剂相互作用效应确定的制作方法

1.本发明一般涉及确定剂混合物对细胞群体的剂相互作用效应。


背景技术：

2.无论两种或更多种生物活性化合物同时出现在哪里，都可能存在化合物相互作用效应。当化合物混合物的组合效应高于(正协同作用)或低于(负协同作用、拮抗作用)对单独化合物的独立作用(相加作用)的预期时，化合物相互作用。几种具有正协同作用的化合物因此可物理结合以使某种生物活性增至最大。相反，可能期望具有负协同作用的其他化合物在物理上单独作用以避免混合物中发生活性抑制。
3.组合效应和协同优化在生物医药领域尤为重要。两种或更多种药物的组合治疗越来越多地用于治疗癌症和传染病，例如细菌、病毒或真菌传染病。与单一药物治疗相比，组合治疗是有利的，因为其增加治疗效率并减少耐药性演变。组合治疗的功效与药物的生理相互作用相关，其既可产生优选的正协同作用，也可产生拮抗作用。
4.随着抗生素耐药性的蔓延，抗生素的协同组合越来越多地被用作一线治疗选择。抗生素组合疗法能够有效治疗复杂的细菌感染，包括那些具有耐药性和异质耐药性细菌的感染，并且已经证明所述组合疗法可降低死亡率并加速患者康复。然而，最近的数据表明，药物相互作用在物种与临床分离株之间可能会有所不同[1]，因此仔细诊断对于治疗成功至关重要。
[0005]
协同作用量化需要测量几种化合物的单独和组合效应。一个困难是协同作用通常可在狭窄的浓度窗口(s形剂量反应曲线的陡峭区域)中最好地量化，根据生物样品的不同，所述浓度窗口可能会移动几个数量级。抗生素协同作用的定量量度是所谓的分数抑制浓度指数(fici)。两种抗生素a和b的fici定义为ca/mica cb/micb，其中mic
a/b
是纯a或b的最小抑制浓度，并且ca/b表示a b的产生mic的混合物中抗生素a或b的浓度。最小抑制浓度(mic)是阻止样品生长的化合物的最小浓度。
[0006]
协同作用量化的标准方法是二维肉汤微量稀释，其中两种化合物的几个离散浓度组合在一个全因子网格(棋盘)中，通常为9
×
9或8
×
12浓度。一旦产生浓度网格，就添加细胞样品并在设定的孵育时间期间或之后测量生物反应。已开发出简化的棋盘测定，用于三种或更多种药物之间的协同作用量化[2]。
[0007]
已开发出协同作用量化的替代解决方案用于半固体琼脂表面上的皮氏培养皿(petri dish)培养物。常规使用浸渍有抗生素或其他化合物的纸盘进行抗微生物药敏试验(ast)。这些盘放置在接种有细胞样品的琼脂表面上。化合物从盘扩散到周围的琼脂中会产生浓度梯度，并且细胞样品只能生长到mic，从而留下特征抑制区。当几个具有不同药物的盘靠近放置时，协同作用会使抑制区的形状变形。因此，ast盘的排列已被用于定性协同作用检测[3]。类似的方法使用涂覆有化合物浓度梯度的纸或塑料条，所述浓度梯度以定义的方式扩散到琼脂中[4,5]。抑制区的扩大表示正协同作用；缩窄表示拮抗作用。通常，这些方法仅提供定性信息，而不提供协同作用的任何定量信息，诸如fici值。
[0008]
协同作用可使用条交叉形成来量化，其中两个条以90
°
角放置，并且测试条在mic点处相互交叉[6]。抗生素测试条交叉形成的一个缺点是其需要多个步骤。由于测试条需要在mic点上相互交叉，因此需要从先前的测定中知道细胞样品的mic。第三种解决方案是使用封闭的琼脂扩散室[7]，在所述扩散室中接种的琼脂表面被划分为较小的区域，在所述区域中扩散建立了均匀的浓度。扩散室使得能够对琼脂板中的离散浓度和化合物混合物进行棋盘式测试。
[0009]
因此，仍然需要一种快速且简单的用于协同作用量化和优化的方法，所述方法可用于临床诊断，并适用于广泛的生物活性化合物。


技术实现要素：

[0010]
本发明的一般目的是确定剂混合物对细胞群体的剂相互作用效应。
[0011]
这个和其他目的通过如本文所公开的实施方案来满足。
[0012]
本发明由独立权利要求限定。在从属权利要求中限定本发明的其他实施方案。
[0013]
本发明的一个方面涉及一种用于确定对细胞群体的剂相互作用效应的方法。所述方法包括将细胞培养基质添加到培养容器中，所述培养容器包括在相对于彼此的预定位置处的n个剂贮存器。n个剂贮存器中的每个剂贮存器包含一种剂，n个剂贮存器包围组合区域，并且n为等于或大于三的整数。所述方法还包括将细胞群体放置在细胞培养基质上和/或其中，并且在细胞培养基质上和/或其中培养细胞群体预定时间段，同时n个剂贮存器中的剂扩散通过细胞培养基质，并且在组合区域内的细胞培养基质中形成至少部分重叠的剂浓度梯度，并在n个剂贮存器的外边界外围的细胞培养基质中形成基本上不重叠的剂浓度梯度。所述方法还包括，针对n个剂贮存器中至少两个相邻剂贮存器中的每个剂贮存器，确定基本上没有任何细胞群体生长的抑制区的抑制终点。抑制终点定位在剂贮存器外边界的外围。所述方法另外包括，针对所述至少两个相邻剂贮存器确定包括细胞群体的生长的生长区在具有所述至少两个相邻剂贮存器中所含的剂的至少部分重叠的剂浓度梯度的组合区域内的生长终点。所述方法还包括基于抑制终点和生长终点确定所述至少两个相邻剂贮存器中所含的剂之间的剂相互作用效应。
[0014]
本发明的另一方面涉及一种培养容器插入物，其包括具有中心n边形开口的圆形底板和附接到圆形底板的圆周的圆形壁。培养容器插入物还包括附接到圆形壁和圆形底板并包围中心n边形开口的n个弦杆壁。圆形底板、圆形壁和每个弦杆壁限定剂贮存器，并且n为等于或大于三的整数。
[0015]
本发明的一个相关方面定义了一种培养容器，所述培养容器包括底盘、附接到底盘的圆周壁和根据上文的培养容器插入物，所述培养容器插入物定位在培养容器中，其中圆形底板放置在底盘上并且圆形壁与圆周壁隔开。
[0016]
本发明的另一方面涉及一种培养容器，其包括底盘、附接到底盘的圆周壁和附接到底盘并且被圆周壁包围并与圆周壁隔开的圆形壁。培养容器还包括附接到圆形壁和底盘并包围底盘的n边形部分的n个弦杆壁。底盘、圆形壁和每个弦杆壁限定剂贮存器，并且n为等于或大于三的整数。
[0017]
本发明的又一方面涉及一种用于确定对细胞群体的剂相互作用效应的试剂盒。所述试剂盒包括根据上述的培养容器和一定体积的细胞培养基质凝胶，所述细胞培养基质凝
胶被配置为添加到培养容器中并使其固化成细胞培养基质。n个剂贮存器中的每个剂贮存器包含相应的剂并且n个剂贮存器包围组合区域。所述试剂盒还包括在将细胞群体放置在细胞培养基质上和/或其中预定时间段后拍摄细胞培养基质的至少一张照片的说明。n个剂贮存器中的剂扩散通过细胞培养基质，并且在组合区域内的细胞培养基质中形成至少部分重叠的剂浓度梯度，并在n个剂贮存器上的外边界外围的细胞培养基质中形成基本上不重叠的剂浓度梯度。所述试剂盒还包括从所述至少一张照片并针对n个剂贮存器中的每个剂贮存器确定基本上没有任何细胞群体生长的抑制区的抑制终点的说明。抑制终点定位在剂贮存器的外围。所述试剂盒还包括从所述至少一张照片并针对n个剂贮存器中的两个相邻剂贮存器的每种组合确定包括细胞群体的生长的生长区在具有至少两个相邻剂贮存器中所含的剂的至少部分重叠的剂浓度梯度的组合区域内的生长终点的说明。所述试剂盒还包括定义n个剂贮存器中所含的剂相对于细胞培养基质的扩散系数的信息。所述试剂盒还包括针对两个相邻剂贮存器的每种组合，基于针对两个相邻剂贮存器确定的抑制终点、针对两个相邻剂贮存器确定的生长终点和定义扩散系数的信息，确定两个相邻剂贮存器中所含的剂之间的剂相互作用效应的说明。
[0018]
本发明的另一方面涉及一种包括指令的计算机程序，当由至少一个处理器执行时，所述指令使所述至少一个处理器提供图像数据，所述图像数据表示在将细胞群体放置在细胞培养基质上和/或其中之后的预定时间段拍摄的培养容器中细胞培养基质的至少一张照片。培养容器包括在相对于彼此的预定位置处的n个剂贮存器。n个剂贮存器中的每个剂贮存器包含一种剂。n个剂贮存器包围组合区域，并且n为等于或大于三的整数。n个剂贮存器中的剂扩散通过细胞培养基质，并且在组合区域内的细胞培养基质中形成至少部分重叠的剂浓度梯度，并在n个剂贮存器上的外边界外围的细胞培养基质中形成基本上不重叠的剂浓度梯度。所述指令还使所述至少一个处理器基于图像数据并针对n个剂贮存器中至少两个相邻剂贮存器中的每个剂贮存器确定基本上没有任何细胞群体生长的抑制区的抑制终点。抑制终点定位在剂贮存器外边界的外围。所述指令进一步使所述至少一个处理器基于图像数据并针对所述至少两个相邻剂贮存器确定包括细胞群体的生长的生长区在具有所述至少两个相邻剂贮存器中所含的剂的至少部分重叠的剂浓度梯度的组合区域内的生长终点。所述指令另外使所述至少一个处理器基于抑制终点和生长终点确定所述至少两个相邻剂贮存器中所含的剂之间的剂相互作用效应。
[0019]
本发明的一个相关方面定义了一种计算机可读存储介质，其包括根据上述的计算机程序。
[0020]
本发明使得能够在单个实验和单个培养容器中量化剂组合的相互作用效应，诸如协同作用或拮抗效应。本发明不仅提供任何此类剂相互作用的定性信息，而且还使得能够量化剂相互作用。
附图说明
[0021]
通过参考以下结合附图进行的描述可最好地理解所述实施方案以及其另外的目的和优点，在附图中：
[0022]
图1以仰视图(上)、侧视图(中)和俯视图(下)示意性地说明了根据实施方案的培养容器插入物。
[0023]
图2示意性地说明了包括培养容器插入物(上)、在添加细胞培养基质之后(中)和铺板细胞培养物之后(下)的培养容器。
[0024]
图3示意性地说明了根据一个实施方案的培养容器。
[0025]
图4示意性地说明了根据另一个实施方案的培养容器插入物。
[0026]
图5示意性地说明了根据另一实施方案的培养容器插入物。
[0027]
图6示意性地说明了根据又一实施方案的培养容器插入物。
[0028]
图7示意性地说明了根据一个实施方案的培养容器插入物。
[0029]
图8示意性地说明了根据另一个实施方案的培养容器插入物。
[0030]
图9是拍摄具有培养容器插入物的培养容器的照片，示出了细胞培养基质中定位在剂贮存器的外围的抑制区。
[0031]
图10是拍摄具有培养容器插入物的培养容器的照片，示出了在培养容器插入物的中心部分的组合区域中细胞培养基质中的生长区。
[0032]
图11是显示出根据本发明测定的三种剂a、b和c的分数抑制浓度指数(fici)的图。
[0033]
图12是根据一个实施方案的说明一种用于确定对细胞群体的剂相互作用效应的方法的流程图。
[0034]
图13是根据一个实施方案的说明图12所示的方法的另外的任选步骤的流程图。
[0035]
图14是根据一个实施方案的说明图12所示的方法的另外的任选步骤的流程图。
[0036]
图15是根据另一个实施方案的说明图12所示的方法的另外的任选步骤的流程图。
[0037]
图16示意性地说明了根据一个实施方案的计算机。
[0038]
图17说明了大肠杆菌参考菌株k12-mg1655的自身相互作用实验。8种抗生素amp、cip、ctx、gen、fof、nit、mec、tmp的所有自身相互作用的fici。条形表示3个生物重复的平均fici值和标准偏差(sd)。所有相互作用本质上都是相加的，并且通过单样本wilcoxon符号秩检验，无法检测到任何与fici＝1具有统计学上的显著差异的相互作用。
[0039]
图18说明了combiant
tm
测定的技术验证。(18a)大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的参考菌株中药物相互作用的量化。协同作用由分数抑制浓度指数(fici，平均值
±
sd，n＝10个重复)表示。(18b)测定精确度的分析。重复性表示为在同一天进行的测定的相对标准误差，虚线代表中值标准误差，并且点线代表上四分位数和下四分位数，n＝6个组合。再现性表示为天数之间fici的相对差异，虚线代表中值相对差异，并且点线代表上四分位数和下四分位数，n＝6个组合)。(18c)合并数据的变异系数(n＝10个重复)，涵盖不同天数和同一天的重复，以量化生物和技术可复制性。结果按抗生素相互作用分组，然后在三种菌株之间进一步细分。(18d)combiant
tm
和棋盘测定的bland-altman方法比较(平均值，n＝18个菌株-抗生素对组合)。将方法的fici的绝对差异针对其平均值作图。点的小分散表明两种方法之间的偏差很小。针对fici＝1的单样本wilcoxon符号秩检验，***p《0.001，**p《0.01，*p《0.05。
[0040]
图19说明了针对大肠杆菌参考菌株k12-mg1655的combiant
tm
uti抗生素相互作用。条形表示3个生物重复的平均fici值和标准偏差(sd)。点线表示fici＝1。针对fici＝1的单样本wilcoxon符号秩检验，****p《0.0001，***p《0.001，**p《0.01，*p《0.05。
[0041]
图20a至图20m说明了大肠杆菌uti临床分离株的相互作用筛选。由fici表示的抗生素相互作用(平均值
±
sd)。针对fici＝1的单样本wilcoxon符号秩检验，***p《0.001，**p
《0.01，*p《0.05。
[0042]
图21说明了combiant
tm
用于分析抗生素以外的生物活性化合物的用途。
[0043]
图22说明了combiant
tm
用于分析表达不同荧光蛋白的混合细菌样品的用途。
具体实施方式
[0044]
本发明一般涉及确定剂混合物对细胞群体的剂相互作用效应。
[0045]
本发明可用于研究和确定剂组合对细胞群体的相互作用效应。本发明可用于验证剂组合对细胞群体具有相互作用效应，也可用于量化相互作用效应的大小，即提供定性和定量信息。这意味着本发明可用于评估剂组合是否发挥协同效应、抑制或拮抗效应，或者实际上仅对细胞群体具有独立或相加效应，并且还可用于量化此种协同效应或抑制/拮抗效应。
[0046]
如本文所用，“剂”涉及可对细胞群体发挥效应的任何分子、化合物、组合物或其他剂，并且其中此种剂与另一种剂关于细胞群体的相互作用效应有待于确定。此类剂的典型但非限制性实例包括药物或药剂，包括药物候选物，并且其中不同药物或药剂的组合对细胞群体的相互作用是令人感兴趣的。例如，可能感兴趣的是查看不同药物或药剂的组合是否会对细胞群体发挥超出单纯相加效应的效应，即药物或药剂的组合是否具有比对单独药物或药剂的独立作用的预期更高或更大的效应，即协同效应。此外，可能感兴趣的是查看此种组合中的一种药物或药剂是否抑制另一种药物或药剂单独对细胞群体发挥的作用或效应，即确定是否存在任何拮抗效应。
[0047]
有几种疾病使用药物或药剂的组合或混合物来治疗，包括癌症患者化疗中的细胞抑制剂或化学治疗剂、细菌感染中的抗生素或抗微生物剂，以及此类病毒或真菌感染中的抗病毒或抗真菌剂的组合。
[0048]
剂不一定必须是药物或药剂，但可以是例如有毒物质、污染物、离子或其他化学物质，其中可能有兴趣确定剂是否对细胞群体具有任何交互效应。
[0049]
图12是根据一个实施方案的说明一种确定对细胞群体的剂相互作用效应的方法的流程图。下面参考图1、图2、图9和图10描述这种方法。所述方法开始于步骤s1，其包括将细胞培养基质50添加到培养容器10中，所述培养容器包括在相对于彼此的预定位置处的n个剂贮存器31、33、35。n个剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35包含一种剂，并且n个剂贮存器31、33、35包围组合区域41、43、45，如图10所示。根据此实施方案，参数n为等于或大于三的整数。
[0050]
所述方法还包括在步骤s2将细胞群体55放置在细胞培养基质50上和/或其中，并且在细胞培养基质50上和/或其中培养细胞群体55预定时间段，同时n个剂贮存器31、33、35中的剂扩散通过细胞培养基质50，并且在组合区域41、43、45内的细胞培养基质50中形成至少部分重叠的剂浓度梯度，并在n个剂贮存器31、33、35的外边界外围的细胞培养基质50中形成基本上不重叠的剂浓度梯度。
[0051]
所述方法还包括，在步骤s3中并针对n个剂贮存器31、33、35中至少两个相邻剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35，确定基本上没有任何细胞群体55的生长的抑制区60、62、64的抑制终点61、63、65。此抑制终点61、63、65定位在相对于剂贮存器31、33、35外边界的外围。
[0052]
所述方法还包括，在步骤s4中并针对至少两个相邻剂贮存器31、33、35确定包括细胞群体55的生长的生长区70、72、74在具有至少两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的剂的至少部分重叠的剂浓度梯度的组合区域41、43、45内的生长终点71、73、75。
[0053]
图12的步骤s3和s4可以任何顺序至少部分并行或串行进行，即步骤s3在步骤s4之前或步骤s4在步骤s3之前。
[0054]
所述方法还包括在步骤s5中基于抑制终点61、63、65和生长终点71、73、75确定至少两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的剂之间的剂相互作用效应。
[0055]
图12所示方法中使用的培养容器10可以是用于培养细胞的任何容器或装置，包括但不限于培养板、培养皿，诸如皮氏培养皿。
[0056]
在一个实施方案中，图12中的步骤s1包括将细胞培养基质凝胶添加到培养容器10中并且使细胞培养基质凝胶固化成细胞培养基质50。因此，在此实施方案中，将细胞培养基质凝胶倒入培养容器10中并使其固化成细胞培养基质50，在所述细胞培养基质上和/或其中可培养细胞群体55。
[0057]
细胞培养基质凝胶和细胞培养基质50可以是用于体外培养细胞的任何此类基质凝胶和基质。此类细胞培养基质50的非限制性但说明性的实例包括琼脂、琼脂糖、藻酸盐、细菌纤维素、水凝胶、聚-l-赖氨酸和纤连蛋白。
[0058]
在步骤s1中添加细胞培养基质凝胶的替代方法可以是将细胞培养基质50诸如多孔细胞培养基质50添加、浇铸或倾倒至培养容器10中，并且任选地使(多孔)细胞培养基质50在培养容器10中固化。事实上，可根据本发明使用可浇铸、聚合或以任何其他方式形成在培养容器10中的任何细胞培养基质10。
[0059]
在步骤s2中，将细胞群体55放置在细胞培养基质上和/或其中。在一个优选实施方案中，将细胞群体55放置在细胞培养基质50的表面51上并在细胞培养基质50的表面51上培养预定时间段。然后细胞群体55将在细胞培养基质50的表面51上形成二维(2d)培养物。在另一个实施方案中，可将细胞群体55至少部分地放置在细胞培养基质50中。这意味着细胞可在细胞培养基质50内部并且任选地至少部分地在细胞培养基质50的表面51上作为三维(3d)培养物生长。在此实施方案中，可将细胞群体55与细胞培养基质凝胶预混合，使得步骤s1和s2至少部分地并行进行。或者，可将细胞群体55在细胞培养基质凝胶固化成细胞培养基质50之前添加到细胞培养基质凝胶中。
[0060]
培养容器10包括n个包含相应剂的剂贮存器31、33、35。剂贮存器31、33、35相对于彼此布置在预定位置并且包围包括所谓的组合区域41、43、45的中心区域或窗口40。这些剂贮存器31、33、35可以是被配置成包含剂的任何贮存器、腔室或单元。剂贮存器31、33、35是开放式贮存器而不是封闭式贮存器，即没有任何锁或顶板。这意味着剂贮存器31、33、35对细胞培养基质50开放，如图2所示，以使剂贮存器31、33、35中所含的剂能够扩散通过细胞培养基质50，从而在细胞培养基质50中形成浓度梯度，其中剂浓度随着远离细胞培养基质50中的剂贮存器31、33、35而不断降低。
[0061]
剂从剂贮存器31、33、35的扩散以及剂贮存器31、33、35相对于彼此的位置意指细胞培养基质50的在相对于剂贮存器31、33、35的外边界外围的部分(即，细胞培养基质50的定位在剂贮存器31、33、35的外边界或限制与细胞培养基质50的外围之间的部分)基本上仅包含从剂贮存器31、33、35扩散的剂。例如，当沿着图9中所示的线80从剂贮存器31的外边界
朝向细胞培养基质50的外围行进时，存在剂贮存器31中所含的剂的浓度梯度，其中在剂贮存器31的外边界处的浓度较高，而在细胞培养基质50的外围处的剂浓度较低，或甚至浓度为零。此外，在细胞培养基质50的这部分，基本上没有剂从其他剂贮存器33、35扩散。因此，在细胞培养基质50的这部分，此类其他剂的浓度基本上为零。这意味着在细胞培养基质50的在相对于剂贮存器31、33、35外围的相应部分处，在细胞培养基质50中存在n个基本上不重叠的剂浓度梯度。
[0062]
剂贮存器31、33、35中的剂不仅在细胞培养基质50中外围扩散，而且还朝向具有组合区域41、43、45的中心窗口或部分40的中心15扩散。在细胞培养基质50的这个中心窗口或部分40中，剂将在组合区域41、43、45中形成至少部分重叠的剂浓度梯度。这意味着在给定的组合区域41中，两个相邻剂贮存器31、33的第一组合中所含的剂的剂浓度梯度将至少部分重叠，而在另一个组合区域43中，两个相邻剂贮存器33、35的第二组合中所含的剂的剂浓度将至少部分重叠。这意味着当每个剂贮存器31、33、35包含与其他剂贮存器31、33、35中的剂不同的剂时，每种组合区域41、43、45包括至少部分重叠的剂浓度梯度的独特组合。
[0063]
由于剂贮存器31、33、35的布置，细胞培养基质50的中心窗口或部分40将包括至少部分重叠的剂浓度梯度，而在剂贮存器31、33、35之外的细胞培养基质50的外围部分包括基本上不重叠的剂浓度梯度。
[0064]
剂贮存器31、33、35的外边界外围的细胞培养基质50的区域或部分包括相应的抑制区60、62、64。在抑制区60、62、64中，剂贮存器31、33、35中所含的剂浓度足够高以防止任何细胞群体55的生长。当从剂贮存器31、33、35朝向细胞培养基质50的外周行进时，此抑制区60、62、64的末端(即所谓的抑制终点61、63、65)代表剂贮存器31、33、35中所含的剂的可防止或抑制细胞群体55的生长的最低浓度。
[0065]
细胞培养基质50的中心窗口或部分40中的相应组合区域41、43、45包括相应生长区70、72、74，其包括细胞群体55的生长。每个此类生长区70、72、74包括在组合区域41、43、45内的终点，在所述终点细胞群体不再生长。介于细胞生长与没有细胞生长之间的这个终点构成了所谓的生长终点71、73、75。在这个点，相邻剂贮存器31、33、35中所含的两种剂的浓度组合足以防止或抑制细胞群体55的生长。
[0066]
然后可基于针对两种剂/剂贮存器31、33、35确定的抑制终点61、63、65并且基于针对组合区域41、43、45确定的生长终点71、73、75来确定两种剂之间的剂相互作用效应，在所述组合区域中两种剂的剂浓度梯度部分重叠。
[0067]
在一个实施方案中，所述方法包括如图13所示的两个另外的步骤。步骤s10在图12中的步骤s3之后进行并且包括针对至少两个相邻剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35，基于抑制终点61、63、65确定剂贮存器31、33、35中所含的剂相对于细胞群体的最小抑制浓度(mic)。图13中的步骤s11在图12中的步骤s4之后进行并且包括针对至少两个相邻剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35，基于生长终点71、73、75确定至少两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的剂的混合物中剂贮存器31、33、35中的剂的mic。
[0068]
然后所述方法继续到图12中的步骤s5。在此实施方案中，步骤s5包括基于mic确定分数抑制浓度指数(fici)。
[0069]
在特定实施方案中，步骤s5包括基于或优选等于ca/mica cb/micb确定fici。mica代表在步骤s10中针对剂贮存器31中所含的剂a确定的mic，而micb代表在步骤s10中针对相邻
剂贮存器33中所含的剂b确定的mic。因此，这些mic值是基于相应抑制终点61、63确定的。对应地，ca代表如在步骤s11中基于生长终点71确定的剂a和b的产生mic的混合物中的剂a的mic，而cb代表如在步骤s11中基于此生长终点71确定的剂a和b的产生mic的混合物中的剂b的mic。
[0070]
本发明可因此确定单个实验和细胞容器10中两种剂的组合的fici，因为本发明不仅提供混合物中剂的mic，而且还提供剂的单独mic，这也是为了确定剂组合的fici所需要的。
[0071]
图11是显示出在如图10所示的培养容器中测试的三种剂a、b和c的fici值的图表。fici值小于1代表协同效应。对于测试剂a和b的组合，可看到此种协同效应。fici值大约等于1表示相加效应，如剂b和c的组合所示。通常，fici值大于1表示拮抗效应。在本发明的实例中，剂a和c的组合实现了拮抗效应。临床相关的协同作用水平通常定义为fici值小于0.5(如此处所示的剂a与b之间)，并且临床相关的拮抗作用水平通常定义为fici值大于4(如此处所示的剂a与c之间)。
[0072]
在一个实施方案中，图13中的步骤s10包括针对至少两个相邻剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35，基于剂贮存器31、33、35中所含的剂相对于细胞培养基质50的扩散系数和抑制终点61、63、65确定剂贮存器31、33、35中所含的剂的mic。在此实施方案中，步骤s11包括针对至少两个相邻剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35，基于扩散系数和生长终点71、73、75确定至少两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的剂的混合物中剂贮存器31、33、35中所含的剂的mic。
[0073]
剂相对于细胞培养基质50的扩散系数可用于将细胞培养基质50中的距离转换为剂的浓度。如果假设剂的剂浓度梯度遵循fick扩散定律，则剂的浓度(c)可通过使用有限元模型(fem)求解无平流通量和无净体积源的对流扩散方程来计算。所述模型使用扩散系数(d)、扩散时间(t)和剂贮存器31、33、35中的限定点与细胞培养基质50中的任何给定点之间的距离(x)(即，对于某个函数f()，c＝f(d,t,x))来计算所述点的剂浓度。在测量到抑制终点61、63、65或生长终点71、73、75的距离时，剂贮存器31、33、35中用作参考点的限定点可以是剂贮存器31、33、35中或相对于所述剂贮存器的任何参考点，诸如剂贮存器31、33、35的中间或中心或剂贮存器31、33、35的边界。
[0074]
剂的扩散系数通常取决于所使用的特定细胞培养基质50。这意味着给定剂在使用第一细胞培养基质时可具有第一扩散系数，而在使用不同的第二细胞培养基质时可具有不同的第二扩散系数。
[0075]
可在扩散校准中针对细胞培养基质确定剂的扩散系数。此种扩散校准包括将细胞培养基质50添加到培养容器10中，所述培养容器包括n个剂贮存器31、33、35，其包含相应不同浓度的剂。例如，可将细胞培养基质凝胶添加到培养容器10中并使其固化成细胞培养基质50。扩散校准还包括将测试细胞群体55放置在细胞培养基质50上和/或其中，并且在细胞培养基质50上和/或其中培养测试细胞群体55预定时间段，同时n个剂贮存器31、33、35中的剂扩散通过细胞培养基质50。这些步骤基本上对应于图12中所示的步骤s1和s2，但不同之处在于每个剂贮存器31、33、35包含的剂相同但优选具有不同的浓度。在扩散校准中使用不同浓度的剂意味着即使特定剂快速扩散通过细胞培养基质50，也会有可读的结果。用于扩散校准中的测试细胞群体55具有已知的剂的mic。
[0076]
扩散校准还包括针对n个剂贮存器31、33、35中的至少一个剂贮存器31、33、35确定基本上没有任何测试细胞群体55的生长的抑制区60、62、64的抑制终点61、63、65。抑制终点61、63、65定位在剂贮存器31、33、35外边界的外围。这个步骤基本上对应于图12中的步骤s3。
[0077]
扩散校准还包括基于抑制终点61、63、65和剂相对于测试细胞群体55的mic确定剂相对于细胞培养基质50的扩散系数。
[0078]
因此，抑制终点区60、62、63的抑制终点61、63、65具有对应于，即基本上等于剂相对于测试细胞群体55的mic的剂浓度。然后可使用前面提到的方程c＝f(d,x)计算扩散系数(d)，方法是将c设置为等于已知mic，并将x设置为等于抑制终点61、63、65与剂贮存器31、33、35中的限定点之间的距离。
[0079]
用于扩散校准中的测试细胞群体55可以是具有已知的剂的mic并且可在细胞培养基质50上和/或其中培养的任何细胞群体。
[0080]
扩散校准可在进行用于确定剂相互作用效应的方法之前作为单独的过程进行。或者，可进行一次扩散校准，然后存储所述信息以供以后在进行用于确定剂相互作用效应的方法时使用。因此，在所述方法中使用的扩散系数可从表或列表中检索，并且先前可能已经例如使用上述扩散校准确定。
[0081]
将细胞群体55在细胞培养基质50上和/或其中培养预定时间段。选择这个时间段以使细胞能够在细胞培养基质50上和/或其中生长，并使剂贮存器31、33、35中所含的剂扩散到细胞培养基质50中并形成剂浓度梯度。
[0082]
所述时间段不应太长，因为在这种情况下，最终剂可能会接着扩散到细胞培养基质50中以在细胞培养基质50中形成基本上均匀的剂浓度，从而不再形成任何剂浓度梯度。此外，所述时间段不应太短，因为那时剂浓度梯度没有时间在细胞培养基质50中建立，并且细胞群体55可能没有足够的时间在细胞培养基质50上和/或其中生长。
[0083]
在一个实施方案中，预定时间段是基于剂贮存器31、33、35中所含的剂的扩散系数并且优选基于细胞群体55的细胞分裂时间来选择的。在一个典型的实施方案中，在6小时至36小时的区间内，优选在8小时至32小时的区间内，并且更优选在10小时至30小时的区间内选择预定时间段。当前优选的时间段为12小时至24小时。因此，在一个典型的实施方案中，将细胞群体55在细胞培养基质50上和/或其中培养过夜。
[0084]
在一个实施方案中，所述方法包括如图14所示的另外的步骤s20。此步骤s20包括将与凝胶混合的剂添加到n个剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35中，并且使凝胶固化成包含剂的塞。
[0085]
在此实施方案中，每个剂贮存器31、33、35因此在图12的步骤s1中添加细胞培养基质或细胞培养基质凝胶之前含有包含剂的塞。剂与之混合的凝胶可以是步骤s1中添加的细胞培养基质凝胶或可固化成包含剂的塞的另一种凝胶。然而，一旦在培养容器10中形成，此种包含剂的塞中的剂应该能够从包含剂的塞扩散到细胞培养基质50中。
[0086]
图15说明了在剂贮存器31、33、35中提供剂的另一个实施方案。在此实施方案中，n个剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35包含呈冻干或干燥形式的剂。在这种情况下，在步骤s21中将凝胶添加到n个剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35中。然后将剂溶解或分散到凝胶中，并使凝胶固化成包含剂的塞。
[0087]
步骤s21可与图12中的步骤s1分开或一起进行。在前一种情况下，首先将凝胶添加到剂贮存器31、33、35中并使其固化成包含剂的塞。在这种情况下，凝胶可以是在步骤s1中添加的细胞培养基质凝胶或可固化成包含剂的塞的另一种凝胶。在后一种情况下，包含剂的塞是剂贮存器31、33、35中存在的细胞培养基质50的部分。通常优选的是，当使用含冻干剂或干燥剂的剂贮存器31、33、35时，首先在步骤s21中在剂贮存器31、33、35中形成包含剂的塞，然后在步骤s1中作为单独的步骤添加细胞培养基质或细胞培养基质凝胶，以获得剂在凝胶中的良好溶解或分散以及具有至少基本上均匀和确定的剂浓度的包含剂的塞。
[0088]
在一个实施方案中，图12的步骤s1包括将预定体积的细胞培养基质凝胶添加到培养容器10中以覆盖n个剂贮存器31、33、35并且使细胞培养基质凝胶固化成细胞培养基质50。因此，应将足够体积的细胞培养基质凝胶添加到培养容器10中以形成覆盖剂贮存器31、33、35的细胞培养基质50。
[0089]
作为一个说明性实例，25ml的预定体积可用于标准90mm皮氏培养皿。对于其他培养容器10，优选计算覆盖培养容器插入物20的预定体积。在特定实例中，培养容器插入物20应该被优选为至少2mm但优选不超过10mm的高度覆盖。
[0090]
当将细胞群体放置在细胞培养基质50的表面51上并在细胞培养基质50的表面51上培养细胞群体55时，具有预定体积的细胞培养基质凝胶是特别有利的。在这种情况下，剂将扩散通过细胞培养基质50，并且在组合区域41、43、45内沿着细胞培养基质50的表面51形成至少部分重叠的剂浓度，并在剂贮存器31、33、35的外边界外围沿着细胞培养基质50的表面51形成基本上不重叠的剂浓度梯度。
[0091]
这种预定体积的细胞培养基质凝胶优选也用于上述扩散校准中。
[0092]
细胞培养基质凝胶的预定体积至少部分取决于培养容器10的体积。
[0093]
在一个实施方案中，图12中的步骤s3包括针对n个剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35确定抑制区60、62、64的抑制终点61、63、65。在此实施方案中，步骤s4包括针对n个剂贮存器31、33、35中的两个相邻剂贮存器31、33、35的每种组合，确定生长区70、72、74在具有两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的剂的至少部分重叠的剂浓度梯度的组合区域41、43、45内的生长终点71、73、75。在此实施方案中，步骤s5包括针对两个相邻剂贮存器31、33、35的每种组合，基于针对两个相邻剂贮存器31、33、35确定的抑制终点61、63、65和针对两个相邻剂贮存器31、33、35确定的生长终点71、73、75来确定两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的剂之间的剂相互作用效应。
[0094]
因此，在此实施方案中，确定了n个抑制终点61、63、65和n个生长终点71、73、75，并针对每对相邻剂贮存器31、33、35及其中所含的剂确定了剂相互作用效应。例如，如图1、图2、图9和图10所示的包括含有剂a、b和c的三个剂贮存器31、33、35的培养容器10可用于确定剂a与b之间、剂a与c之间以及剂b与c之间的剂相互作用效应。
[0095]
在一个实施方案中，n个剂贮存器31、33、35沿图1所示的圆的圆周布置在相对于彼此的预定位置处。在此种实施方案中，抑制终点61、63、65沿着穿过圆的中心15和剂贮存器31、33、35的轴线80定位，并且定位在沿轴线80的位于剂贮存器31、33、35的外边界外围的位置处。
[0096]
因此，在此种实施方案中，抑制终点61、63、65相对于圆的中心15并且沿着穿过剂贮存器31、33、35的半径径向定位。
[0097]
如图2、图9和图10所示的培养容器10包括在培养容器插入物20中的三个剂贮存器31、33、35，即，参数n为三。然而，实施方案不限于此，而是还涵盖使用超过三个剂贮存器31、33、35、37、39，如图4至图6和图8所示。如果培养容器10包括超过三个剂贮存器31、33、35、37、39，则一般而言，非相邻剂贮存器的浓度梯度通常会在培养容器插入物20的中间重叠，从而导致为了确定任何剂相互作用效应的更复杂的计算。
[0098]
因此，在优选实施方案中，参数n为三，从而允许在单个实验中测试剂贮存器31、33、35中所含的所有剂组合的剂相互作用效应。
[0099]
在一个实施方案中，每个剂贮存器31、33、35被包围在与圆的圆周对齐的圆周壁24之间并且被弦杆壁21、23、25包围，如图1所示。在此种实施方案中，三个弦杆壁21、23、25围成三角形40。因此，在此种实施方案中，中心窗口或部分呈三角形40的形式。
[0100]
在优选实施方案中，每个剂贮存器31、33、35的体积相同，并且因此每个弦杆壁21、23、25具有相同的长度。在此种实施方案中，由三个弦杆壁21、23、25围成的三角形40是等边三角形40。然而，所述实施方案并不限于此。例如，由三个弦杆壁21、23、25围成的三角形40可以是等腰三角形40。在此种实施方案中，剂贮存器中的两个31、33可具有相同体积并且其弦杆壁21、23的长度相同，而剩余的剂贮存器35可具有不同体积并且其弦杆壁25的长度不同。在这种情况下，剂浓度梯度的分辨率对于不同剂和剂贮存器31、33、35将是不同的。
[0101]
在细胞培养基质50中和/或其上培养的细胞群体55可以是任何单个细胞群体或细胞混合物。作为说明性但非限制性的实例，细胞可以是例如细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、古细菌细胞、植物细胞、动物细胞，包括人细胞，诸如永生化细胞系、原代癌细胞和样品衍生的培养物。细胞也可以是噬菌体感染的细菌和病毒感染的真核细胞。例如，细胞群体55可从诸如取自患者的生物样品中获得。然后，生物样品可以是体液样品，诸如血液样品、血浆样品、血清样品、淋巴液样品、脑脊液样品或尿液样品，或身体组织样品，诸如活检样品，或从体液或组织样品中分离和任选纯化的细胞。
[0102]
本发明不仅可用于分离或纯化的细胞样品，而且实际上可用于针对组合细胞样品(即，包含两种或更多种不同类型或菌株的细胞的样品)中的一种或多种细胞确定剂相互作用效应，如实施例5所示。这意味着在根据本发明分析细胞之前放宽对任何细胞或菌株纯化步骤的需要。在优选的实施方案中，细胞混合物中的不同细胞或菌株优选在细胞培养基质上和/或其中可鉴别，并且特别是视觉上可鉴别。例如，如果混合物中的一种或多种细胞或菌株表达荧光蛋白，则可通过荧光测量或显微镜检查，或者如果混合物中的一种或多种细胞或菌株表达染料或比色标记等，则可通过比色测量或显微镜检查等，通过个别细胞的形状来鉴定和分离个别细胞或菌株，诸如杆状细菌细胞与具有一般圆形形状的球菌。
[0103]
本发明方法的典型应用是在确定抗微生物剂(诸如抗生素)组合对细菌群体的fici值的情形下。例如，细菌群体可来自罹患细菌感染的受试者的血液培养物或其他体液或组织样品。然后，所述方法可用于寻找有效抑制细菌群体生长并因此可施用于受试者以对抗细菌感染的抗微生物剂的合适组合。
[0104]
在此种特定实施方案中，并且在使用如图1、图2、图9和图10所示的细胞容器10的情况下，图12中的步骤s1包括将细胞培养基质凝胶添加到培养容器10中并且使细胞培养基质凝胶固化成细胞培养基质50，所述培养容器包括在相对于彼此的预定位置处的三个剂贮存器31、33、35。在这个特定实施方案中，三个剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、
35包含抗微生物剂。步骤s2包括将细菌群体55放置在细胞培养基质50上和/或其中，优选在细胞培养基质50的表面51上，并且在细胞培养基质50上和/或其中，优选在细胞培养基质50的表面51上培养细菌群体55预定时间段，优选在12小时至24小时的区间内选择，同时三个剂贮存器31、33、35中的抗微生物剂扩散通过细胞培养基质50，并且在组合区域41、43、45内的细胞培养基质50中形成至少部分重叠的剂浓度梯度，并在三个剂贮存器31、33、35的外边界外围的细胞培养基质50中形成基本上不重叠的剂浓度梯度。步骤s3包括针对每个剂贮存器31、33、35确定基本上没有任何细菌群体55的生长的抑制区60、62、64的抑制终点61、63、65。在此实施方案中，抑制区60、62、64的终点61、63、65沿着穿过圆的中心15和剂贮存器31、33、35的轴线80定位，并且定位在沿轴线80的位于剂贮存器31、33、35的外边界外围的位置处。步骤s4包括针对两个相邻剂贮存器31、33、35的每种组合确定包括细菌群体55的生长的生长区70、72、74在具有两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的抗微生物剂的至少部分重叠的剂浓度梯度的组合区域41、43、45内的生长终点71、73、75。
[0105]
在这个特定实施方案中，所述方法还包括如图13所示的步骤s10和s11。在这种情况下，步骤s10包括针对每个剂贮存器31、33、35，基于抑制终点61、63、65和剂贮存器31、33、35中所含的抗微生物剂相对于细胞培养基质50的扩散系数确定剂贮存器31、33、35中所含的抗微生物剂相对于细菌群体55的mic。步骤s11包括针对两个相邻剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35，基于生长终点71、73、75和扩散系数确定两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的剂的混合物中剂贮存器31、33、35中所含的抗微生物剂的mic。
[0106]
所述方法然后包括在步骤s5中基于mic确定fici。
[0107]
本发明还涉及一种培养容器插入物20，其可在用于确定对细胞群体的剂相互作用效应的方法中使用。在一个实施方案中，培养容器插入物20包括圆形底板22，所述圆形底板具有中心n边形开口40，优选中心等边n边形开口40。在一个实施方案中，培养容器插入物20包括圆形壁24，所述圆形壁附接到圆形底板22的圆周。在此实施方案中，细胞培养基质20还包括n个弦杆壁21、23、25，所述弦杆壁附接到圆形壁24和圆形底板22并包围中心n边形开口40。圆形底板22、圆形壁24和每个弦杆壁21、23、25限定剂贮存器31、33、35，并且n为等于或大于三的整数。
[0108]
在一个实施方案中，圆形底板22包括存在于至少一个剂贮存器31、33、35内的至少一个标识符32、34、36。图1说明了此类标识符32、34、36。如果至少一个剂贮存器31、33、35包括此种标识符32、34、36，则通常就足够了，因为剩余的剂贮存器31、33、35可然后根据其相对于这个剂贮存器31、33、35的预定位置来鉴定。然而，在优选实施方案中，每个剂贮存器31、33、35包括相应标识符32、34、36，如图1所示。标识符32、34、36可以是底板22中的任何标识符，诸如字母、数字或其他标记。
[0109]
细胞培养插入物20可由各种材料制成，包括但不限于聚合物、塑料、金属(包括金属合金)、玻璃和陶瓷。所述材料应该对要包含在剂贮存器31、33、35中的剂是惰性的，即不应该与剂反应。所述材料还应该优选能够诸如通过高压灭菌、化学灭菌和/或辐射灭菌进行灭菌。
[0110]
细胞培养插入物20可以是一次性的，从而在使用后丢弃。或者，细胞培养插入物20可重复使用，从而在清洁和灭菌后的几个实验中使用。
[0111]
塑料的非限制性但说明性的实例包括传统上用于细胞培养中的塑料，例如聚苯乙
烯(ps)、聚丙烯(pp)、聚氯乙烯(pvc)、聚乙烯(pe)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚醚醚酮(peek)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、尼龙聚酰胺(pa)、聚碳酸酯(pc)、聚甲醛(pom)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚苯硫醚(pps)和它们的共聚物。
[0112]
金属的非限制性但说明性的实例包括钛、铝、铜、锌和锰以及它们的合金和钢。
[0113]
陶瓷的非限制性但说明性的实例包括碳和硅基结晶和非结晶陶瓷。
[0114]
细胞培养插入物20可使用各种制造工艺制造，包括但不限于3d打印、模制、机械加工、铸造和雕刻。
[0115]
在一个实施方案中，细胞培养插入物20由光学透明或至少光学半透明的材料制成。
[0116]
本发明还涉及培养容器10，其包括底盘12和附接到底盘12的圆周壁14，如图2所例示。培养容器10还包括根据本发明的培养容器插入物20，所述培养容器插入物定位在培养容器10中，其中圆形底板22放置在底盘12上并且圆形壁24与圆周壁14隔开。
[0117]
在此实施方案中，培养容器插入物20与培养容器10分开，并且被设计成放入培养容器10中，如图2所示。在此实施方案中，培养容器10可以是在其中放入培养容器插入物20的任何培养容器10，诸如细胞培养板或培养皿，诸如皮氏培养皿。培养容器10然后可包括一个如图2所示的培养容器插入物20，或者根据培养容器插入物20的大小(直径)相对于培养容器10的大小(直径)，多个(即至少两个)培养容器插入物20可定位在培养容器10中。
[0118]
至少一个培养容器插入物20定位成其圆形底板22放置在培养容器10的底盘12上，优选定位在底盘12的中心位置处。具体地说，培养容器插入物20应该定位在培养容器10中，使得在培养容器插入物20的圆形壁24与培养容器10的圆周壁14之间存在空间或距离。这为剂朝向圆周壁14外围扩散，从而在剂贮存器31、33、35的外边界外围形成基本上不重叠的剂浓度梯度提供了空间。
[0119]
在上述实施方案中，培养容器插入物20与培养容器10分开。图3说明了另一个实施方案，其中培养容器110和插入物作为单件。在此种实施方案中，培养容器110包括底盘112和附接到底盘112的圆周壁114。培养容器110还包括圆形壁124，所述圆形壁附接到底盘112并且被圆周壁114包围并与所述圆周壁隔开。培养容器110还包括n个弦杆壁121、123、125，所述弦杆壁附接到圆形壁124和底盘112并包围底盘112的n边形部分40，优选等边n边形部分40。在此实施方案中，底盘112、圆形壁124和每个弦杆壁121、123、125限定剂贮存器131、133、135，并且n为等于或大于三的整数。
[0120]
在一个实施方案中，底盘112包括存在于至少一个剂贮存器131、133、135内的至少一个标识符。
[0121]
如前所述，参数n优选为三，但也可以大于三，诸如四、五、六甚至更大。
[0122]
如图2所示的培养容器10或如图3所示的培养容器110可由如本文先前描述的用于培养容器插入物20的材料制成，诸如聚合物、塑料、金属(包括金属合金)、玻璃和陶瓷。
[0123]
在一个实施方案中，培养容器插入物20或培养容器110中的每个剂贮存器31、33、35；131、133、135包含由凝胶和剂的固化混合物制成的包含剂的塞。在此种实施方案中，每个包含剂的塞优选包含与其他包含剂的塞中的剂不同的剂。
[0124]
在另一个实施方案中，培养容器插入物20或培养容器110中的每个剂贮存器31、33、35；131、133、135包含呈冻干或干燥形式的剂。在此种实施方案中，每种冻干剂或干燥剂
优选不同于其他冻干剂或干燥剂。
[0125]
在这些实施方案中，培养容器插入物20或培养容器110预加载有呈冻干或干燥形式或呈包含剂的塞形式的剂。
[0126]
图4至图8示出了实施方案的替代培养容器插入物20。代替如图1所示的培养容器插入物20，这些培养容器插入物20然后可与培养容器10一起在用于确定剂相互作用效应的方法中使用。或者，图3的培养容器110可配备有如图4至图9中任一个布置和限定的剂贮存器31、33、35、37、39而不是如图3所示的剂贮存器131、133、135。
[0127]
图4说明了包括限定培养容器插入物20的外边界的矩形、优选方形的壁24的培养容器插入物20。培养容器插入物20还包括内接在方形壁24中的圆形壁26，即圆形壁26的直径优选等于方形壁24的边长。培养容器插入物20的圆形壁26、方形壁24和底板22限定四个剂贮存器31、33、35、37。圆形壁26包围中心圆形开口或窗口40。
[0128]
图5说明了包括限定培养容器插入物20的外边界的圆形壁24的培养容器插入物20的另一个实施方案。培养容器插入物20还包括由圆形壁24外接的方形壁26，即方形壁26的对角线优选等于圆形壁24的直径。培养容器插入物20的方形壁26、圆形壁24和底板22限定四个剂贮存器31、33、35、37。方形壁26包围中心方形开口或窗口40。
[0129]
图6说明了包括限定培养容器插入物20的外边界的圆形壁24的培养容器插入物20的另一个实施方案。培养容器插入物20还包括由圆形壁24外接的五边形壁26。培养容器插入物20的五边形壁26、圆形壁24和底板22限定五个剂贮存器31、33、35、37、39。五边形壁26包围中心五边形开口或窗口40。
[0130]
如图1、图5和图6所示的实施方案可被认为具有圆形壁24和由圆形壁24外接的n边形壁26。图1中n为三，即三角形，图5中n为四，即正方形，并且图6中n为五，即五边形。对于大于五的n值，这个概念可进一步扩展。
[0131]
图7说明了包括限定培养容器插入物20的外边界的三角形壁24的培养容器插入物20的一个实施方案。培养容器插入物20还包括三个壁21、23、25，其将三角形的区域分成三个剂贮存器31、33、35和一个中心窗口或开口40。在优选实施方案中，这三个壁21、23、25具有相同的长度，并且每个壁21、23、25优选平行于三角形壁24的侧边之一。培养容器插入物20的三个壁21、23、25、三角形壁24和底板22限定三个剂贮存器31、33、35。
[0132]
图8说明了包括限定培养容器插入物20的外边界的外矩形，优选方形的壁24的培养容器插入物20的另一个实施方案。培养容器插入物20还包括由外方形壁24外接的内矩形、优选方形的壁26，即内方形壁26的对角线优选等于外方形壁24的边长。培养容器插入物20的内方形壁26、外方形壁24和底板22限定四个剂贮存器31、33、35、37。内方形壁26包围中心方形开口或窗口40。
[0133]
本发明的另一个方面涉及一种用于确定对细胞群体55的剂相互作用效应的试剂盒。所述试剂盒包括根据实施方案中的任一个的培养容器10；110。所述试剂盒还包括一定体积的细胞培养基质凝胶，所述细胞培养基质凝胶被配置为添加到培养容器10；110中并使其固化成细胞培养基质50。n个剂贮存器31、33、35；131、133、135中的每个剂贮存器包含相应剂，并且n个剂贮存器31、33、35包围组合区域41、43、45。所述试剂盒还包括在将细胞群体55放置在细胞培养基质50中和/或其上，优选表面51上预定时间段之后拍摄细胞培养基质50，优选细胞培养基质50的表面51的至少一张照片的说明。n个剂贮存器31、33、35中的剂扩
散通过细胞培养基质50，并且在组合区域41、43、45内的细胞培养基质50中形成至少部分重叠的剂浓度梯度，并在n个剂贮存器31、33、35上的外边界外围的细胞培养基质50中形成基本上不重叠的剂浓度梯度。
[0134]
所述试剂盒还包括从所述至少一张照片并针对n个剂贮存器31、33、35；131、133、135中的每个剂贮存器31、33、35；131、133、135确定基本上没有任何细胞群体55的生长的抑制区60、62、64的抑制终点61、63、65的说明。抑制终点61、63、65定位在剂贮存器31、33、35；131、133、135的外围。所述试剂盒还包括从所述至少一张照片并针对n个剂贮存器31、33、35；131、133、135中的两个相邻剂贮存器31、33、35；131、133、135的每种组合确定细胞群体55的生长的生长区70、72、74在具有至少两个相邻剂贮存器31、33、35；131、133、135中所含的剂的至少部分重叠的剂浓度梯度的组合区域41、43、45内的生长终点71、73、75的说明。
[0135]
所述试剂盒包括定义n个剂贮存器31、33、35；131、133、135中所含的剂相对于细胞培养基质50的扩散系数的信息。所述试剂盒还包括针对两个相邻剂贮存器31、33、35；131、133、135的每种组合，基于针对两个相邻剂贮存器31、33、35；131、133、135确定的抑制终点61、63、65、针对两个相邻剂贮存器31、33、35；131、133、135确定的生长终点71、73、75和定义扩散系数的信息，确定两个相邻剂贮存器31、33、35；131、133、135中所含的剂之间的剂相互作用效应的说明。
[0136]
在特定实施方案中，所述试剂盒包括基于mic值确定fici值的说明，所述mic值是基于抑制终点61、63、65、生长终点71、73、75和如本文先前描述的定义扩散系数的信息确定的。
[0137]
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括n种剂和凝胶，所述凝胶将在n个剂贮存器中与n种剂混合并固化成相应的包含剂的塞。
[0138]
图16是根据实施方案的可用于确定剂相互作用效应的计算机200的示意性框图，所述计算机包括处理器210和存储器220。在此种实施方案中，剂相互作用效应的确定可在计算机程序240中实现，所述计算机程序被加载到存储器220中以供包括计算机200的一个或多个处理器210的处理电路执行。处理器210和存储器220彼此互连以实现正常的软件执行。输入和输出(i/o)单元230优选连接到处理器210和/或存储器220以使得能够从相机260接收图像数据。
[0139]
术语处理器应在一般意义上解释为能够执行程序代码或计算机程序指令以进行特定的处理、确定或计算任务的任何电路、系统或装置。包括一个或多个处理器210的处理电路因此被配置为在执行计算机程序240时进行明确定义的处理任务，诸如本文所述的那些。
[0140]
处理器210不必专用于仅执行上述步骤、功能、程序和/或块，还可以执行其他任务。
[0141]
在特定实施方案中，计算机程序240包括指令，当由至少一个处理器210执行时，所述指令使至少一个处理器210提供图像数据，所述图像数据图像数据表示在将细胞群体55放置在细胞培养基质50上和/或其中，优选细胞培养基质50的表面51上之后的预定时间段拍摄的培养容器10中细胞培养基质50的表面51的至少一张照片。培养容器10包括在相对于彼此的预定位置处的n个剂贮存器31、33、35。n个剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35包含一种剂，并且n个剂贮存器31、33、35包围组合区域41、43、45。n为等于或大于三的
整数。n个剂贮存器31、33、35中的剂扩散通过细胞培养基质50，并且在组合区域41、43、45内的细胞培养基质中形成至少部分重叠的剂浓度梯度，并在n个剂贮存器31、33、35上的外边界外围的细胞培养基质50中形成基本上不重叠的剂浓度梯度。所述指令还使至少一个处理器210基于图像数据并针对n个剂贮存器31、33、35中至少两个相邻剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35确定基本上没有任何细胞群体55的生长的抑制区60、62、64的抑制终点61、63、65。抑制终点61、63、65定位在剂贮存器31、33、35外边界的外围。所述指令进一步使至少一个处理器210基于图像数据并针对至少两个相邻剂贮存器31、33、35确定细胞群体55的生长的生长区70、72、74在具有至少两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的剂的至少部分重叠的剂浓度梯度的组合区域41、43、45内的生长终点71、73、75。所述指令另外使至少一个处理器210基于抑制终点61、63、65和生长终点71、73、75确定至少两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的剂之间的剂相互作用效应。
[0142]
在一个实施方案中，当由至少一个处理器210执行时，指令使至少一个处理器210基于图像数据并针对至少两个相邻剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35，基于抑制终点61、63、65确定剂贮存器31、33、35中所含的剂相对于细胞群体55的mic。在此实施方案中，所述指令还使至少一个处理器210基于图像数据并针对至少两个相邻剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35，基于生长终点71、73、75确定至少两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的剂的混合物中剂贮存器31、33、35中所含的剂的mic。所述指令进一步使所述至少一个处理器基于mic确定fici。
[0143]
在一个实施方案中，当由至少一个处理器210执行时，所述指令使至少一个处理器210基于图像数据并针对至少两个相邻剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35，基于剂贮存器31、33、35中所含的剂相对于细胞培养基质55的扩散系数和抑制终点61、63、65确定剂贮存器31、33、35中所含的剂的mic。在此实施方案中，所述指令使至少一个处理器210基于图像数据并针对至少两个相邻剂贮存器31、33、35中的每个剂贮存器31、33、35，基于扩散系数和生长终点71、73、75确定至少两个相邻剂贮存器31、33、35中所含的剂的混合物中剂贮存器31、33、35中所含的剂的mic。
[0144]
在一个实施方案中，当由至少一个处理器210执行时，所述指令使至少一个处理器210控制相机260拍摄在将细胞群体55放置在细胞培养基质50的表面51上之后的预定时间段拍摄的培养容器10中细胞培养基质50的表面55的至少一张照片。
[0145]
所提出的技术还提供了包括计算机程序240的计算机可读存储介质250。例如，软件或计算机程序240可被实现为计算机程序产品，其通常承载或存储在计算机可读介质250，特别是非易失性介质上。计算机可读介质250可包括一个或多个可移动或不可移动存储装置，包括但不限于只读存储器(rom)、随机存取存储器(ram)、光盘(cd)、数字多功能光盘(dvd)、蓝光光盘、通用串行总线(usb)存储器、硬盘驱动器(hdd)存储装置、闪存、磁带或任何其他常规存储装置。因此，计算机程序240可被加载到计算机的操作存储器220中以供其处理器210执行。
[0146]
实施例
[0147]
实施例1
–
combiant
tm
[0148]
在此实施例中，展现了一种用于测试抗生素协同作用的稳健且高度定量的测定。所述测定在本文中表示为combiant
tm
，是一种基于扩散的测定，其在此实施例中提供了在单
个琼脂板上的3种抗生素的所有成对相互作用的定量信息。技术验证研究表明，combiant
tm
的表现与棋盘方法同样出色，但由于其独特的设计和功能，提供了与盘扩散测试相当的大大降低的方法复杂性。与棋盘测定一样，combiant
tm
产生分数抑制浓度指数(fici)，但通量更高且更容易多路复用。可在没有样品敏感性的先前信息的情况下应用所述测定。combiant
tm
在抗生素相互作用筛选中的潜力通过将所述测定应用于组合疗法的新领域即尿路感染(uti)的治疗来展示。鉴定了保守和可变的抗生素相互作用，这表明个性化药物在精细组合疗法中具有很高的潜力。
[0149]
材料和方法
[0150]
制造和设计
[0151]
培养容器插入物采用计算机辅助设计软件(autodesk fusion 360)设计，并使用可高压灭菌或牙科树脂的专有配方通过3d打印(formlabs,somerville,ma；sla 3d打印机)制造。3d打印在乌普萨拉大学(uppsala university)的u-print设施中进行。
[0152]
菌株和培养基
[0153]
对于技术验证，使用了参考菌株大肠杆菌k12-mg1655(da5438)、铜绿假单胞菌pa14(da64160)和金黄色葡萄球菌atcc29213(da64485)。对于uti研究，我们筛选了6至295株独立来源的临床分离株，所述临床分离株对抗生素环丙沙星(cip)、磷霉素(fof)、美西林(mec)、呋喃妥因(nit)、甲氧苄啶(tmp)、氨苄青霉素(amp)、庆大霉素(gen)和头孢噻肟(ctx)敏感。通过在37℃下孵育，在mueller hinton琼脂上以及在mueller hinton肉汤(becton dickinson,sparks,md；参考275730,225250)中培养细菌。从1ml且在190rpm轨道振荡下的单个菌落制备过夜培养物。对于uti分离株筛选，琼脂补充有25mg/l葡萄糖-6-磷酸，因为这是fof作用所需要的。根据制造商的建议制备抗生素原液，并在-20℃下以等分试样形式储存以供单次使用：amp 100mg/ml或180mg/ml在水中(sigma-aldrich，参考a9518-25g)、cip 25mg/ml在0.1m hcl中(sigma-aldrich，参考17850-25g-f)、ctx 3mg/ml或50mg/ml在水中(sigma，参考c7039-1g)、gen 45mg/ml或50mg/ml在水中(sigma，参考48760-5g-f)、fof 50mg/ml在水中(sigma-aldrich，参考p5396-5g)、mec 10mg/ml在水中(sigma-aldrich，参考33447-100mg)、nit 10mg/ml在dmso中(sigma，参考n7878-10g)和tmp 10mg/ml在dmso中(sigma，参考t-7883-5g)。
[0154]
肉汤微量稀释
[0155]
为了校准combiant
tm
，我们使用符合eucast指南的标准肉汤微量稀释方法单独确定了抗生素的mic值。在96孔微量滴定板中制备mueller hinton肉汤中抗生素的两倍连续稀释。然后用来自密集过夜培养物的大约3
×
105个细胞(1:1000稀释度，180μl最终体积)接种板，并在37℃下不振荡孵育24h，在此之后通过移液混合孔并通过540nm处的光密度测量生长(thermo scientific，multiscan fc 357型)。在产生未接种对照孔的生长信号的最低浓度下检出mic。用两个生物学重复进行测量，并且其平均值被指定为mic。为了确定对fof的mic，培养基补充有50mg/l葡萄糖-6-磷酸，这是fof介导的抑制所需要的。
[0156]
输入浓度
[0157]
对于combiant
tm
测定的技术校准，基于抗生素针对所用菌株的mic确定抗生素浓度(表1)。在uti分离株的筛选中，对所有菌株使用两组抗生素浓度(图20c至图20j分离株见表2，图20a至图20c和图20m分离株见表3)。当已知抗生素的mic时，使用基于mic确定培养容器
插入物中的浓度是优选的，因为其会导致可读性最强的结果。对于fof测试，在最终琼脂层中以25mg/l的浓度提供葡萄糖-6-磷酸。
[0158]
表1
–
验证研究的抗生素输入浓度
[0159][0160]
表2
–
探索性研究的抗生素输入浓度
[0161][0162]
s＝易感
[0163]
表3
–
扩大筛选研究的抗生素输入浓度
[0164][0165]
棋盘实验
[0166]
用于fici确定的标准棋盘测定(8
×
8浓度)在单个生物重复中进行，并采用4
×
mic至1/4mic范围内的两倍连续稀释，如前所述[6]。接种量为5
×
105个细胞(0.5mcfarland)，并且在静态孵育16h后，在540nm处读取光密度(thermo scientific，multiscan fc 357型)。对于bliss模型协同作用量化，使用至多1
×
mic的线性浓度和3个生物重复获得更高分辨率的棋盘(9
×
9浓度)。处理位置完全随机化以避免边缘和梯度效应引起的偏差。如前所述[8]计算协同作用的程度。使用背景校正的光密度值相对于未处理的孔表示生长产量。根据
bliss独立模型[9]的预期相对生长y
1 2
通过将在单一抗生素治疗中获得的相对生长产量y1和y2相乘来计算。组合的协同作用的程度s定义为：s＝y
1 2
–y观察
。s＝0表示相加作用，正值表示协同作用，并且负值表示拮抗作用。
[0167]
物理扩散模型和图像分析
[0168]
有限元模型(fem)用于模拟试剂从贮存器中的扩散。假设扩散遵循fick扩散定律，并且通过求解无平流通量和无净体积源的对流-扩散方程计算剂浓度。使用comsol multiphysics(comsol,stockholm,sweden)进行fem分析、抗生素扩散建模和校准以及抗生素景观组装。所述算法使用matlab(mathworks,natick,ma)和comsol-matlab桥接器编写脚本。使用垂直安装的ccd数码相机(raspberry pi v2相机模块)拍摄combiant
tm
板。
[0169]
统计分析
[0170]
使用graph pad prism和matlab进行统计分析。使用wilcoxon符号秩检验评估测量的fici与相加模型(fici＝1)的统计差异。在uti筛选中，对显示出临床相关的抗生素相互作用水平(fici《0.5，fici》4)的相互作用进行了测试，以及对显示出具有临床协同作用或拮抗作用的分离株进行了针对fic＝1的单样本wilcoxon符号秩检验(表4和表5)。
[0171]
结果
[0172]
combiant
tm
测定和系统设计
[0173]
combiant
tm
测定被设计来满足以下标准：(i)产生抗生素相互作用的定量信息；(ii)减少测定复杂性和测定准备和分析的工作时间；(iii)高多路复用能力；和(iv)易于整合到临床微生物学实验室常规中。combiant
tm
测定是一种基于扩散的测定，其可提供在单个琼脂板上的3种抗生素的成对协同作用的定量信息。所述测定包括培养容器插入物(图1)，其可整合到任何标准细胞培养板中(图2)。可在同一细胞培养板上使用多个培养容器插入物。培养容器插入物包括3个抗生素的贮存器(在图1中标记为“a”、“b”和“c”)和一个中心三角形成像区域(图1)。
[0174]
为了运行combiant
tm
协同作用测定，通过移液将0.5ml含抗生素的琼脂加载到剂贮存器中。对于大多数应用，剂贮存器加载有不同的抗生素。琼脂固化后，测定进入非活性状态。此时，培养容器插入物可冷藏保存，至少一周不会失去功能。这允许根据用户的需要制备和储存涵盖不同抗生素的多种测定，使得可在不延迟的情况下轻松实施这些测定。
[0175]
为了实施特定的协同作用测试，将制备好的培养容器插入物放置在培养板中，并用最后的培养琼脂层覆盖，对于标准90mm板通常为25ml(图2)。这一步骤激活了测定，一旦板固化，所述测定就可使用了(图2)。最后的琼脂层允许悬浮在剂贮存器中的抗生素开始扩散到周围的琼脂区域和琼脂表面。通过用棉签划线将样品施加到固化板上。根据用于盘扩散测试的eucast指南v8.0，所述测定被设计用于0.5mcfarland的接种密度。接种后，将板孵育过夜以允许样品生长。此时，combiant
tm
板与标准琼脂板相同。所述特征使combiant
tm
测定能够无缝整合到任何实验室管理系统中，用于在板上进行过夜培养和细菌样品孵育。在生长过程中，根据三种抗生素的扩散产生的浓度景观，在培养容器插入物周围建立了抑制区(图10)。对于抗生素相互作用的测量，对板进行拍摄。使用提供定量协同作用测量的精选算法分析结果。
[0176]
药物相互作用的定量测量结果
[0177]
通过图像分析获得定量测量结果。培养容器插入物的具体几何形状及其与琼脂表
面的几何关系实现了抗生素的预先确定且受控的扩散。用有限元方法针对每种抗生素单独对受控扩散进行建模。所述模型产生了抗生素特异性扩散图。所述扩散图表示相对于剂贮存器中抗生素的初始浓度和抗生素的扩散系数，板表面的抗生素浓度。
[0178]
抗生素的扩散特性根据其结构和与扩散基质的相互作用而不同。在校准步骤中，可针对精确的测定条件(琼脂类型、培养体积、孵育时间)确定抗生素的扩散系数。对于校准，使用3种浓度的目标抗生素(10
×
、20
×
、40
×
mic)测试具有已知mic的参考菌株。对于每种潜在的抗生素，只需进行一次校准。之后，存储扩散图，以便在测试具体抗生素时应用。除了扩散系数之外，要在抗生素贮存器中使用的推荐初始浓度由一次性校准结果计算得出。表1至表3提供了本研究中使用的并且根据抗微生物药敏试验的eucast指南的8种抗生素的推荐初始浓度。
[0179]
分析算法使用校准的扩散图来生成虚拟琼脂表面。首先，用户指出在测定的每个剂贮存器中放置了哪种抗生素。此时，所述算法调用与测定中使用的抗生素对应的存储扩散图。所述算法将它们组装成特定于测定的抗生素景观。然后根据培养容器插入物的几何锚点将抗生素景观映射到图片上。根据分数抑制浓度指数(fici)的公式，从抑制区和生长区边缘的点对抗生素相互作用的程度进行量化，如下所述。
[0180]
在combiant
tm
琼脂板的图片中，可观察到某些感兴趣的区域(图9和图10)。在培养容器插入物的外部，每种抗生素都单独起作用。由于抗生素从剂贮存器向外扩散，因此与剂贮存器相对、远离剂贮存器的抑制区的点代表了所述抗生素单独作用时的抑制浓度(ic)。ic点(在图9中以点示出)与抗生素景观相匹配，并提取了3种抗生素的对应浓度(ica、icb和icc)。
[0181]
在成像区域内，三种抗生素已经从剂贮存器中扩散出来，并且现在在三个角落成对重叠。成像区域的每个角落都构成了两种最接近的抗生素一起作用的板的一部分。因此，成像区域中最接近角落的生长区的边缘对应于存在的两种抗生素的组合抑制生长的点(在图10中以点示出)。同样，对于三个ic点，三个组合抑制点(cp)与抗生素景观中的点相匹配，并提取了存在的两种抗生素的浓度。在提取了所有三种抗生素的单独ic和cp后，分析算法继续计算所有抗生素对的分数抑制浓度指数(fici)。对于抗生素a与b之间的相互作用，fici
ab
＝ca/ica cb/icb，其中ca和cb分别是a和b在其对应组合抑制点(cp)的浓度。fici
ac
和fici
bc
的计算方法类似。fici值为1表示相加作用。fici《1表示协同作用，而fici》1表示拮抗作用。临床相关的协同作用和拮抗作用水平的阈值通常分别设置为《0.5和》2-4。图片中所有ic和cp点的鉴定可自动或手动完成。之后，分析立即产生所有三个抗生素对的fici数据(如图11所示，来自图10中板的分析)。
[0182]
测定系统的技术验证
[0183]
首先，作为对照，我们进行了自身相互作用实验，其中3个培养容器插入物贮存器填充有同一种抗生素。对于此实施例中使用的所有抗生素，自身相互作用对照实验可靠地产生接近1的fici(图17)。接下来，为了验证combiant
tm
测定产生有效的协同作用量化，我们进行了准确度和精确度研究。我们针对一组4种抗生素测试了两种革兰氏阴性参考菌株大肠杆菌k12-mg1665和铜绿假单胞菌pa14以及革兰氏阳性金黄色葡萄球菌参考菌株atcc29213中的所有成对抗生素相互作用。所测试的抗生素，氨苄青霉素(amp)、头孢噻肟(ctx)、环丙沙星(cip)和庆大霉素(gen)，跨越三种不同的作用机制，并且通常用于治疗由
这些细菌物种引起的菌血症和败血症。计算所有6个成对相互作用和所有三种菌株的fici指数(图18a)。
[0184]
为了完全量化测定的精确度，使用combiant
tm
测定方案以多次重复(n》10)筛选菌株。一半的重复在同一天进行了测试，以量化重复性(日内变异性)。另一半在第二天进行了测试，以量化再现性(日间变异性)。为了比较几天之间的结果，我们选择量化相同抗生素组合的相对日间差异，然后对每种菌株的所有6种组合进行平均(图18b)。所有菌株的平均相对差异均低于13％，最高四分位数低于40％。这说明所述测定是可重复的，并且不受日间变异的影响。为了量化再现性，我们测量了平均值的相对标准误差，对所有抗生素组合使用同一天的重复。然后对每种菌株进行平均。所有相对标准误差均低于12％，最高四分位数低于15％。这表明重复之间的技术变异非常小(图18b)。最后，我们将所有重复合在一起，以得到涵盖重复性和再现性两者的精确度的整体评估。我们选择计算每个物种组合对的变异系数，分析表示测量的变异性与相互作用的平均值成比例(图18c)。所有变异系数均低于37％，并且平均为19.7％，这意味着所述方法足够精确，可复制和重复。
[0185]
接下来，我们着手量化combiant
tm
的准确度。为此，我们使用肉汤中棋盘测定的金标准方法复制了所有抗生素相互作用的测量结果，如前所述[6]。首先，我们想测试这两种方法是否系统地产生了不同的结果。因此，我们对使用这两种方法获得的fici数据进行了bland-altman分析(图18d)。bland-altman比较在棋盘与combiant
tm
测定之间产生了0.049的偏差。这种低水平的偏差接近fici差异的检测限。因此，我们得出结论，从这两种方法获得的结果之间没有统计学上可检测的差异。
[0186]
已经系统地证明这两种方法是可互换的，我们使用多元线性回归分析测试了选择一种方法而不是另一种方法的效应。局部抗生素对的同一性对所测量的fici值有强烈而显著的效应(相关系数＝0.55；p《0.01)。另一方面，方法的选择与实验结果没有统计学上的相关性(相关系数＝0.07；p＝0.83)。总之，我们得出结论，combiant
tm
在检测抗生素相互作用方面具有与棋盘测定相同的准确度。
[0187]
combiant
tm
与棋盘测定的不同之处在于，凭借扩散，combiant
tm
应用连续浓度范围，而棋盘通常测试离散的2倍稀释。因此，我们测试了combiant
tm
的高精确度是否是更精细浓度范围的结果。获得了针对所有18个菌株组合对的高分辨率线性浓度范围棋盘，为此我们使用bliss独立相加模型量化了抗生素相互作用。我们再次观察到抗生素相互作用与combiant
tm
结果的高度一致性。有趣的是，协同作用特征偶尔会显示出剂量依赖性性变异，在较低剂量下的协同作用特征与mic不同，使得相互作用更难分类。此类剂量依赖性变异没有被combiant
tm
检测到，因为其将相互作用分类为预先确定的高抑制水平。我们得出结论，combiant
tm
的精确度不仅取决于线性浓度范围，还取决于在设定的高抑制水平下的相互作用的量化。
[0188]
在临床uti大肠杆菌分离株上使用combiant
tm
测定的抗生素相互作用小组
[0189]
我们继续使用combiant
tm
测定来筛选针对大肠杆菌uti临床分离株和大肠杆菌k12-mg1655参考菌株的抗生素协同作用。选择了一组5种通常用作uti的单一或组合治疗的抗生素：呋喃妥因(nit)、甲氧苄啶(tmp)、美西林(mec)、环丙沙星(cip)和磷霉素(fof)。实施combiant
tm
测定以测量抗生素小组针对大肠杆菌菌株和大肠杆菌k12-mg1655参考菌株的所有成对相互作用(图19)。大多数大肠杆菌菌株被指定对小组中的所有抗生素敏感(图20a
至图20m)。根据之前的建议，将要被指定为显示出临床相关的正协同作用水平的相互作用的分类fici限制设置为fici《0.5。拮抗作用的保守限制设定为fici》4。所有中间值都被指定为描述相加作用。
[0190]
证明大多数组合在本质上是相加的，少数菌株显示出与所述特性不同，见表4和表5，如nit-cip(图20i)、mec-cip(图20d)、tmp-cip(图20g)、mec-fof(图20e)、tmp-fof(图20f)、nit-fof(图20h)、gen-ctx(图20k)和gen-ctx(图20m)所示，在所有测试菌株中都是相加的。fof-cip(图20j)在分离株da44560中表现出临界但统计学上显著的拮抗相互作用，但在所有其他菌株中表现出相加特性。对于剩余的组合，tmp-nit(图20b)、mec-tmp(图20a)、mec-nit(图20c)和amp-gen(图20k)获得了医学上更有趣的结果。在大多数uti分离株中检测到tmp-nit(图20b)和amp-ctx(图20l)组合的正协同作用，少数分离株展示出相加或拮抗特性，表明这些抗生素具有保守的协同相互作用性质，并且在uti分离株之间具有不同的遗传变异。另一方面，组合mec-nit(图20c)表现出强烈的拮抗特性，对于大多数测试的分离株都检测到所述特性。mec-tmp的组合(图20a)对于所有测试的分离株显示出正协同作用、强拮抗作用和相加作用的混合，而amp-gen的组合(图20k)显示出相加作用和不同程度的拮抗作用的混合。这些数据一起清楚地表明了一个物种内个例协同作用验证的价值。
[0191]
表4
–
对细菌菌株的显著影响
[0192]
[0193]
[0194]
[0195][0196]
n.a.
–
不适用
[0197]
y-是
[0198]
表5
–
对细菌菌株的显著影响
[0199]
[0200]
[0201]
[0202]
[0203]
[0204]
[0205][0206]
讨论
[0207]
在本研究中，我们展现并表征了combiant
tm
测定，其能够有效确定抗生素相互作用。广泛的技术验证表明准确度和精确度很高，并且与已建立的棋盘方法的整体性能相同。然后，我们实施了combiant
tm
以筛选大的临床uti分离株集合中的抗生素协同作用。发现一致的协同作用、中性相互作用和拮抗相互作用具有显著的菌株间变异。
[0208]
combiant
tm
方案专为简化和临床实施而设计。在非活性状态下，根据抗生素琼脂板的正常保质期，可大量冷藏储存。这使得医院和实验室在培养容器插入物中预加载感兴趣的抗生素，然后在需要时快速实施是可行的。从激活步骤开始，combiant
tm
板的处理与普通琼脂板的处理相同，并且因此与用于大规模处理琼脂板(包括用于大规模生产的自动倾倒琼脂)的现有临床管道兼容。
[0209]
为了让诊所和学术实验室都能最轻松地使用combiant
tm
，我们设计了两种不同的方案，一种用于临床使用的基于拮抗转效点的方案(表2和表3，以及应用于图20a至图20m中的uti筛选)，以及一种用于研究应用的更高灵敏度的基于mic的方案(表1，应用于图18a至图18d)。combiant
tm
的分析可完全自动化，并且只需要一张数字图片作为输入。不需要专用机器，使得combiant
tm
也适用于低资源环境。
[0210]
combiant
tm
的一个重要设计原则是抗生素协同作用是在临床相关的高浓度下量化的。协同作用是使用fici从抑制区的边缘即组合空间的mic等效线测量的。其他方法，诸如基于生长速率的方法，在较低的抑制水平下测量协同作用。在这些实验中，通过偏离相加模
型(bliss独立模型或loewe相加作用模型)在中等抑制范围内测量协同作用。已经证明，特定抗生素组合的相互作用特征可能是剂量依赖性的，有时会使棋盘的协同作用量化复杂化。这些生物学上有趣的案例表明了复杂的生理效应。fici的协同作用测量对此类变异是稳健的(或盲的)，因为其是在设定的高抑制水平(mic)下进行的，这在临床上更相关。与肉汤微量稀释法相比，基于板的combiant
tm
测定法的另一个技术差异是指抗生素对细胞形状的表型效应。作为其作用机制的一部分，许多抗生素会诱导细胞形状的变化。例如，β-内酰胺类抗生素在细胞死亡前诱导广泛的细胞伸长。这种伸长可导致通过光密度测量结果高估活细胞数目，例如导致肉汤和琼脂方法所检出的mic值不一致。
[0211]
在技术数据集中获得的结果与文献中的结果一致。combiant
tm
复制了先前报道的大肠杆菌k12-mg1655中amp-gen、tmp-mec和tmp-nit之间的协同作用；mec-nit之间的强拮抗作用以及β-内酰胺与cip之间的相加作用。然而，使用低抑制生长速率方法时，相加组合gen-cip先前被归类为协同的。先前仅对铜绿假单胞菌pa14菌株和金黄色葡萄球菌atcc29213中的少数抗生素相互作用进行了表征，从而限制了比较。先前报道了对于金黄色葡萄球菌的amp-cip相加作用，并且已知cip与β-内酰胺和氨基糖苷类gen的相互作用在铜绿假单胞菌中是拮抗的。combiant
tm
复制了这些观察结果。总之，观察到的我们的测量结果与文献的高度一致支持了combiant
tm
的准确度和实用性。
[0212]
由于上述临床uti分离株的协同作用筛选迭代，有一些案例(诸如tmp-mec之间的相互作用)将两种抗生素组合似乎在大多数菌株中具有一致的拮抗效应。诸如这些具有全面拮抗特性的案例说明，在设计组合疗法时需要明确的指导，即使是经验性的。鉴定应避免的此类抗生素组合将需要大规模的系统协同作用筛选。使用当前量化抗生素协同作用的方法时，这种规模的系统筛选是不可行的。然而，combiant
tm
提出了一种新的、劳动力成本更低的方法，其仍然能够获得可量化的结果。使用我们的新方法进行相互作用研究，可实现此类大规模的协同作用筛选。
[0213]
筛选tmp-nit、tmp-mec、mec-nit、amp-gen、amp-ctx和gen-ctx之间的相互作用揭示了一个重要结果，即相同的两种抗生素在同一物种的不同分离株中可能没有一致的协同作用特征。如果抗生素可针对一种菌株是协同的，但对另一种菌株是相加或拮抗的，则协同作用筛选应该成为微生物实验室标准测试的一部分。此类特性进一步说明了对诸如combiant
tm
的测定的需要。一种测定，其是定量的，但足够简单，不会保留给困难或长期的案例，而是作为标准筛选的一部分，所有案例都在微生物实验室接收。
[0214]
除了临床适用性之外，combiant
tm
作为生物学基础研究的工具具有很大的潜力。目前缺乏对大多数抗生素相互作用的机械理解。所述研究领域也远未对抗生素相互作用或抗生素与其他生物活性化合物相互作用进行进化理解。这些知识缺口可部分由当前协同作用测量方法的复杂性来解释。在uti分离株的筛选中，大多数抗生素相互作用是相加的。用mec-tmp和amp-gen观察到的可变协同作用特征表明有趣的生物菌株间变异。此外，mec-nit之间的高度拮抗相互作用可能表明这种药物相互作用的进化保守性，这意味着细胞功能模块之间的功能约束。拮抗作用可能通过细胞药物中的重叠和对组分药物的应激反应来解释。已经证明，β-内酰胺和nit都单独诱导细胞sos反应的表达以进行dna修复，这可能通过协调的更强防御反应来解释拮抗作用。然而，抗生素也诱导其他反应系统，即对于β-内酰胺的rpos介导的应激反应，以及在nit的情况下的氧化应激反应。因此，拮抗作用可替代地通
过这些进一步反应的潜在多效性来解释。总而言之，不同的解释是抗生素摄取机制减少或解毒增加。这些和其他假设可通过实施combiant
tm
进行功能遗传学筛选来有效地测试。
[0215]
实施例2
–
校准方案
[0216]
对于每种所测试的抗生素，都会选择合适的参考菌株。在此实施例中，所有校准均使用大肠杆菌菌株k12-mg1665进行。以下是校准方案的步骤：
[0217]
1.除非已知，否则使用肉汤微量稀释测定(bmd)确定抗生素针对参考菌株的mic。
[0218]
2.一式三份制备combiant
tm
测定。三个剂贮存器加载有mh琼脂中的10
×
mic、20
×
mic和40
×
mic抗生素浓度。
[0219]
3.按照combiant
tm
测定的方案，将最后的琼脂层倾倒在三个培养容器插入物上，并且在其固化后，根据方案接种参考菌株的种群。
[0220]
4.24小时后，如图9所示在插入物外侧形成抑制区。
[0221]
培养容器插入物外侧的浓缩区边缘对应于使用的抗生素针对菌株的mic。fem合作协调模型的扩散系数被迭代调整，直到所有三个抑制区边缘的预测浓度与bmd确定的实验值相匹配。一旦扩散系数的调整完成，将针对调整测定的两个剩余重复进行模型的测试。如果mic预测的变异性对于两个剩余测定小于实验变异性的10％，则校准完成。在扩散模型校准之后，所述抗生素可用于所有实验测定。推荐的初始抗生素浓度计算为导致抑制区大于5mm的浓度，以避免计算伪影。
[0222]
实施例3-combiant
tm
测定的方案
[0223]
1.使用管道外：制备combiant
tm
培养容器插入物。
[0224]
a.将combiant
tm
培养容器插入物放入无菌皮氏培养皿中；
[0225]
b.对于输入抗生素浓度，请参阅表1(基于mic的高分辨率测定)或表2或表3(基于转效点的确定)；
[0226]
c.将抗生素稀释至液体高压灭菌mh琼脂中的输入浓度(温度50℃-65℃)；
[0227]
d.将0.5ml抗生素琼脂添加到combiant
tm
培养容器插入物的指定剂贮存器中；
[0228]
e.添加皮氏培养皿盖并在水平表面上冷藏以允许琼脂凝固。在4℃下，将加载的培养容器插入物稳定至少一周。
[0229]
2.使用前：使目标菌株的密集过夜培养物从mh肉汤中的单个菌落中生长。
[0230]
3.使用中：通过用mh琼脂覆盖来激活combiant
tm
培养容器插入物。对于标准的90mm皮氏培养皿，添加25ml mh琼脂。
[0231]
4.让琼脂在室温下凝固至少3h。
[0232]
5.将密集的细菌培养物稀释至0.5mcfarland。
[0233]
6.根据用于盘扩散测试的eucast指南v8.0，使用无菌棉签在板表面接种细菌以获得菌苔生长。
[0234]
7.孵育板24h。
[0235]
8.拍摄板的照片并鉴定cp和ic点。
[0236]
9.将数据输入分析算法。
[0237]
实施例4
–
combiant
tm
不同的生物活性化合物
[0238]
在此实施例中，我们扩展了combiant
tm
测定的实用性，其中在四种不同的细菌物种上使用不同的生物活性化合物。
[0239]
材料和方法
[0240]
菌株和培养基
[0241]
大肠杆菌k12-mg1655(eco)、铜绿假单胞菌pa14(pae)、金黄色葡萄球菌atcc29213(sau)和需钠弧菌atcc14048(vna)菌株用于针对四种生物活性化合物：阿司匹林(asp)、苯甲酸(ba)、布洛芬(ibu)和茶树油(tto)。通过在37℃下孵育过夜，在mueller hinton琼脂上以及在mueller hinton肉汤(becton dickinson,sparks,md；参考275730,225250)中培养细菌。从1ml且在190rpm轨道振荡下的单个菌落制备过夜培养物。对于需钠弧菌，培养基补充有由204mm nacl、4.2mm kcl和23.14mm mgcl2组成的v2盐[10]。根据制造商的建议制备生物活性化合物原液，并在-20℃下以等分试样形式储存以供单次使用：阿司匹林400mg/ml在50％dmso中(sigma-aldrich，参考a2093-100g)、苯甲酸400mg/ml在dmso中(sigma-aldrich，参考242381-25g)和布洛芬664mg/ml在水中(sigma，参考i1892-100g)。茶树油作为从制造商处收到的100％油在室温下储存，直到需要(sigma-aldrich，参考w390208-sample-k)。
[0242]
肉汤微量稀释
[0243]
使用符合eucast指南的标准肉汤微量稀释方法单独确定生物活性化合物的mic值。在96孔微量滴定板中制备用于eco、pae和sau菌株的mueller hinton肉汤中每种生物活性化合物的两倍连续稀释。然后用来自密集过夜培养物的大约3
×
105个细胞(1:1000稀释，180μl最终体积)接种板，密封并在37℃下不振荡孵育24h。在产生未接种对照孔的视觉生长信号的最低浓度下检出mic。用三个生物学重复进行测量，并且其平均值被指定为mic。为了确定vna菌株的mic，培养基补充有这个细菌物种生长所需要的v2盐。
[0244]
输入浓度
[0245]
为了使用combiant
tm
测定确定自我相互作用，基于生物活性化合物针对所使用的四种菌株的mic确定插入物浓度(表6)。
[0246]
表6
–
生物活性化合物输入浓度
[0247][0248]
结果和讨论
[0249]
此实施例证明combiant
tm
也可用于评价抗生素以外的生物活性化合物(图21)。这
些化合物容易在琼脂培养基内扩散。增加浓度的化合物被放置在插入物中，导致观察到抑制区大小的差异，这可按照前面针对图9至图10的讨论进行量化。
[0250]
因此，combiant
tm
不仅限于研究抗生素之间的药物相互作用。原则上，任何生物活性化合物的单独和组合活性都可用combiant
tm
进行研究。combiant
tm
因此可用于例如研究化学治疗化合物对细胞(诸如人和动物细胞)的效应，并且也可用于环境微生物学中的应用。combiant
tm
的高度灵活性支持潜在的应用多样性，其可使用不同的培养基和不同的培养条件(诸如在不同温度下运行combiant
tm
)轻松实现。combiant
tm
也可应用于表征依赖于几种诱导物和阻遏物的生物活性，前提是所述活性可被光学追踪，例如荧光、比色法等。抗生素耐药性的传播越来越使组合疗法具有吸引力，但高病原体多样性表明个性化治疗的附加价值，这最佳地需要基于combiant
tm
测定的结果对治疗进行验证和优化。combiant
tm
可能有助于鉴定对于(通过其他分析方法)显现出广泛耐药性的分离株的组合治疗可能性。
[0251]
实施例5
–
combiant
tm
混合细菌样品
[0252]
在此实施例中，我们扩展了combiant
tm
测定的实用性，以处理混合细菌样品，并在两种组分的细菌通过不同的荧光标记区分时，在一次测试中推断出两组不同的fici。
[0253]
材料和方法
[0254]
菌株和培养基
[0255]
菌株mp026和tb191都是大肠杆菌k12-mg1655菌株的衍生物。mp026已被基因工程化成表达红色荧光蛋白(由mcherry基因编码)。这种菌株对抗生素氯霉素敏感。菌株mp026是来自博士(洛克菲勒大学(rockefeller university)，美国)的馈赠。tb191已被基因工程化成表达青色荧光蛋白(由cerulean基因编码)并对抗生素氯霉素(由cat基因编码)具有抗性。tb191是来自tobias bergmiller博士(埃克塞特大学(university of exeter)，英国)的馈赠。通过在37℃下孵育过夜，在mueller hinton琼脂上以及在mueller hinton肉汤(becton dickinson,sparks,md；参考275730,225250)中培养细菌。从1ml且在190rpm轨道振荡下的单个菌落制备过夜培养物。根据制造商的建议制备抗生素原液，并在-20℃下以等分试样形式储存以供单次使用：nit 10mg/ml在dmso中(sigma，参考n7878-10g)和tmp 10mg/ml在dmso中(sigma，参考t-7883-5g)；cam 12.5mg/ml在乙醇中(sigma，参考c0378-5g)。
[0256]
混合物测试
[0257]
mp026和tb191菌株中的每一个的稀释过夜培养物用作接种物，以应用于如先前在实施例1中描述的combiant
tm
测定。从过夜培养物中制备mp026和tb191菌株比例为1:1的混合物。过夜培养物的总密度为2
×
108cfu/ml。然后将这种混合物用作接种物以应用于如先前在实施例1中描述的combiant
tm
测定。基于mp026菌株针对所使用的三种抗生素的mic确定抗生素插入物浓度(表7)。
[0258]
表7
–
混合物研究的抗生素输入浓度
[0259]
[0260]
结果和讨论
[0261]
我们证明了combiant
tm
可用于混合细菌的样品。当混合物的组分细菌可通过荧光(图22)或颜色进行区分时，其单独fici值可在单次combiant
tm
测定中确定。表8示出了mp026和tb191的fici值。
[0262]
表8
–
来自在一个combiant测定中应用的细菌混合物的fici
[0263][0264]
在大多数细菌感染中观察到高病原体多样性，并且combiant
tm
可应用于未纯化的混合样品。省略菌株纯化步骤减少了确定哪种抗生素组合可有效用于治疗的总测定时间。预计combiant
tm
测定对于诊断以及制定和验证个性化治疗具有重要价值。当combiant
tm
应用于可通过例如荧光或颜色区分的样品时，可获得同一样品中不同细菌的多个fici。
[0265]
上文描述的实施方案应被理解为是本发明的几个说明性实例。本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可对实施方案做出各种修改、组合和变化。具体地说，在技术上可行的情况下，不同实施方案中的不同的部分解决方案可组合在其他配置中。
[0266]
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