培南药敏表型的特征基因组合还包括act-45、tem-54、oxa-1基因。
12.优选，所述预测阴沟肠杆菌对美罗培南药敏表型的特征基因组合还包括kpc-4、kpc-6、act-45基因。
13.优选，所述预测阴沟肠杆菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点还包括ecl_gyra:260(a-》c)。
14.优选，所述预测阴沟肠杆菌对左氧氟沙星药敏表型的特征基因突变位点还包括ecl_gyra:260(a-》c)。
15.含有上述用于预测阴沟肠杆菌对抗生素药敏表型的特征基因组合检测试剂的试剂盒。
16.采用上述试剂盒对阴沟肠杆菌进行药敏表型预测的测序方法，采用全基因组测序方法或宏基因组测序方法。
17.本发明的有益效果是：本发明是基于核酸分子检测耐药的方法，可不依赖于细菌培养，直接针对临床标本或其他方式取得的少量阴沟肠杆菌基因组核酸进行检测，并根据本发明提供的特征基因组合预测其药敏表型，相比传统方法具有检测周期短，检测灵敏度高的特点。
附图说明
18.图1是用于亚胺培南药敏表型预测的特征基因在公共数据库下载的阴沟肠杆菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
19.图2是用于美罗培南药敏表型预测的特征基因在公共数据库下载的阴沟肠杆菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
20.图3是用于环丙沙星药敏表型预测的特征基因在公共数据库下载的阴沟肠杆菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)
图。
21.图4是用于左氧氟沙星药敏表型预测的特征基因突变位点在公共数据库下载的阴沟肠杆菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.本发明的用于预测阴沟肠杆菌对抗生素药敏表型的特征基因组合，抗生素为亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星中的一种或几种组合，
24.预测阴沟肠杆菌对亚胺培南药敏表型的特征基因组合包括ndm-1、nmcr、kpc-2、kpc-4、kpc-6、kpc-3、imp-4、imp-8、imp-70和vim-1，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
25.预测阴沟肠杆菌对美罗培南药敏表型的特征基因组合包括ndm-1、nmcr、nmca、tem-54、kpc-3、kpc-2，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
26.预测阴沟肠杆菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因包括ecl_parc:250(g-》a)、ecl_parc:239(g-》t)和qnrb17，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
27.预测阴沟肠杆菌对左氧氟沙星药敏表型的特征基因突变位点和特征基因包括ecl_gyra:248(c-》a)、ecl_gyra:248(c-》t)和qnrb17，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若检测结果为阳性，推测为耐药。
28.优选，所述预测阴沟肠杆菌对亚胺培南药敏表型的特征基因组合还包括act-45、tem-54、oxa-1基因。
29.优选，所述预测阴沟肠杆菌对美罗培南药敏表型的特征基因组合还包括kpc-4、kpc-6、act-45基因。
30.优选，所述预测阴沟肠杆菌对环丙沙星药敏表型的特征基因突变位点还包括ecl_gyra:260(a-》c)。
31.优选，所述预测阴沟肠杆菌对左氧氟沙星药敏表型的特征基因突变位点还包括ecl_gyra:260(a-》c)。
32.含有上述用于预测阴沟肠杆菌对抗生素药敏表型的特征基因组合检测试剂的试剂盒。
33.采用上述试剂盒对阴沟肠杆菌进行药敏表型的测序方法，采用全基因组测序方法或宏基因组测序方法。
34.下面结合具体的检测方法和效果对比，对本发明进行详细说明：
35.实施例1用特征组合对公共数据库中阴沟肠杆菌的药敏表型进行预测
36.1.1数据收集：从公共数据库(ncbi ndaro数据库和patric数据库)下载817株阴沟
肠杆菌基因组信息及其对应抗生素药敏表型数据。其中亚胺培南(英文缩写imipenem)耐药株99株，敏感株59株；美罗培南(英文缩写meropenem)耐药株77株，敏感株70株；环丙沙星(英文缩写ciprofloxacin)耐药株68株，敏感株279株；左氧氟沙星(英文缩写levofloxacin)耐药株65株，敏感株100株。
37.1.2耐药基因及突变检测：用ncbi-blast(v2.9.0 )软件将组装好的基因组序列与耐药数据库进行比对(参数：-evalue 1e-5
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num_alignments 10000)，进行上述耐药基因和突变位点检测。对于基因有无特征，与该耐药基因的参考序列的比对一致率高于90％且覆盖率高于60％，则认为有该耐药基因检出。对于基因突变特征，若比对上该耐药基因的序列支持该突变位点，则认为有该突变检出。
38.1.3统计各阴沟肠杆菌的菌株中耐药基因和突变的检出情况。
39.1.4药敏结果预测：对于某一株菌的任一种抗生素的药敏预测，检测出特征组合中的任一种特征，则认为该菌株对该抗生素表型耐药；否则，则判断为敏感。如图1-图4所示，亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星四种模型中，通过各菌株中的检出的特征预测得到的药敏结果，和实际药敏表型高度一致。预测性能如表1所示，特征组合预测亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星的药敏表型准确率分别为0.835、0.823、0.942、0.891，特异性和敏感度也在较高的水平。各耐药特征的特征检出样本数、表型耐药样本数和阳性预测值(阳性预测值＝表型耐药样本数/特征检出样本数)见表2。上述结果说明，利用上述特征组合，对阴沟肠杆菌表型耐药和表型敏感有较好的区分效果。
40.表1.预测公共数据库来源菌株的药敏表型的性能
[0041][0042][0043]
表2.特征基因和突变在公共数据库来源的菌株中的检出频数
[0044]
[0045]
[0046][0047]
实施例2用优选的重要特征组合对公共数据库中阴沟肠杆菌的药敏表型进行预测2.1综合实施例1中各特征的检出频率、阳性预测值和特征间共同检出关系，选择ndm-1、nmcr、kpc-2、kpc-4、kpc-6、kpc-3、imp-4、imp-8、imp-70和vim-1基因有无作为亚胺培南的重要特征组合，选择oxa-23、adc-30、adc-162、adc-56基因有无作为头孢他啶的重要特征组合，选择ecl_parc:250(g-》a)、ecl_parc:239(g-》t)和qnrb17基因突变位点和基因有无作为环丙沙星的重要特征组合，选择ecl_gyra:248(c-》a)、ecl_gyra:248(c-》t)和qnrb17基因突变位点和基因有无作为左氧氟沙星的重要特征组合。
[0048]
2.2针对实施例1中下载的阴沟肠杆菌菌株，根据1.2得出的特征检出结果，对3.1所述优选特征进行统计。
[0049]
2.3检测出优选特征组合中的任一种特征，则认为该菌株对该抗生素表型耐药；否则，则判断为敏感。如表3所示，利用优选的耐药特征预测药敏表型有着较好的准确率、灵敏
度和特异性。可见，利用优选的特征组合也可以较好的预测公共数据库中下载的阴沟肠杆菌的药敏表型。
[0050]
表3.利用优选特征组合预测公共数据库来源菌株的药敏表型的性能
[0051][0052]
实施例3用优选的重要特征组合对临床标本中的阴沟肠杆菌进行药敏表型预测
[0053]
3.1样本采集：从某医院采集了培养结果为阴沟肠杆菌阳性，且进行了药敏测试的临床标本1例，包括肺泡灌洗液。
[0054]
3.2样本高通量测序测序：对样本进行dna提取、通过qubit检测，确认dna质量可以满足后续测序要求，对提取的dna进行文库建库及高通量测序(illumina nextseq 550 se75)。
[0055]
3.3测序数据指控：使用fastp(v0.19.5)软件对得到的原始fastq序列数据进行过滤(参数设置：-q 15-u 40-l read_length*0.67),去除低质量序列和过短序列；同时使用komplexity(v0.3.6)软件计算序列信息复杂度(参数设置：-f-t0.4)，并过滤掉低复杂度的序列。
[0056]
3.4人源序列去除：将质控过滤得到的clean序列，使用bowtie2(v2.3.4.3)软件进行与人参考基因组序列(human_38)进行比对(参数设置：
‑‑
mm
‑‑
very-sensitive-k1)，以过滤掉人源序列。
[0057]
3.5物种注释：使用minimap2软件(v2.17)将illumina reads序列与以上设定的目标病原参考基因组序列库(来源于ncbi genome数据库)进行比对(比对参数：-xsr-a
‑‑
secondary＝no-l))，并采用lca算法进行物种注释统计，最后统计检出阴沟肠杆菌的序列数和基因组覆盖度。
[0058]
3.6耐药特征检测：使用blastn(版本2.9.0 )软件将reads序列与耐药基因参考序列进行比对。对于基因有无特征，参考序列的比对一致率高于90％的reads大于1条，则认为有该耐药基因检出。对于耐药基因突变特征，针对某一突变位点，如果支持该突变位点的reads比例大于0.2，则认为有该突变检出。
[0059]
3.7药敏表型预测：用2.1所述的各抗生素的重要特征组合对临床标本中阴沟肠杆菌对各抗生素的药敏表型进行预测。针对某一个抗生素，有任一重要特征检出，则认为阴沟肠杆菌对该抗生素耐药；否则，阴沟肠杆菌对该药敏感。当检出的基因组覆盖度小于一定比例且没有耐药特征检出时，由于不能确定该特征是否存在(特征可能存在于未覆盖的区域)，因此无法给出预测。表4为部分临床标本统计结果：
[0060]
表4.部分临床标本的检测信息
[0061][0062]
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。