一株具有解酒醒酒能力的植物乳植杆菌和应用

1.本发明属于微生物技术领域，尤其是一株具有解酒醒酒能力的植物乳植杆菌和应用。


背景技术：

2.益生菌是一种微生物补充剂，对人体具有其他正常生理菌群无法比拟的多种生理作用。它们可以改善肠道微生物的平衡。乳酸菌是益生菌中的最主要的种类，在发酵过程中添加乳酸菌不仅可以改善益生菌功能，还可以改善风味。植物乳植杆菌是一种革兰氏阳性细菌，广泛存在于食物、饲料、植物、脊椎动物和无脊椎动物以及人类相关的营养丰富的栖息地中。植物乳植杆菌因其在食品、生物技术和治疗中的应用而具有重要的经济意义。植物乳植杆菌是乳酸菌的重要成员，广泛分布于传统发酵食品中。由于它们的健康促进作用，越来越多的植物乳植杆菌菌株作为益生菌被广泛用作食品和膳食补充剂。
3.酒精中毒指人或动物由于过量饮用酒精而引起的饮酒者机体由一种神经中枢兴奋状态转变为抑制状态的症状，酗酒严重者通常可引起急性胃出血等症状，甚至死亡，对饮酒者身体伤害极大。近年来，随着人们物质生活水平的提高，人们对自身健康也日益重视起来，保健意识逐渐增强，因此解酒产品的需求也开始增加。解酒药物的作用核心不仅要降低人体内乙醇及其有害代谢产物的浓度，减轻其对各器官的损伤，而且还要调节由酒精代谢引起的人体内代谢紊乱。解酒可从延缓酒精的吸收、促进酒精代谢、对酒精代谢导致的体内代谢紊乱进行调节、清除自由基等方面进行。目前关于解酒药物主要集中在传统中药的复方及初提物方面，鲜有利用益生菌(乳酸菌)来进行解酒研究。
4.因此对具有解酒醒酒能力的益生菌的研究对解酒保健产品的研制开发并进一步对人类身体健康具有重要意义。
5.通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
6.1、植物乳杆菌lp45在制备缓解酒后机体损伤的食品中的应用(cn110192654a)，属于微生物的技术领域，对于缓解酒后造成机体不适及保护酒后肝脏健康具有非常广泛的应用前景。
7.2、一种产乙醛脱氢酶的植物乳杆菌及其应用(cn107760624a)，该植物乳杆菌命名为植物乳杆菌fcjx 102(lactobacillus plantarum fcjx 102)，已于2017年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2017340。植物乳杆菌fcjx 102(lactobacillus plantarum fcjx 102)优点在于，乙醇诱导下可高产乙醛脱氢酶，且在解酒护肝药品与食品方面的具有广阔的应用前景。
8.3、一株高抗氧化活性植物乳杆菌p101及其应用(cn114196593a)，本发明植物乳杆菌p101分离自江西省吉安市农家自制酸菜，其保藏编号为cctcc m 2021108。本发明植物乳杆菌p101具有良好的抑菌活性，能够显著抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等肠道致病菌的活性；具有较强的抗氧化活性，体外实验结果显示，植物乳杆菌p101对1,1二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)和羟基自由基的清除率均显著高于鼠李糖乳杆菌gg(lgg)，体内实验结果
显示，植物乳杆菌p101能有效减弱酒精诱导的氧化应激损伤，并抑制机体炎症反应。本发明植物乳杆菌p101在酸性或高胆盐环境中存活率显著高于植物乳杆菌zdy2013，此外，植物乳杆菌p101在缓解酒精诱导的脂肪性肝炎中效益突出。
9.上述专利公开文献主要体现在体外功能以及缓解长期酒精性肝损伤方面的研究，而本发明专利申请体现在一株具有解酒醒酒能力的植物乳植杆菌和应用，因此，通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株具有解酒醒酒能力的植物乳植杆菌和应用。
11.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
12.一株具有解酒醒酒能力的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)，所述植物乳植杆菌的名称为：ltj30，分类名称为：植物乳植杆菌，保藏编号为：cgmcc no.25371，保藏日期：2022年7月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
13.进一步地，所述植物乳植杆菌分离自白酒酒醅，是酒醅中的优势菌株。
14.进一步地，所述植物乳植杆菌的菌落及菌体特征为：在mrs培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径为0.8～1.0mm；光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈g

，菌体呈小短杆状。
15.进一步地，所述植物乳植杆菌在存在酒精的条件下培养后，能够对酒精产生降解作用。
16.进一步地，所述植物乳植杆菌经动物实验证明，在饮用高浓度白酒的前一小时服用，能够降低醉酒率，显著缩短醉酒时间、降低血清中乙醇含量，提高肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活力，具有显著的防醉酒和解酒促醒的功效。
17.进一步地，所述高浓度白酒为56％白酒。
18.如上所述的植物乳植杆菌在解酒方面中的应用。
19.如上所述的植物乳植杆菌在功能性食品、药品方面中的应用。
20.如上所述的植物乳植杆菌在制备解酒药品方面中的应用。
21.本发明取得的优点和积极效果为：
22.1、本发明植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)来源于传统的发酵食品白酒发酵过程中的酒醅，属于公认安全的可用于食品的菌种。本发明植物乳植杆菌具有降解酒精的能力，该菌株是白酒酒醅中的优势菌株，具有解酒醒酒的能力。
23.2、本发明的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)在含有酒精的条件下培养后，具有一定的降解酒精的能力。
24.3、本发明的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)经动物实验证明，在饮用高浓度白酒的前一小时服用，可降低醉酒率，显著缩短醉酒时间、降低血清中乙醇含量，提高肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活力，具有显著的防醉酒和解酒促醒的功效，可用于食品、医药等领域，如可用于开发相关功能性食品与药品(解酒产品)。
附图说明
25.图1为本发明中植物乳植杆菌cgmcc no.25371的菌落形态(左图)和细胞形态图(右图)；
26.图2为本发明中植物乳植杆菌cgmcc no.25371的16s rdna系统发育树图；
27.图3为本发明中植物乳植杆菌cgmcc no.25371在不同浓度酒精处理下可降解酒精的浓度。
具体实施方式
28.下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
29.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
30.一株具有解酒醒酒能力的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)，所述植物乳植杆菌的名称为：ltj30，分类名称为：植物乳植杆菌，保藏编号为：cgmcc no.25371，保藏日期：2022年7月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
31.较优地，所述植物乳植杆菌分离自白酒酒醅，是酒醅中的优势菌株。
32.较优地，所述植物乳植杆菌的菌落及菌体特征为：在mrs培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径为0.8～1.0mm；光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈g

，菌体呈小短杆状。
33.较优地，所述植物乳植杆菌在存在酒精的条件下培养后，能够对酒精产生降解作用。
34.较优地，所述植物乳植杆菌经动物实验证明，在饮用高浓度白酒的前一小时服用，能够降低醉酒率，显著缩短醉酒时间、降低血清中乙醇含量，提高肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活力，具有显著的防醉酒和解酒促醒的功效。
35.较优地，所述高浓度白酒为56％白酒。
36.如上所述的植物乳植杆菌在解酒方面中的应用。
37.如上所述的植物乳植杆菌在功能性食品、药品方面中的应用。
38.如上所述的植物乳植杆菌在制备解酒药品方面中的应用。
39.具体地，以下实施例分别从菌株的分离鉴定、在不同浓度酒精处理下降解酒精的能力、动物实验中菌株对急性酒精中毒小鼠的解酒作用等特性来说明本发明的技术方案，具体内容如下。
40.实施例1乳酸菌的分离鉴定
41.以下实验均在无菌条件下操作。
42.1.菌株的富集
43.称取白酒酿酒过程中的酒醅25g，加入225ml无菌生理盐水混匀，将得到的菌液稀释103～105倍后取100μl涂布于mrs平板上，于37℃条件下倒置培养24h，观察菌落生长状况。
44.所述的mrs固体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，吐温80 1ml，磷酸氢二钾2g，酵母浸粉4g，硫酸镁0.2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，琼
脂20g，蒸馏水1l，ph 6.2
±
0.2，121℃灭菌20min备用。
45.2.菌株的分离
46.挑取步骤1中得到的菌落，用革兰氏染色法进行镜检，观察菌体形态特征，选取革兰氏阳性菌作为目的菌株。
47.3.菌株的纯化
48.挑取步骤2中所得的菌落在mrs平板上进行划线，反复纯化直至无其他杂菌，记录不同菌落的状态。
49.4.菌株的鉴定
50.采用细菌基因组dna快速提取试剂盒提取乳酸菌菌株基因组，并以此为模板进行pcr扩增。将扩增成功的pcr产物测序后拼接得到dna序列，使用ncbi的blast检索系统对序列同源性进行比对分析。选择与其相似性最高的已知菌株，对其相似性进行分析。使用mega 5软件中的邻接法(neighbor-joining，nj)建立系统发育树。
51.对步骤3中获得的纯菌进行生理生化实验研究，发现该菌株具有一定的降解酒精的能力，该菌株在mrs培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径为0.8～1.0mm，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈g

，菌体呈小短杆状(如图1所示)。
52.用blast软件经同源性比较，结果见图2，结合菌落形态特征、细胞形态特征和16s rdna基因序列结果，确定为乳植杆菌属中的一株新的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)，该菌株已于2022年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc no.25371，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
53.实施例2植物乳植杆菌cgmcc no.25371在不同浓度酒精处理下的酒精降解能力
54.选取对数生长末期的菌株，以2％的接种量加入不同含量(体积分数为4％，6％，8％，10％，12％)酒精的mrs液体培养基中于37℃培养箱中进行酒精处理12h，同时以不含酒精的mrs培养基培养组作为阴性对照。酒精处理后利用重铬酸钾-硫酸法测定培养基中的乙醇残留量，计算已降解了的酒精浓度，分析各菌种的乙醇降解能力。
55.所述的mrs液体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，吐温80 1ml，磷酸氢二钾2g，酵母浸粉4g，硫酸镁0.2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，蒸馏水1l，ph 6.2
±
0.2，121℃灭菌20min备用。
56.对实施例1中获得的纯菌进行不同浓度酒精处理，随着酒精浓度的升高，植物乳植杆菌cgmcc no.25371的酒精降解能力基本呈下降趋势，在4％、6％、8％、10％、12％(体积分数)酒精处理下，其可降解酒精的浓度(体积分数)依次为2.27％、0.68％、0.70％、0.10％、0.33％，具有一定的酒精降解能力，尤其在低酒精浓度下具有较高的酒精降解能力(如图3所示)。
57.实施例3植物乳植杆菌cgmcc no.25371对急性酒精中毒小鼠的解酒作用
58.1.菌液制备
59.选取对数生长末期的菌株，以2％的接种量加入mrs液体培养基中于37℃培养箱中培养12h，5000r/min离心10min，菌体经无菌生理盐水洗涤两次，调整菌液浓度为10
10
cfu/ml，4℃保存备用。
60.2.实验动物
61.6周龄昆明雄性小鼠。饲养环境：动物饲养房温度保持在22～24℃，相对湿度40％～60％，定时通风换气，自然明暗周期12h(开灯8:00～20:00)。恒温恒湿，标准饲料，自由饮水。适应性饲养1周。
62.3.防醉试验
63.取72只雄性小鼠，随机分为4组，每组18只，4组分别命名为：正常对照组(nc)、模型组(m)、阳性对照组(pc)和植物乳植杆菌cgmcc no.25371组(l30)。在试验前先对小鼠禁食12h，然后按照5ml/kg的剂量分别给正常对照组、模型组、阳性对照组、植物乳植杆菌cgmcc no.25371组灌胃无菌生理盐水、无菌生理盐水、解酒药(海王金樽片)和菌悬液，除正常对照组外3组试验组要求均在灌胃无菌生理盐水、解酒药和菌悬液1h后按照13ml/kg剂量灌胃白酒(56％红星二锅头)，正常对照组以无菌生理盐水替代白酒。以小鼠的翻正反射消失、爬行不稳、后腹拖地、毛松散、转圈作为醉酒指标，以翻正反射恢复、活动自如、灵活、精神、毛滑顺为酒醒指标。观察灌胃白酒组小鼠的活动情况并记录小鼠醉酒数、死亡数、给酒时间、翻正反射消失时间和翻正反射恢复时间。醉酒潜伏期＝翻正反射消失时间－给酒时间；睡眠时间＝翻正反射恢复时间－翻正反射消失时间；醒酒时间＝翻正恢复时间－给酒时间。
64.4.小鼠血液乙醇浓度的测定
65.按上述防醉试验进行造模，各组小鼠造模后，于2.5h时间节点进行眼球采血，并将收集的血液置于37℃放置1h，4℃放置1h，于3000r/min离心10min，取上层血清，转移血清至1.5ml ep管。采用血乙醇测定试剂盒进行小鼠血液乙醇浓度的测定。
66.5.小鼠肝脏乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活性的测定
67.脱臼处死小鼠，剖腹，分离出肝组织，剪取肝脏右叶组织0.5g，置于4.5ml冰预冷的生理盐水中，匀浆机充分匀浆，制成10％肝组织匀浆液。采用乙醇脱氢酶测试盒和乙醛脱氢酶测试盒进行小鼠肝脏乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活性的测定。
68.表1植物乳植杆菌cgmcc no.25371对小鼠醉酒的影响
[0069][0070][0071]
由表1可以看出，植物乳植杆菌cgmcc no.25371对小鼠醉酒影响的研究发现，该菌可降低醉酒率，由83.33％降至66.67％。
[0072]
表2植物乳植杆菌cgmcc no.25371对小鼠的醉酒治疗效果
[0073] mpcl30醉酒潜伏期(min)19
±
1620
±
1830
±
29睡眠时间(min)283
±
42178
±
70*145
±
84**醒酒时间(min)302
±
35197
±
66*175
±
91**
[0074]
由表2可以看出，植物乳植杆菌cgmcc no.25371对小鼠的醉酒治疗效果研究发现，该菌延长了醉酒潜伏期，由19min延长至30min，显著缩短睡眠时间，由283min缩短至145min，显著缩短醒酒时间，总时间由302min缩短至175min，且醒酒效果优于解酒药组。
[0075]
表3植物乳植杆菌cgmcc no.25371对小鼠饮酒后2.5h血清中乙醇浓度的影响
[0076][0077]
由表3可以看出，植物乳植杆菌cgmcc no.25371对小鼠饮酒后2.5h血清中乙醇浓度的测定发现，该菌降低了小鼠血清中的乙醇含量，由1.86mg/ml降至1.50mg/ml。
[0078]
表4植物乳植杆菌cgmcc no.25371对小鼠饮酒后2.5h肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活性的影响
[0079][0080]
由表4可以看出，植物乳植杆菌cgmcc no.25371对小鼠饮酒后2.5h肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活性测定发现，该菌提高了肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活力，且乙醛脱氢酶活性显著提高，由24.73u/mg显著提高至34.21u/mg。
[0081]
实施例1中获得的纯菌经过动物实验，进行对急性酒精中毒小鼠解酒作用的研究。发现该菌具有较强的解酒醒酒能力，在饮用高浓度白酒的前一小时服用，可降低醉酒率，显著缩短醉酒时间、降低血清中乙醇含量，提高肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活力，具有显著的防醉酒和解酒促醒的功效。
[0082]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。