一株能够抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶活性的凝结魏兹曼杆菌及其应用

一株能够抑制
α-葡萄糖苷酶和/或
α-淀粉酶活性的凝结魏兹曼杆菌及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株能够抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶活性的凝结魏兹曼杆菌及其应用。


背景技术：

2.糖尿病是一类因遗传或后天环境所引起的内分泌系统疾病疾病，并发症多、病情长且复杂，极大降低患者生活质量，给家庭、社会造成巨大经济负担，已经成为世界第三大损害人体健康的常见慢性病，因而，对糖尿病有效预防和治疗迫在眉睫。现有研究表明，消化酶中的α-葡萄糖苷酶有较高活性，可促进肠道对碳水化合物的消化吸收，使血浆中葡萄糖水平升高，通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可延缓对碳水化合物吸收，并增加胰岛素分泌，使糖尿病患者餐后血浆中葡萄糖维持在较低水平。因此，通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性可缓解糖尿病，对糖尿病有治疗作用，市面上大多糖尿病药物都属于该酶抑制剂；或通过对α-淀粉酶的抑制来阻断淀粉转化为糖类，从而降低血浆中葡萄糖水平，用于血糖的控制。如阿卡波糖，同时具有抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的功能。
3.近年来，随着科学界对益生菌研究的深入，益生菌在预防和治疗人类疾病中发挥着越来越大作用，潜力巨大。益生菌，指一类被宿主摄取足够量后，对宿主健康状况有改善作用的微生物。不少研究发现，益生菌、益生元或合生元等可对糖尿病患者的临床症状有明显的缓解作用。据文献报道，鼠李糖乳杆菌gg与双歧乳杆菌f-35的上清液均对α-葡萄糖苷酶的活性，有较好抑制效果，抑制率分别达到29.41％、21.82％。chen等同样发现鼠李糖ccfm0528在糖尿病小鼠的血糖耐受性有良好的改善作用，血糖降低约43％。此外，纳豆芽孢杆菌也证实具有优秀的降血糖效果。与化学药物疗法相比，益生菌安全性高、毒副作用小，生物疗法更具吸引力。
4.凝结魏兹曼杆菌(weizmannia coagulans)原为凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)已被重新命名，是目前研究最热门益生菌菌种之一，已有多篇文献报道了该菌种在预防或治疗多种人类疾病如非酒精性脂肪肝、便秘、肠易激综合征等具有积极作用。现有研究报道：凝结芽孢杆菌ja845的无细胞提取液对α-葡萄糖苷酶活性抑制率达到39.51％；同样，青岛蔚蓝生物股份有限公司的凝结芽孢杆菌vhprobi c08也具备突出降血糖效果，经6周灌胃，与阳性对照组相比，凝结芽孢杆菌预处理组小鼠空腹血糖水平降低了46.46％；但其效果均有待提高，而目前也未见能同时用于抑制α-葡萄糖苷酶活性和α-淀粉酶活性的凝结魏兹曼杆菌，为了提升抑制效率，亟需研发出更多的、具更好作用效果以及功能的凝结魏兹曼杆菌，能用于制备治疗或辅助治疗糖尿病以及来控制血糖的产品中具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一株能够抑制α-葡
萄糖苷酶和/或α-淀粉酶活性的凝结魏兹曼杆菌及其应用。
6.本发明的目的是提供一株凝结魏兹曼杆菌sa9菌株。
7.本发明另一目的是提供所述凝结魏兹曼杆菌sa9菌株的应用。
8.本发明再一目的是提供一种α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶抑制剂。
9.本发明又一目的是提供一种抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶的方法。
10.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
11.本发明提供一株能够抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶活性的凝结魏兹曼杆菌(weizmannia coagulans)sa9菌株，该菌株于2022年6月6日保存于广东省菌种保藏中心，保藏编号：gdmcc no:62517。sa9菌株分离自桑葚发酵残渣，具有较高产酸能力和清除dpph自由基能力；sa9菌株对引起血糖升高的关键酶α-葡萄糖苷酶有较高抑制作用，能达到糖尿病药物阿卡波糖的效率的80％以上，sa9菌悬液(发酵液)的抑制率为85％，菌体细胞代谢物抑制率为96％，无细胞提取液为87％；同时sa9菌株对α-淀粉酶也具有优异的抑制能力，其发酵液对α-淀粉酶的抑制率能达到100％，效果与阿卡波糖相似，但比阿卡波糖具有更好的安全性，无毒副作用。即sa9菌株能够高效抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，能通过抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性减少并阻断糖类的转化和吸收，利于血糖的控制、缓解糖尿病。
12.因此，本发明提供凝结魏兹曼杆菌sa9菌株和/或其发酵液在抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶、在制备α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶抑制剂、在制备缓解或治疗糖尿病产品或控制血糖产品中的应用。
13.优选地，所述产品为食品、保健品或药品。
14.本发明提供一种α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶抑制剂，含凝结魏兹曼杆菌sa9菌株和/或其发酵液。
15.优选地，所述发酵液为发酵上清液、无细胞提取液和/或菌体细胞代谢物。
16.优选地，所述发酵液的od为0.5～1.0。
17.优选地，所述发酵液中sa9菌株按1～5％的接种量接种到培养基中，于35～40℃、120～200r/min条件下震荡培养28～48h即得。
18.更优选地，所述发酵液中sa9菌株按1％的接种量接种到培养基中，于37℃、180r/min条件下震荡培养48h即得。
19.本发明提供一种抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶的方法，采用凝结魏兹曼杆菌sa9菌株和/或其发酵液对样品进行处理。
20.本发明具有以下有益效果：
21.本发明提供一株能够抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶活性的凝结魏兹曼杆菌(weizmannia coagulans)sa9菌株，sa9菌株具有较高产酸能力和清除dpph自由基能力，对引起血糖升高的关键酶α-葡萄糖苷酶有较高抑制作用，能达到糖尿病药物阿卡波糖的效率的80％以上，其中，sa9菌悬液(发酵液)对α-葡萄糖苷酶的抑制率为85％，菌体细胞代谢物抑制率为96％，无细胞提取液为87％。同时sa9菌株对α-淀粉酶也具有优异的抑制能力，其发酵液对α-淀粉酶的抑制率能达到100％，效果与阿卡波糖相当，但比阿卡波糖具有更好的安全性，无毒副作用。
22.本发明提供的sa9菌株能通过抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性减少并阻断糖类的转化和吸收，利于血糖的控制、缓解糖尿病，对糖尿病的预防与治疗有积极作用。此外，
凝结魏兹曼杆菌已经进入国家可食用益生菌名录，菌株安全性高，无毒副作用，抗逆性强。本发明凝结魏兹曼杆菌sa9可应用于发酵食品、保健品和药品中，为糖尿病患者日常血糖控制提供新的选择。
附图说明
23.图1为初筛不同菌株的产酸能力测定结果图；
24.图2为初筛不同菌株的和清除dpph自由基能力测定结果图；
25.图3为菌株系统发育树图；
26.图4为凝结魏兹曼杆菌菌体形态图；
27.图5为凝结魏兹曼杆菌对α-葡萄糖苷酶活性抑制率结果图；
28.图6为凝结魏兹曼杆菌对α-淀粉酶活性抑制实验结果图；
29.图7为凝结魏兹曼杆菌发酵上清液剂量梯度抑制实验结果图；(从左到右依次是原液、4倍稀释、8倍稀释)；
30.图8为凝结魏兹曼杆菌发酵液剂量梯度抑制实验结果图；(从左到右依次是原液、4倍稀释、8倍稀释)。
具体实施方式
31.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
32.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
33.以下实施例采用的培养基为：
34.mrs肉汤培养基：胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母膏粉4g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾(无水)2g、柠檬酸三铵(无水)、2g、三水乙酸钠5g、硫酸镁(含七水)0.2g、硫酸锰(含四水)0.05g、吐温-80 1g、最终ph 6.8
±
0.2。
35.实施例1菌株的筛选与鉴定
36.(1)菌株的分离纯化
37.采用市售的新鲜桑葚，冲洗干净后，装入发酵罐并加入不同浓度的糖水，进行自然发酵。发酵完成后称取适量的发酵残渣，加入含100ml mrs液体培养基的锥形瓶中，将其置于在37℃摇床中培养48h。然后，从中吸取1ml混合菌液用无菌水进行梯度稀释，在mrs平板上涂布10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
等五个稀释度。然后从平板上随机挑取不同单菌落在mrs固体平板上进行划线纯化。在37℃培养48h。得到的纯培养菌种用20％甘油冲洗，吸取到甘油管中，在-20℃冰箱保存备用。
38.(2)细菌的分子生物学鉴定
39.采用sds法对上述纯化后的细菌进行dna提取，使用通用引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-taccttgttacgactt-3')对细菌保守序列进行扩增。再将扩增产物送至测序公司进行测序，并将得到的序列进行拼接，拼接后的序列在ncbi数据库进行比对，得到22株凝结魏兹曼杆菌。经过产酸能力和清除dpph自由基能力测定的初步筛选后，其结果如图1和图2所示，综合确定了5株性能良好的凝结芽孢杆菌，分别命名
为：sa19、sa9、sa12、sa4、sa6。其5株菌株的系统发育树如图3所示。结果发现本发明菌株的16s rdna序列和与genbank中凝结魏兹曼杆菌(weizmannia coagulans)具有较高的同源性(注：由原来的凝结芽孢杆菌bacillus coagulans更改为凝结魏兹曼杆菌weizmannia coagulans，本发明则采用最新的拉丁文名称进行命名和保藏)。
40.(3)菌体形态观察
41.将上述纯化后的sa9菌株接种到mrs液体培养基中，37℃，培养48h。取少许菌液，使用革兰氏染色法进行菌体形态观察。结果如图4所示，菌体形态呈长杆状，革兰氏染色为阳性，呈紫色。
42.结合上述的分子生物学鉴定、菌体染色观察的结果，将本发明分离得到的具有较高产酸能力和清除dpph自由基能力的菌株sa9鉴定为凝结魏兹曼杆菌(weizmannia coagulans)，并于2022年6月6日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmcc no:62517，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
43.实施例2凝结魏兹曼杆菌sa9抑制α-葡萄糖苷酶活性实验
44.1、溶液配制
45.1u/ml的α-葡萄糖苷酶溶液：精密称取α-葡萄糖苷酶1mg，加入33ml pbs溶液配制成1u/mlα-葡萄糖苷酶溶液；
46.5mmol/l的对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)：精密称取pnpg 0.015g于50ml量瓶中，加入pbs溶液配制成5mmol/l pnpg溶液；
47.0.1mol/l na2co3溶液：精密称取无水na2co
3 0.53g，加蒸馏水溶解并定容至50ml，即得。
48.2、制备不同凝结魏兹曼杆菌
49.(1)菌株活化：采用实施例1中分离鉴定得到的sa9菌株，从-20℃冰箱取出菌株，以1％的接种量接种到试管中活化，活化两代后使用。
50.(2)制备发酵液(菌悬液)：取上述活化好的凝结魏兹曼杆菌sa9菌株发酵液按1％的接种量接种到100ml液体培养基中，37℃、180r/min条件下震荡培养48h，得到发酵液。
51.(3)制备发酵上清液：将上述制备的发酵液在4℃、6000r/min条件下离心l0min，收集上清液，利用0.22μm水系微滤膜过滤后即得发酵上清液样品，在4℃冷藏备用。
52.(4)制备菌体细胞代谢物(cfs)：将上述制备的发酵液在4℃、4000r/min条件下离心15min，收集菌体，无菌0.1mol/l pbs(ph＝6.8)洗涤2次后菌体重悬于pbs中，将菌液浓度调至od
600
为1.0，37℃、180r/min条件下震荡培养24h；在4℃、6000r/min条件下离心10min收集上清，利用0.22μm水系微滤膜过滤后即得菌体细胞代谢物，于4℃冷藏备用。
53.(5)制备无细胞提取液(cfe)：将上述制备的发酵液在4℃、4000r/min条件下离心15min，收集菌体，无菌0.1mol/l pbs(ph＝6.8)洗涤2次后菌体重悬于pbs中，将菌液浓度调至od
600
为1.0，按1.5mg/ml加入溶菌酶，于37℃反应3h后，在冰浴下超声破碎(功率800w，超声时间15min，工作2s，间歇2s)；将超声破碎液在4℃、6000r/min条件下离心15min，收集上清，利用0.22μm水系微滤膜过滤后得到无细胞提取液，于4℃冷藏备用。
54.3、样品制备
55.(1)样品组：采用上述制备得到的菌悬液(发酵液)、发酵上清液、菌体细胞代谢物、无细胞提取液，分别用移液器吸取50μl样品与pnpg 100μl混合，于37℃水浴10min，取出，然
后吸取α-葡萄糖苷酶溶液(1u/ml)100μl，在37℃下反应30min，取出，加入1ml碳酸钠(0.1m)，使反应停止。吸取100μl到96孔板在400nm处测定α-葡萄糖苷酶活性。
56.(2)样品空白组：将上述得到的样品取出，用移液器吸取50μl与pnpg100μl、pbs100μl混合，于37℃水浴10min，取出，然后吸取α-葡萄糖苷酶溶液(1u/ml)100μl，在37℃下反应40min，取出，加入1ml碳酸钠(0.1m)，使反应停止。吸取100μl到96孔板在400nm处测定α-葡萄糖苷酶活性。
57.(3)对照组：用移液器吸取50μlpbs与pnpg 100μl混合，于37℃水浴10min，取出，然后吸取α-葡萄糖苷酶溶液(1u/ml)100μl，在37℃下反应30min，取出，加入1ml碳酸钠(0.1m)，使反应停止。吸取100μl到96孔板在400nm处测定α-葡萄糖苷酶活性。
58.(4)空白组：用移液器吸取150μl pbs与pnpg 100μl混合，于37℃水浴40min，取出，加入1ml碳酸钠(0.1m)，使反应停止。吸取100μl到96孔板在400nm处测定α-葡萄糖苷酶活性。
59.(5)阿卡波糖组：用移液器吸取50μl与pnpg 100μl混合，于37℃水浴10min，取出，然后吸取α-葡萄糖苷酶溶液(1u/ml)100μl，在37℃下反应30min，取出，加入1ml碳酸钠(0.1m)，使反应停止。吸取100μl到96孔板在400nm处测定α-葡萄糖苷酶活性。
60.(6)不同实验组的参数与条件设置如下表所示，每组做三个平行试验：
[0061][0062]
(7)对α-葡萄糖苷酶的抑制率计算公式如下所示：
[0063][0064]
其中：ac：为对照组；
[0065]ab
：为空白组；
[0066]as
：为样品组；
[0067]asb
：为样品空白组。
[0068]
4、结果
[0069]
结果如图5所示，阿卡波糖阳性对照组的α-葡萄糖苷酶的抑制率菌为100％，凝结魏兹曼杆菌sa9菌悬液对α-葡萄糖苷酶的抑制率为85％，发酵上清液的抑制率为29％，菌体细胞代谢物的抑制率为96％、无细胞提取液的抑制率为87％。可见，凝结魏兹曼杆菌sa9不同成分均对α-葡萄糖苷酶有抑制作用。
[0070]
实施例3凝结魏兹曼杆菌sa9的α-淀粉酶实验
[0071]
1、样品准备
[0072]
(1)实验样品：sa9菌株的发酵液(菌悬液)、发酵上清液、菌体细胞代谢物、无细胞提取液，阿卡波糖组、pbs组的制备同实施例2，采用ph3.5、4.0的乳酸溶液配制。
[0073]
(2)淀粉培养基：准确称取6g可溶性淀粉、3g琼脂置于250ml锥形瓶中，灭菌备用。
[0074]
(3)α-淀粉酶溶液(1mg/l)：准确称取所需α-淀粉酶(猪胰脏中提取，购自于市场)5mg溶于5ml pbs缓冲液中，现配现用。
[0075]
2、实验方法
[0076]
将淀粉培养基倾倒少量到无菌平板中，凝固后，用镊子将牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm)放置培养基表面，再次将培养基倒入平板，约牛津杯2/3高度即可，凝固后取出牛津杯。每个平板放置3个牛津杯。分别取上述样品50μl和50μlα-淀粉酶溶液混合，加入到小孔中。其中，50μl pbs和50μlα-淀粉酶溶液混合为空白对照组；50μl mrs和50μlα-淀粉酶溶液混合为培养基阴性对照组；50μl乳酸和50μlα-淀粉酶溶液混合为酸度阴性对照组。置于37℃培养箱中培养24小时。取出，用稀碘液染色后观察，并使用游标卡尺测量透明圈大小。
[0077]
3、结果
[0078]
不同样品组与α-淀粉酶的抑效果如图6所示，阿卡波糖阳性组对α-淀粉酶的抑制率为100％，无透明圈产生，菌悬液组同样无透明圈产生；发酵上清液组的透明圈的直径为14.5；乳酸ph4.0阴性对照组透明圈直径为19.5mm、mrs对照组的透明圈直径20.4mm与空白pbs对照组透明圈直径为20.6mm，提示乳酸、mrs成分对α-淀粉酶不存在抑制作用，即发酵液的乳酸和培养基成分对实验结果不产生干扰。凝结魏兹曼杆菌sa9发酵液组对α-淀粉酶的抑制效果可与阿卡波糖相同，100％抑制了酶活，其发酵上清液的抑制率约50％。菌体细胞代谢物和无细胞提取液无明显效果。
[0079]
为了进一步说明发酵液组对α-淀粉酶抑制效果，对凝结魏兹曼杆菌的发酵液、发酵上清液做剂量梯度实验，采用二倍稀释法进行，结果如图7和图8所示，从左到右依次是原液、4倍稀释、8倍稀释，其上清液组透明圈直径依次为15.0mm、18.5mm、20.7mm；发酵液组的透明圈直径依次11.3mm、12.1mm、16.4mm；随着浓度的降低，其透明圈增大，边缘更为清晰，稀释8倍后的发酵上清液对α-淀粉酶的抑制率几乎为0，而发酵液稀释8倍后仍有50％的抑制率，表明凝结魏兹曼杆菌sa9及其发酵产物对α-淀粉酶的抑制具有剂量依赖性。
[0080]
综上可知，本发明提供的凝结魏兹曼杆菌sa9对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶都具有很好的抑制效果，能通过抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性减少并阻断糖类的转化和吸收，利于血糖的控制、缓解糖尿病，对糖尿病的预防与治疗有积极作用，能够应用于降低血糖水平的产品中。目前，凝结魏兹曼杆菌已被多个国家或地区列入可食用菌名录中，安全性高，且具有耐高温、产芽孢进而耐加工等特点，可促使凝结魏兹曼杆菌以多种多样的产品形式
呈现在糖尿病患者面前，给予他们更多的治疗选择，这无论在糖尿病患者血糖控制方面还是其保持健康良好的心理状态都有积极的意义，此外，凝结魏兹曼杆菌发酵条件简单、易于产业化、成本低，将是一株市场潜力巨大的益生菌株。
[0081]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。